藍莓葉多酚對魷魚上清液中甲醛生成相關自由基的影響

李穎暢,朱學文,白　楊,信維平,楊　玉,張　笑,勵建榮

(渤海大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121013;遼寧省食品安全重點實驗室,遼寧錦州 121013;生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心,遼寧錦州 121013)

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藍莓葉多酚對魷魚上清液中甲醛生成相關自由基的影響

李穎暢,朱學文,白楊,信維平,楊玉,張笑,勵建榮*

(渤海大學食品科學與工程學院,遼寧錦州 121013;遼寧省食品安全重點實驗室,遼寧錦州 121013;生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心,遼寧錦州 121013)

本文通過電子自旋共振(ESR)技術測定了魷魚上清液中與甲醛生成相關的自由基,同時研究了藍莓葉多酚對魷魚上清液高溫甲醛產生相關的自由基影響。結果表明:Fe2+促進魷魚上清液(CH3)3N·的產生;不同濃度的藍莓葉多酚使魷魚上清液中(CH3)3N·強度降低,濃度越高降低越顯著;隨加熱時間的延長,(CH3)3N·強度增加,加熱時間超過75 min后,藍莓葉多酚對(CH3)3N清除能力下降;隨溫度的升高,(CH3)3N·信號增強,高溫加熱15 min,對藍莓葉多酚清除(CH3)3N·能力無影響;pH6.0的反應體系產生的(CH3)3N·比pH7.0反應體系產生的自由基信號強,藍莓葉多酚在pH6.0的反應體系清除(CH3)3N·清除能力較強。初步證明魷魚上清液中甲醛產生的非酶途徑中存在自由基反應,藍莓葉多酚通過與自由基反應抑制甲醛的形成。

藍莓葉多酚,魷魚上清液,甲醛,(CH3)3N·

甲醛是一種毒性很強的物質,少劑量的甲醛能引起人疼痛、嘔吐、昏睡,大劑量的甲醛能引起死亡。甲醛可直接作用于蛋白質的氨基、巰基、羥基和羧基,破壞蛋白質和酶[1]。同時使組織細胞產生不可逆的凝固、壞死,從而對人的神經系統、肺、肝臟產生損傷,造成免疫功能的異常[2]。甲醛容易與細胞親核物質發生化學反應,導致DNA損傷[3]。水產品在加工與貯藏過程中會產生大量內源性甲醛。為了有效控制水產品中甲醛含量,對甲醛形成的機理研究非常必要。魷魚等水產品內源性甲醛產生主要有生物途徑和非酶途徑:生物途徑是指魷魚等水產品在酶特別是氧化三甲胺去甲基酶和微生物的作用下自行產生甲醛。非酶途徑主要是高溫過程中氧化三甲胺的熱分解產生的甲醛[4]。Hattori Lin[5]等人發現魷魚在加熱過程中會產生甲醛、二甲胺和三甲胺,并認為該反應是魷魚體內氧化三甲胺熱分解引起的。

為了有效降低水產品中甲醛含量,對水產品內源性甲醛的控制和機理研究十分必要。有研究發現干香菇在蒸煮過程中產生的甲醛和半胱氨酸結合形成四氫噻唑-4-羧酸,這不僅減少了甲醛,且此物質能夠與人體內的亞硝酸鹽結合,預防和控制癌癥的產生[6-7]。勵建榮等[8]研究也表明茶多酚對甲醛的捕獲效果顯著。朱軍莉等[9]研究發現檸檬酸、檸檬酸鈉、氯化鈣、茶多酚和白藜蘆醇對魷魚提取物中氧化三甲胺分解有抑制作用。李穎暢等[10]研究發現藍莓葉多酚具有抑制魷魚絲加工過程氧化三甲胺分解,降低魷魚絲中甲醛作用。Lin[11]等人還發現Fe(II)對氧化三甲胺熱分解的促進作用與Fenton反應十分相似,并推測魚體內氧化三甲胺的非酶分解途徑可能是通過自由基來實現的。Ferris[12]等人證實TMAO在Fe(II)催化下通過(CH3)3N自由基反應生成甲醛、二甲胺和三甲胺。Zhu等[13]和勵建榮等[14]研究表明秘魯魷魚加熱過程中伴隨甲醛的生成,產生了自由基,證明秘魯魷魚中甲醛產生的非酶途徑中存在自由基反應,內源性甲醛的產生與自由基的形成有關。藍莓葉多酚對魷魚制品內源性甲醛的抑制作用是否與自由基有關,關于藍莓葉多酚對魷魚上清液中甲醛生成相關自由基的影響還為見報道。電子自旋共振(ESR)能監測自由基中的單電子自旋翻轉所產生的共振現象,成為直接檢測自由基的唯一可靠的方法。由于自由基極不穩定,因此可利用自旋捕集劑與自由基反應生成相對穩定的加合物,通過測定該加合物來表征原有自由基,自旋捕集技術使ESR用途更為廣泛。本文采用電子自旋共振(ESR)技術研究了藍莓葉多酚對魷魚上清液中甲醛生成相關自由基的作用。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

藍莓葉沈陽農業科學發展研究院提供;秘魯魷魚購于錦州市林西路水產市場。

無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸天津市致遠化學試劑有限公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)北京Solarbio科技有限公司;乙酸天津市大茂化學試劑廠;2-苯叔丁基硝酮(PBN)北京百靈威生物科技有限公司。以上試劑無特殊說明均為分析純。

RRH-100型萬能高速粉碎機歐凱萊芙(香港)實業公司;MS105DU電子分析天平METTLER TOLEDO公司;DHG-9123A 電熱鼓風干燥箱上海一恒科學儀器有限公司;SORVALL Stratos冷凍高速離心機美國Thermo公司;HH-6型數顯恒溫水浴鍋國華電器有限公司;RE-52AA旋轉蒸發儀上海亞榮生化儀器廠;SHB-III循環水式多用真空泵鄭州長城科工貿有限公司;FE20型pH計,METTLER TOLEDO公司;Milli-Q超純水系統美國Millipore公司;FreeZone臺式凍干機美國Labconco公司;HE-2S恒流泵上海青浦滬西儀器廠;MJ-25BM05A 絞肉機廣東美的精品電器制造有限公司;DRX-400電子自旋共振儀德國BRUKER公司。

1.2實驗方法

1.2.1藍莓葉多酚樣品的制備參照李穎暢等[15]的方法,稍作修改,將藍莓葉45 ℃烘干,用粉碎機粉碎。取20 g藍莓葉粉末按1∶20(g/mL)(m/v)的料液比溶于70%乙醇(v/v),60 ℃恒溫水浴鍋水浴2 h。取上清液進行抽濾,濾液用旋轉蒸發儀在50 ℃下進行濃縮,得到藍莓葉多酚濃縮液。用AB-8型大孔樹脂對粗提液進行純化,減壓濃縮,將濃縮液真空冷凍得到藍莓葉多酚粉末。將其儲藏于密封袋中,4 ℃保存備用,Folin-Ciocalteu法測定多酚含量[16]。

1.2.2魷魚上清液的制備10 g樣品經過去皮,去骨,去內臟后,絞碎,取碎魷魚肉,按1∶2(g/mL)(m/v)與20 mmol/L Tris-乙酸緩沖液(pH7.0)混合,勻漿,冰浴超聲30 min,12000 r/min離心15 min,取上清液,4 ℃冷藏備用。

1.2.3自由基的檢測方法將0.5 mL樣品(0.25 mL魷魚上清液+0.25 mL藍莓葉多酚溶液)裝入離心管中,加入15 mg PBN使其終濃度達到0.37 mol/L,混勻,在一定溫度下水浴加熱一定時間,促使自由基產生。以蒸餾水代替藍莓葉多酚作為對照,檢測自由基的變化。ESR測定條件:中心磁場3510.00 G,微波功率32.28 mW,調制頻率100 kHz,調制幅度10.00 G,室溫,掃描時間40.96 s。

1.2.3.1Fe2+對魷魚上清液產生自由基的影響 魷魚上清液+0.2 mmol/L Fe2+,0.05 g/L藍莓葉多酚+魷魚上清液+0.2 mmol/L Fe2+,分別在100 ℃水浴鍋中處理15 min,以PBN為自旋捕捉劑,檢測自由基的變化。

1.2.3.2不同濃度的藍莓葉多酚對魷魚上清液產生自由基的影響在0.25 mL魷魚上清液中分別添加濃度為0、0.005、0.05、0.1 g/L藍莓葉多酚溶液0.25 mL,添加PBN后在100 ℃加熱15 min,檢測自由基的變化。

1.2.3.3藍莓葉多酚對不同加熱時間下的魷魚上清液產生自由基的影響在0.25 mL魷魚上清中添加濃度為0.05 g/L藍莓葉多酚溶液0.25 mL,加PBN后并在100 ℃分別加熱15、30、75、90 min,檢測自由基的變化。

1.2.3.4藍莓葉多酚對不同溫度下的魷魚上清液產生自由基的影響0.25 mL魷魚上清中添加濃度為0.05 g/L藍莓葉多酚溶液0.25 mL,添加PBN后,分別在80、90、100 ℃加熱15 min,檢測自由基的變化。

1.2.3.5藍莓葉多酚對不同pH下的魷魚上清液產生自由基的影響在0.25 mL魷魚上清中添加濃度為0.05 g/L藍莓葉多酚溶液0.25 mL,分別調pH為6.0,7.0,添加PBN后,在100 ℃加熱15 min,檢測自由基的變化。

圖1　Fe2+對魷魚上清液產生(CH3)3N·的影響Fig.1　Effects of Fe2+on the generationof (CH3)3N· in squid supernatant注:(a)魷魚上清液,(b)魷魚上清液+Fe2+,(c)魷魚上清液+Fe2++0.05 g/L藍莓葉多酚。

2　結果與分析

2.1Fe2+對魷魚上清液自由基產生的影響

如圖1a,圖1b所示,加熱處理后,在3460～3560 G的磁場下產生明顯的六重峰自由基信號,且添加Fe2+的魷魚上清液中自由基信號顯著增強,Zhu等[13]對秘魯魷魚內源性甲醛進行研究認為Fe2+是促進魷魚中甲醛生成的主要影響因子,本文與Zhu等研究一致,Fe2+促進魷魚上清液中自由基的產生。圖1c為在魷魚上清液+Fe2+體系中添加藍莓葉多酚產生的自由基信號,從圖1c中可以看出,藍莓葉多酚使自由基信號減弱,藍莓葉多酚減弱自由基信號可能與多酚螯合金屬離子有關。同時,藍莓葉多酚為多羥基化合物,可以與(CH3)3N·發生反應,從而抑制魷魚上清液中氧化三甲胺(TMAO)熱分解生成甲醛。

2.2不同濃度的藍莓葉多酚對魷魚上清液產生自由基的影響

圖2　不同濃度的藍莓葉多酚對魷魚上清液產生(CH3)3N·的影響Fig.2　Effects of different concentration blueberryleaf polyphenols on the generation of (CH3)3N· in squid supernatant

對不同濃度藍莓葉多酚與魷魚上清液反應樣品中的自由基進行檢測,結果如圖2所示,不添加藍莓葉多酚的魷魚上清液經過高溫處理后產生了明顯的六重峰自由基信號。隨著藍莓葉多酚濃度的增加,處理后的魷魚上清液中自由基信號逐漸減弱,當濃度達到0.1 g/L時自由基信號基本為基線峰。由此可知,藍莓葉多酚對魷魚上清液氧化三甲胺(TMAO)高溫熱分解的抑制可能通過其對自由基的清除途徑來實現。Ferris等[12]證實TMAO在Fe(II)催化下通過(CH3)3N自由基反應生成甲醛、二甲胺和三甲胺。王堯耕[17]發現魷魚中鐵含量在21.33～36.30 μg/g之間,Fe2+促進自由基產生。魷魚上清液中有一定量的Fe2+,促進(CH3)3N·信號的產生。勵建榮等[14]在魷魚上清液中捕捉到相同的自由基信號并驗證了魷魚中甲醛的產生與自由基存在密切的關系,本文與此研究是一致的。內源甲醛的產生與高溫加工產生的自由基有關,藍莓葉多酚清除魷魚上清液中產生自由基,這與藍莓葉多酚抑制魷魚絲加工過程氧化三甲胺熱分解[10],降低魷魚絲中甲醛作用是一致的。

圖3　不同處理時間下藍莓葉多酚對魷魚上清液產生(CH3)3N·的影響Fig.3　Effects of blueberry leaf polyphenols on the generation of(CH3)3N· in squid supernatant in different time

圖4　不同處理溫度下藍莓葉多酚對魷魚上清液產生(CH3)3N·的影響Fig.4　Effects of blueberry leaf polyphenols on the generation of (CH3)3N· in squid supernatant in different temperature

2.3藍莓葉多酚對不同時間下的魷魚上清液產生自由基的影響

圖3表明藍莓葉多酚在不同加熱時間下對魷魚上清液中(CH3)3N·的影響。隨著加熱時間的增加,(CH3)3N·的信號逐漸增強,藍莓葉多酚使自由基信號減弱,這與魷魚上清液反應中TMAO含量隨著加熱時間的增加而降低以及添加藍莓葉多酚后魷魚上清液中TMAO含量升高的現象一致,進一步說明(CH3)3N·的生成與加熱時間有關,藍莓葉多酚可通過與魷魚體內的(CH3)3N·反應而阻止甲醛的生成;加熱時間超過75 min后,藍莓葉多酚穩定性降低,清除(CH3)3N·能力降低。藍莓葉多酚的穩定性與藍莓葉多酚組成以及多酚化合物的結構是有關的。

2.4藍莓葉多酚對不同溫度下的魷魚上清液產生自由基的影響

圖4顯示了藍莓葉多酚在不同處理溫度下對魷魚上清液中(CH3)3N·的影響,隨著處理溫度的升高,產生的(CH3)3N·增多,自由基的信號逐漸增強,添加藍莓葉多酚的魷魚上清液中自由基信號強度受到抑制。上清液自由基的變化與魷魚上清液反應中TMAO含量隨著溫度的升高而降低的結果相一致,而添加藍莓葉多酚后魷魚上清液中自由基的變化與TMAO含量升高的結果一致。Lin和Hurng[11]對干魷魚進行加熱發現溫度越高氧化三甲胺分解成三甲胺、二甲胺和甲醛比例越高;溫度超過200 ℃,大約90%的氧化三甲胺都進行了熱分解。說明氧化三甲胺分解產生甲醛和(CH3)3N·自由基的產生與溫度有關,且藍莓葉多酚對魷魚內源性甲醛的抑制作用與自由基變化有關。

2.5藍莓葉多酚對不同pH下的魷魚上清液產生自由基的影響

圖5表明藍莓葉多酚對不同pH下的魷魚上清液產生自由基的影響。相對pH7.0的魷魚上清液,pH6.0的魷魚上清液中產生的自由基信號較強,藍莓葉多酚在pH6.0的魷魚上清液中清除(CH3)3N·也較強,說明藍莓葉多酚在pH6.0的魷魚上清液中比較穩定,清除自由基能力較強。Mizuguch等[18]研究表明pH影響凍藏魚肉的氧化三甲胺分解和二甲胺形成。本文研究表明pH影響魷魚上清液自由基信號強度和藍莓葉多酚對自由基的清除能力。可能原因是pH影響多酚的解離狀態,進而影響其與自由基的結合能力。

3　結論

Fe2+對魷魚上清液(CH3)3N·的產生有促進作用;不同濃度的藍莓葉多酚使魷魚上清液中(CH3)3N·信號強度降低,藍莓葉多酚濃度越高,自由基信號降低越顯著。魷魚上清液加熱過程中產生了(CH3)3N·;隨加熱溫度的升高和處理時間的延長,(CH3)3N·信號強度增加;魷魚上清液中加入藍莓葉多酚后,(CH3)3N·信號減弱。pH6.0的反應體系產生的(CH3)3N·比pH7.0反應體系產生的自由基信號強,藍莓葉多酚在pH6.0的反應體系清除(CH3)3N·能力較強。初步證明魷魚上清液中甲醛產生的非酶途徑中存在自由基反應,藍莓葉多酚通過與自由基反應抑制氧化三甲胺的分解和甲醛的生成。

圖5　不同pH下藍莓葉多酚對魷魚上清液產生(CH3)3N·的影響Fig.5　Effects of blueberry leaf polyphenols on the generation of (CH3)3N· in squid supernatant in different pH

[1]Chanarat S,Benjakul S. Effect of formaldehyde on protein cross-linking and gel forming ability of surimi from lizardfish induced by microbial transglutaminase[J]. Food Hydrocolloids,2013,30(2):704-711.

[2]Siti Aminash A,Zailina H,Fatimah A B. Health risk assement of adults consuming commercial fish contaminated with formaldehyde[J]. Food and Public Health,2013,3(1):52-58.

[3]Noda T,Takahashi A,Kondo N,et al. Repair path ways in dependent of the Fanconi anemia nuclear core complex play a predominant role in mitigating formaldehyde-induced DNA damage[J]. Biochemical and Biophysical Research Communication,2011,404(1):206-210.

[4]Nitisewojo P,Hultin H O. Characteristics of TMAO degrading system sinatl antic short finned squid(Illes Illecebrosus)[J]. Journal of Food Biology Chemistry,1986,10:93.

[5]Spinelli J,Koury B J. Non enzymic formation of dimethylamine in dried fishery products[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1979,27(5):1104-1108.

[6]Kurashima Y,Tsuda M,Sugimura T. Marked formation of thiazolidine-4-carboxylicacid an effective nitrite trapping agentinvivoon boiling of dried shiitake mushroom Lentinusedodes[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1990,38(6):1945-1949.

[7]刁恩杰.香菇中甲醛影響因素及在加工中控制措施研究[D].重慶:西南農業大學,2005.

[8]勵建榮,俞其林,胡子豪,等. 茶多酚與甲醛的反應特性研究[J].中國食品學報,2008,8(2):52-57.

[9]朱軍莉.秘魯魷魚內源性甲醛生成機理及其調控技術研究[D].杭州:浙江工商大學,2008,24-30.

[10]李穎暢,張笑,張芝秀,等. 藍莓葉多酚對魷魚絲加工過程中內源性甲醛產生的抑制作用[J].食品與發酵工業,2015,41(7):70-74.

[11]Lin J K,Hurng D C. Thermal conversion of trimethylamine-N-oxide to trimethylamine and dimethylamine in squids[J]. Food

Chemical Toxicology,1985,23(6):579-583.

[12]Ferris J P,Gerwe R D,Gapsi G R. Detoxication mechanisms.II.Thei ron-catalyzed dealkylation of trimethylamin oxide[J].Journal of the American Chemical Society,1967,89(20):5270-5275.

[13]Zhu J L,Jia J,Li X P,et al. ESR studies on the thermal decomposition of trimethylamine oxide to formaldehyde and dimethylamine in jumbo squid(Dosidicus gigas)extract[J]. Food Chemistry,2013,141:3881-3888.

[14]勵建榮,曹科武,賈佳,等. 利用電子自旋共振(ESR)技術對秘魯魷魚中甲醛生成非酶途徑中相關自由基的研究[J]. 中國食品學報,2009,9(1):16-20.

[15]李穎暢,李冰心,呂艷芳,等. AB-8型大孔樹脂純化藍莓葉多酚的工藝研究[J].食品工業科技,2012,33(20):258-261.

[16]李穎暢,呂艷芳,勵建榮. Folin-Ciocalteu法測定不同品種藍莓葉中多酚含量[J].中國食品學報,2014,14(1):273-278.

[17]王堯耕,陳新軍. 世界大洋性經濟柔魚類資源及其漁業[M]. 海洋出版社,2005,150-200.

[18]Mizuguchi T,Kumazawa K,Yamashita S,et al. Effect of surimi processing on dimethylamine formation in fish meat during frozen storage[J]. Fish Science,2011,77(1):271-277.

Effect of blueberry leaf polyphenols on free radicals in the formation of formaldehyde in squid supernatant

LI Ying-chang,ZHU Xue-wen,BAI Yang,XIN Wei-ping,YANG Yu,ZHANG Xiao,LI Jian-rong*

(College of Food Science and Technology,Bohai University,Jinzhou 121013,China;Food Safety Key Lab of Liaoning Province,Jinzhou 121013,China;National & Local Joint Engineering Research Center of Storage,Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products,Jinzhou 121013,China)

The free radical which is related to formaldehyde in squid supernatant was determined by ESR. At the same time,the effect of blueberry leaf polyphenols on free radicals in squid supernatant was studied at high temperature. The results showed that Fe2+promoted(CH3)3N· in squid supernatant. Different concentrations of blueberry leaf polyphenols decreased(CH3)3N· in the squid supernatant,and the higher concentration decreased more significantly. The(CH3)3N· was increased with heating time prolonging. Scavenging capacity of blueberry leaf polyphenols was decreased when heating time was over 75 min. The(CH3)3N· were enhanced with the temperature increasing. There was no affect on blueberry leaf polyphenols scavenging (CH3)3N· at high temperature heating for 15 min. The(CH3)3N· in reaction system of pH6.0 was more than that in reaction system of pH7.0. The scavenging ability in pH6.0 was stronger than in pH7.0. This work indicated that radical reaction existed in non-enzymic formation mechanism of formaldehyde in squid supernatant. The formation of formaldehyde was controlled through the reaction of blueberry leaf polyphenols with free radical.

blueberry leaf polyphenols;squid supernatant;formaldehyde;(CH3)3N·

2015-11-19

李穎暢(1973-)，女，博士，副教授，研究方向：水產品的加工與貯藏, E-mail:liyingchangsy@sina.com。

勵建榮(1964-)，男，博士，教授，研究方向：水產品的加工與貯藏,E-mail:lijr6491@163.com。

國家自然基金(31201308)；“十二五”國家科技支撐計劃(2012BAD29B06)。

TS254.4

A

1002-0306(2016)11-0103-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.013