慢性腎臟病患者腎組織中Klotho基因啟動子羥甲基化水平觀察

王煥，張慧，崔凱，馮衍生

(1新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院，河南新鄉(xiāng)453000；2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院)

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慢性腎臟病患者腎組織中Klotho基因啟動子羥甲基化水平觀察

王煥1，張慧2，崔凱1，馮衍生2

(1新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院，河南新鄉(xiāng)453000；2新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院)

目的觀察慢性腎臟病(CKD)患者Klotho基因啟動子羥甲基化水平變化，并探討其與CKD臨床病理參數(shù)的關(guān)系。方法1～3期CKD患者58例，腎臟穿刺取腎臟組織(CKD組)；腎結(jié)核患者31例，取手術(shù)切除的正常腎臟組織(對照組)。將各組抽提的全基因組DNA分為兩份，一份以15 mmol/L高釕酸鉀、0.05 mol/L氫氧化鈉氧化后，進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化；另一份直接進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化。用特異引物進(jìn)行PCR擴增，焦磷酸測序，檢測羥甲基化并計算其在甲基化中所占比例。分析Klotho基因啟動子羥甲基化水平與CKD臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果對照組腎臟組織Klotho基因啟動子羥甲基化修飾；CKD組腎臟組織Klotho基因啟動子甲基化水平高于對照組，羥甲基化水平低于對照組(P均<0.05)。CKD患者Klotho基因啟動子羥甲基化水平與eGFR呈正相關(guān)關(guān)系，與腎小管間質(zhì)纖維化面積及肌酐水平呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論CKD患者腎臟組織中Klotho基因啟動子羥甲基化水平降低，并與CKD臨床病理參數(shù)有關(guān)。Klotho基因啟動子羥甲基化水平下降可能參與了CKD的發(fā)生發(fā)展。

慢性腎臟病；Klotho基因；基因啟動子；羥甲基化

慢性腎臟病(CKD)是指一類在各種致病因子影響下，以腎臟慢性纖維化為病理特征的臨床疾病的總稱，發(fā)病率較高[1]。由于CKD缺乏有效治療手段，最終導(dǎo)致腎功能逐漸惡化，進(jìn)展為終末期腎病需行腎臟替代治療，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。研究[2～5]表明，腎臟功能發(fā)生異常多伴隨Klotho表達(dá)下降。Klotho基因啟動子甲基化被證明與CKD有關(guān)。但對于Klotho基因啟動子甲基化水平是如何發(fā)生動態(tài)變化、其CpG島甲基化是否還存在其他種類修飾目前尚不清楚。近年研究較多的羥甲基化是一種以5甲基胞嘧啶(5mC)為基礎(chǔ)發(fā)生的氧化去甲基化修飾，被認(rèn)為是潛在的基因轉(zhuǎn)錄重新激活標(biāo)志。本研究觀察了CKD患者腎組織中Klotho啟動子羥甲基化水平，并探討其與CKD臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇2008年7月～2013年7月在新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院腎內(nèi)科行腎穿刺活檢的CKD患者共58例為CKD組，排除糖尿病、自身免疫疾病、腫瘤、乙型肝炎、丙型肝炎及曾使用激素或免疫抑制劑的患者。58例患者中，男28例、女30例，年齡(45.2±12.3)歲，膜性腎病20例、IgA腎病15例、局灶節(jié)段性腎小球硬化10例、新月體腎炎5例、高血壓腎小動脈硬化3例、腎小球輕微病變5例，按照eGFR進(jìn)行分期1期25例、2期18例、3期15例，腎活檢術(shù)中取病理組織。選擇腎結(jié)核患者31例為對照組，男15例、女16例，年齡(48.5±1.2)歲，取手術(shù)切除的正常腎臟組織。兩組性別、年齡資料有可比性。CKD組eGFR、肌酐水平、腎小管間質(zhì)纖維化面積與對照組相比，P均<0.05。見表1。

表1　兩組患者年齡、eGFR、肌酐及腎小管間質(zhì)纖維化面積比較±s)

注：與對照組相比，*P<0.05。

1.2腎組織中Klotho基因啟動子羥甲基化檢測抽提兩組腎臟組織總DNA 2 μg，分為兩組。氧化組進(jìn)行15 mmol/L高釕酸鉀、0.05 mol/L氫氧化鈉氧化(BSP)后，進(jìn)行亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化(oxBS)；未氧化組直接進(jìn)行oxBS[6]。oxBS后進(jìn)行PCR擴增，利用Pyro Mark Assay Design2.0軟件設(shè)計引物，上游引物序列為5′-GGGAGTTGGGAGAAATAGG-3′，下游引物序列為5′-CCAACAACACCAACAACA-3′，測序引物序列為5′-GGGAGAGGGGGTGGG-3′，產(chǎn)物長度351 bp。其中上游引物5′端進(jìn)行生物素標(biāo)記。擴增所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，進(jìn)行焦磷酸測序。氧化組中胞嘧啶會變成胸腺嘧啶，5mC不發(fā)生變化，5羥甲基化胞嘧啶(5hmC)會轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶；未氧化組中5mC、5hmC均不發(fā)生變化，據(jù)此可識別存在羥甲基化修飾的CpG位點。每個CpG位點的甲基化結(jié)果根據(jù)CpG對應(yīng)位點C/T百分比進(jìn)行分析。0代表胞嘧啶完全羥甲基化，100%代表胞嘧啶完全甲基化[7]。

1.3尿素氮、肌酐水平測定兩組清晨空腹抽取血樣，檢測血清尿素氮、肌酐。根據(jù)MDRD簡化公式計算eGFR[8]。

1.4腎小管間質(zhì)纖維化面積的測算將腎臟組織放于預(yù)先配好的固定液中進(jìn)行固定，再用低至高濃度酒精作脫水劑，逐漸脫去組織塊中的水分。再將組織置于透明劑二甲苯中透明，之后浸蠟包埋，在切片機上進(jìn)行切片，常規(guī)HE染色。病理結(jié)果根據(jù)盲法原則，由兩位病理醫(yī)師對腎小管萎縮和間質(zhì)纖維化占皮質(zhì)腎組織面積的百分比進(jìn)行評價。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計軟進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料比較采用方差分析；相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1各組腎組織中Klotho基因啟動子甲基化、羥甲基化水平CKD1、2、3組腎組織Klotho基因啟動子甲基化水平高于對照組，且Klotho基因啟動子大部分CpG位點甲基化水平隨著CKD分期增高逐漸升高。對照組腎組織中Klotho基因啟動子-81、-71、-63位點存在羥甲基化修飾；CKD組腎組織Klotho啟動子羥甲基化水平顯著降低，且隨著病情嚴(yán)重程度增加，羥甲基化水平逐漸下降，其中在CKD2、3組-81、-71、-63位點BSP與oxBS差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見表2)。

表2　各組腎組織Klotho基因啟動子-86～-51位點CpG島羥甲基化水平

2.2CKD患者Klotho啟動子羥甲基化率與臨床病理特征的相關(guān)性CKD患者整體羥甲基化水平與eGFR有關(guān)(F=276.035，P<0.01)，-81位點(R2=0.848，P<0.01)、-71位點(R2=0.885，P<0.01)、-63位點(R2=0.709，P<0.01)羥甲基化水平與eGFR均呈正相關(guān)關(guān)系；CKD患者整體羥甲基化水平與肌酐水平有關(guān)(F=26.796,P<0.01)，-81位點(R2=-0.773，P<0.01)、-71位點(R2=-0.782，P<0.01)、-63位點(R2=-0.728，P<0.01)羥甲基化水平與肌酐水平均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；CKD患者整體羥甲基化水平與腎小管間質(zhì)纖維化面積有關(guān)(F=124.285，P<0.01)，-81位點(R2=-0.887，P<0.01)、-71位點(R2=-0.884，P<0.01)、-63位點(R2=-0.827，P<0.01)羥甲基化水平與腎小管間質(zhì)纖維化面積均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

3　討論

5mC作為第五種堿基，是DNA水平最常見的表觀遺傳學(xué)修飾，其可被甲基化結(jié)合蛋白(MBP)特異性識別，招募轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合體，通過改變?nèi)旧w構(gòu)象等方式抑制RNA pol聚合酶對啟動子的結(jié)合，最終引起相應(yīng)基因沉默[9]。DNA的去甲基化有很多種方式[10～13]，其中由羥甲基化酶(TET)介導(dǎo)的羥甲基化修飾在合子形成初期的重編程、早期胚胎發(fā)育、干細(xì)胞自我更新和分化、腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移等過程中均發(fā)揮重要作用[14]。由于5hmC不被MBP識別，因此并不引起轉(zhuǎn)錄沉默，被普遍認(rèn)為是基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)重新激活的標(biāo)志。目前對5hmC的研究主要集中在全基因組水平，對單基因尤其是某個CpG島或CpG位點的研究很少。本研究采用oxBS結(jié)合常規(guī)BSP的方法，能夠在特定CpG位點水平有效識別并檢測羥甲基化修飾。

Klotho是一個抗衰老基因，其在腎臟、血漿及尿液中水平升高提示腎功能受到影響。此前已有研究表明Klotho基因啟動子甲基化與其表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)[2]。Klotho基因中存在一些甲基化狀態(tài)保持相對穩(wěn)定的CpG位點，其甲基化水平較高且并不隨腎功能異常而有明顯改變，通過對這些位點進(jìn)行oxBS分析，能夠反映羥甲基化修飾情況。本研究結(jié)果顯示，CKD組Klotho基因啟動子羥甲基化水平低于對照組，且隨著CKD分期增高而下調(diào)，提示Klotho基因啟動子羥甲基化水平下調(diào)參與了CKD的發(fā)生發(fā)展。由于BSP無法區(qū)分5mC和5hmC，以及5hmC的形成需要5mC作為底物，在低甲基化狀態(tài)中是不存在羥甲基化修飾的，因此可以解釋-81、-71、-63位點始終保持較高的甲基化狀態(tài)。

本研究結(jié)果還顯示，CKD患者Klotho基因啟動子羥甲基化水平與eGFR呈正相關(guān)關(guān)系，表明羥甲基化水平會隨著CKD進(jìn)展而下降，一旦腎功能出現(xiàn)障礙，羥甲基化水平變化幅度較整體甲基化水平變化更為敏感。我們還發(fā)現(xiàn)，Klotho基因羥甲基化水平與腎小管間質(zhì)纖維化面積及肌酐水平均呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示Klotho基因羥甲基化水平能在一定程度上反映CKD患者腎臟受損情況。

此前有研究認(rèn)為，CKD患者Klotho基因啟動子發(fā)生超甲基化，同時其表達(dá)受到抑制。這種超甲基化的形成一方面是通過對普通胞嘧啶進(jìn)行甲基化修飾并轉(zhuǎn)化成5mC，這種變化主要發(fā)生在無羥甲基化修飾的CpG位點；另一方面可能是抑制TET酶等功能，阻滯5hmC形成及其后的主動去甲基化過程，這種變化主要發(fā)生在有羥甲基化修飾的CpG位點。我們推測，在正常腎臟組織中，Klotho基因啟動子-81、-71、-63位點羥甲基化修飾同樣有利于Klotho基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，但為何羥甲基化修飾只出現(xiàn)在某些CpG位點，原因仍然未知。

總之，本研究證明正常腎組織Klotho基因啟動子上存在羥甲基化修飾，而CKD患者腎組織中Klotho基因啟動子羥甲基化修飾水平顯著下降。Klotho基因啟動子羥甲基化有望作為一種新的表觀遺傳學(xué)標(biāo)記用于CKD的早期診斷及病情評估。然而，由于腎穿刺活檢取材復(fù)雜，未來是否可以采用其他方法如外周血檢驗來代替腎穿刺活檢尚需進(jìn)一步研究。對于Klotho基因羥甲基化對CpG位點的偏好性、涉及到哪個TET成員參與羥甲基化修飾作用、治療后Klotho基因啟動子羥甲基化狀態(tài)如何變化，都有待于進(jìn)一步探索。

[1] 張路霞,王海燕.中國慢性腎臟病的現(xiàn)狀及挑戰(zhàn):來自中國慢性腎臟病流行病學(xué)調(diào)查的啟示[J].中華內(nèi)科雜志,2012,51(7):497-498.

[2] 陳靜,章曉燕,林靜,等.慢性腎臟病患者腎組織Klotho基因啟動子的超甲基化與臨床病理的相關(guān)性[J].中華腎臟病雜志,2013,29(7):481-486.

[3] Chen J, Zhang X, Zhang H, et al. Elevated Klotho promoter methylation is associated with severity of chronic kidney disease[J]. PLoS One, 2013,8(11):e79856.

[4] Doi S, Zou Y, Togao O, et al. Klotho inhibits transforming growth factor-beta 1(TGF-beta1) signaling and suppresses renal fibrosis and cancer metastasis in mice[J]. J Biol Chem, 2011,286(10):8655-8665.

[5] Sastre C, Rubio-Navarro A, Buendia I, et al. Hyperlipidemia-assocaited renal damage decreases Klotho expression in kidneys from ApoE knockout mice[J]. PLoS One, 2013,8(12):e83713.

[6] Booth MJ, Branco MR, Ficz G, et al. Quantitative sequencing of 5-Methylcytosine and 5-Hydroxymethylcytosine at single-base resolution[J]. Science, 2012,336(6083):934-937.

[7] Wang Y, Liu C, Guo QL, et al. Intrathecal 5-azacytidine inhibits global DNA methylation and methyl-CpG-binding protein 2 expression and alleviates neuropathic pain in rats following chronic constriction injury[J]. Brain Res, 1418(2011):64-69.

[8] Levey AS, Coresh J, Greene T, et al. Using standardized serum creatinine values in the modification of diet in renal disease study equation for estimating glomerular filtration rate[J]. Ann Intern Med, 2006,145(4):247-254.

[9] Fuks F. DNA methylation and histone modifications: teaming up to silence genes[J]. Curr Opin Genet Dev, 2005,15(5):490-495.

[10] Zhu B, Zheng Y, Angliker H, et al. 5-Methy15-Methylcytosine DNA glycosylase activity is also present in the human MBD4 (G/T mismatch glycosylase) and in a related avian sequence[J]. Nucleic Acids Res, 2000,28(21):4157-4165.

[11] Ma DK, Jang MH, Guo JU, et al. Neuronal activity-induced Gadd45bpromotes epigenetic DNA demethylation and adult neurogenesis[J]. Science, 2009,323(5917):1074-1077.

[12] Metivier R, Gallais R, Tiffoche C, et al. cyclical dna methylation of transcriptionally active promoter[J]. Nature, 2008,4527(7183):45-50.

[13] Tahiliani M, Koh KP, Shen Y, et al. Conversion of 5-Methylcytosine to 5-Hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1[J]. Science, 2009,324(5929):930-935.

[14] Shen L, Zhang Y. Enzymatic analysis of tet proteins key enzymes in the metabolism of DNA methylation[J]. Methods Enzymol, 2012,512:93-105.

馮衍生(E-mail: 47300725@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.15.034

R692

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1002-266X(2016)15-0089-03

2015-09-30)