低溫儲存期間原料乳微生物預測模型建立

張宏偉,鄭冬梅,*,孔保華,肖洪亮,韓光毅

(1.東北農業大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030;2.黑龍江省完達山乳業股份有限公司,黑龍江哈爾濱 150036)

?

低溫儲存期間原料乳微生物預測模型建立

張宏偉1,鄭冬梅1,*,孔保華1,肖洪亮2,韓光毅2

(1.東北農業大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030;2.黑龍江省完達山乳業股份有限公司,黑龍江哈爾濱 150036)

本研究對秋季低溫儲存原料乳進行預測微生物學研究。使用Gompertz模型建立4～14 ℃儲存的秋季原料乳中總菌落和嗜冷菌的生長動力模型。模型可以有效的模擬秋季原料乳中微生物的生長情況,模型的相關系數均大于0.972,可以用來預測微生物生長情況和達到控制下限的時間。研究表明嗜冷菌是低溫儲存的原料乳中優勢微生物,在4～8 ℃儲存溫度下總菌落數與嗜冷菌的數量呈很好的相關性(R2=0.931),可以通過總菌數推算出嗜冷菌的數量,保證乳制品的品質。

原料乳,低溫儲存,預測微生物

乳及乳制品是易腐的食品,如果儲存不當就會引起腐敗菌和致病菌的迅速生長,隨著冷藏設備的廣泛應用,嗜冷菌逐漸成為影響乳制品保質期的主要因素。Ingram將耐冷菌定義為能在≤5 ℃的條件下生長的微生物[1]。Morita定義嗜冷菌(Psychrophiles)就是指那些最適生長溫度等于或低于15 ℃,上限溫度等于或低于20 ℃的微生物的總稱[2]。嗜冷菌種類繁多,嗜冷菌中細菌就有30多個屬,常見如假單胞菌屬、產堿桿菌屬、無色桿菌屬、黃桿菌屬、克雷伯氏菌屬[3]。檢測原料乳中嗜冷菌數量的方法有多種,常見的方法是在6.5 ℃培養10 d后計數[4],或將樣品21 ℃增菌培養后,采用選擇性培養基在21 ℃培養25 h后,將樣品中革蘭氏陰性(G-)桿菌作為嗜冷菌污染的指標[5],經典的微生物培養方法在時間及針對性上都存在嚴重的缺陷。PCR和流式細胞技術由于比較高昂的儀器購置費用、需要專業的操作人員以及乳品中微生物群系的復雜性,限制了這些技術在生產實踐中的應用。

預測微生物學是運用微生物學和統計學進行數學建模,利用所建模型預測和描述處在特定食品環境下微生物的生長和死亡,評估食品的安全性[6-10]。建立預測模型的目的是預測在一定的條件下食品中微生物的數量何時達到威脅人類健康的水平或者影響微生物滅活的程度,預測微生物學的關鍵在于使用從實際食品中獲得的數據建立完整的數據庫,利用這個數據庫建立含有多種影響因子的預測數學模型[11-12],預測在外界環境因素和食品中微生物共同作用下的食品中微生物數量何時達到威脅人類健康的水平[7]。

低溫儲存已經逐漸成為原料乳儲存的常用方法,隨著存儲方式的改變,原料乳中優勢微生物也發生變化,國內對標準化牧場產原料乳在低溫儲存過程中的微生物變化系統研究較少,為填補這一研究空缺,本研究通過對不同低溫儲存溫度和儲存時間的原料乳進行總菌落數和嗜冷菌數測定和模型建立,并對模型進行分析,探討總菌落數和嗜冷菌數的關系,以期達到快速估算原料乳中微生物數量的目的。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

原料乳采自標準化奶牛集中飼養小區;營養瓊脂、營養肉湯北京奧博星生物技術有限責任公司;脫脂奶粉(蛋白質含量32.2%,脂肪含量2.0%,水分含量3.6%)黑龍江省完達山乳業股份有限公司。

JD500-2電子天平沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司;ZDX-30KBS自動滅菌鍋上海申安醫療器械廠;DL-CJ-1N醫用超凈工作臺、HZQ-F160全溫震蕩培養箱哈爾濱東聯公司;LRH-250生化培養箱上海一恒科學儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1原料乳的采集與處理新鮮機械榨取的牛乳,在5 t乳罐中攪拌并快速冷卻至4 ℃,從乳罐中取乳樣30 kg,使用碎冰屑保持低溫,樣品在30 min內送到實驗室。將原料乳樣品搖勻后進行無菌分裝,放入指定保藏溫度的全溫培養箱,以80 r/min震蕩培養。

1.2.2菌落總數的測定采用GB/T4789.2-2010方法檢測菌落總數,對不同儲存溫度和儲存時間的原料乳中菌落總數進行測定[15]。

1.2.3嗜冷菌的測定采用BS ISO 17410-2001方法檢驗嗜冷菌數,對不同儲存溫度和儲存時間的原料乳中嗜冷菌菌數進行測定[16]。

1.2.4原料乳中微生物生長曲線的測定每隔一定的時間取出試樣,用0.85%生理鹽水對試樣牛乳進行適當稀釋,使菌濃度控制在103～104CFU/mL,用平板計數法測定菌落數。

1.2.5預測微生物模型建立采用Gibson等人引入的非線性模型-Gompeertz函數對微生物生長曲線進行描述,這個函數的基礎是微生物的比生長速率隨著營養水平和產生的有毒代謝產物變化。可以假設不同的N0有不同的遲滯期。典型的比生長速率增長到最大后就會下降[17]。Gompertz函數的形式如下:

LogN=a+cexp{-exp[-b(t-m)]}

N-CFU/mL,在某個時間的菌數;a-細菌的對數期的無限短時間內的漸近線;c-對數生長期任意一時間的菌數的漸近線;m-h-絕對生長速率最大的時間;b-絕對生長速率最大時的相對生長速率。

使用這四個參數可以通過logN和相對應的時間進行非線性回歸得出[17-18],制作出模型后,可以通過模型推斷出在某個時間時菌數是多少或者達到某個菌數的時間,這對食品的儲存具有一定的指導意義。

1.3數據分析

實驗取3個平行實驗的數據分析進行平均值和誤差項,采用Sigmaplot 10.0繪圖。初級模型的制作使用SAS軟件的牛頓迭代程序對微生物生長數據進行處理,使用Gompertz模型建立初級生長預測模型。

2　結果與分析

圖1　秋季原料乳在不同儲存溫度條件下總菌落生長模型Fig.1　The growth model of total colony in the raw milk of autumn at different storage temperature conditions

2.1低溫儲存原料乳中微生物生長模型建立

由圖1～圖3和表1相應的生長動力模型可以得出,隨著儲存溫度的升高,總菌數達到最大生長速率的時間逐漸減少,從4 ℃儲存的24.4 h降低到14 ℃儲存的15 h,達到穩定期的微生物增長量也隨著儲存溫度的升高而增加,從4 ℃儲存的0.41 log10CFU/mL增加到14 ℃儲存的1.96 log10CFU/mL。嗜冷菌菌數達到最大生長速率的時間從4 ℃儲存的31.53 h降到14 ℃儲存的24 h,達到穩定期的微生物增長量也隨著儲存溫度的升高而增加,從4 ℃儲存的0.49 log10CFU/mL增加到12 ℃儲存的1.39 log10CFU/mL,在14 ℃儲存時的嗜冷菌的增長量下降。在低溫條件下,嗜冷菌增長量占總菌落增長量的絕大部分,甚至超過總菌落的增長量(4、6、10 ℃),可知在低溫儲存的原料乳中嗜冷菌是生長繁殖的優勢菌,嗜冷菌數量和總菌落數量有一定比例關系。

使用Gompertz模型建立的原料乳中總菌生長動力模型的R2>0.974,嗜冷菌生長動力模型的R2>0.972,表明使用Gompertz模型建立的4～14 ℃儲存秋季原料乳中總菌和嗜冷菌的生長動力模型是適合的,該模型可以有效的模擬秋季原料乳中微生物的生長情況。

表1　秋季原料乳中微生物預測模型

圖2　秋季原料乳在不同儲存溫度條件下嗜冷菌生長模型Fig.2　The growth model of psychrophile in the raw milk of autumn at different storage temperature conditions

圖3　儲存溫度對Gompertz模型參數的影響Fig.3　Storage temperature on the parameters of the Gompertz model

2.2不同儲存溫度的原料乳中總菌落數與嗜冷菌數量的關系

由圖4和表2可以得出,總菌落數隨著嗜冷菌的數量增長而增加,呈正相關,在4～8 ℃儲存溫度下相關系數較高,為0.931,但是10～14 ℃儲存溫度下相關系數較低,為0.623%。原料乳多在10 ℃以下條件下儲存,因此可以利用嗜冷菌數量與總菌落數量呈正相關的趨勢來快速推斷原料乳中嗜冷菌的數量。

圖4　原料乳中總菌落數與嗜冷菌數量的關系Fig.4　The relationship between total colonyand psychrophilic in raw milk

3　討論

本研究使用SAS軟件的牛頓迭代程序對原料乳中微生物生長數據進行處理,使用Gompertz模型建立初級生長預測模型,實驗使用Gompertz模型建立的原料乳中總菌生長動力模型的R2≥0.974,嗜冷菌生長動力模型的R2≥0.972,表明使用Gompertz模型建立的4～14 ℃儲存不同季節原料乳中總菌和嗜冷菌的生長動力模型是適合的。牛頓迭代成功建立模型的關鍵在于對預測模型參數進行預估,尤其是起始菌數和最大生長量的預估對模型的建立起到關鍵的作用。起始菌數通常可以通過生長曲線的遲滯期來進行估計,最大生長量可以通過穩定期和遲滯期的菌數差來估計。

表2　總菌落數(x)與嗜冷菌數量(Y)的關系

在較低的儲存溫度條件下原料乳中嗜冷菌是主要增長的微生物[19]。實驗表明在4～14 ℃儲存條件下的嗜冷菌增長的數目占總菌增長數目的大部分,這與儲存條件和嗜冷菌自身的性質有關,在較低的儲存溫度條件下,嗜溫微生物生長緩慢,但是嗜冷菌仍然以相對較快地生長[20]。

Cempírková在1999至2000年的研究表明,原料乳嗜冷菌與菌落總數有相關性,相關性達到0.920[21],本研究結果與Cempírková的研究結果相似。可以利用原料乳嗜冷菌與菌落總數有相關性這種關系,根據菌落總數快速推斷出嗜冷菌的數量。

4　結論

本研究建立4～14 ℃儲存的秋季原料乳中總菌落和嗜冷菌的生長動力模型,模型可以有效的模擬秋季原料乳中微生物的生長情況,模型的相關系數均大于0.972,可以用來預測微生物生長情況。原料乳在低溫條件下儲存可以抑制原料乳中微生物的生長,隨著儲存溫度的降低,微生物生長速率逐步減緩。嗜冷菌是低溫儲存的原料乳中優勢微生物,低溫儲存的原料乳中總菌數與嗜冷菌有一定的相關性,在4～8 ℃儲存溫度下總菌落數與嗜冷菌的數量呈很好的相關性,相關系數為0.931,可以通過總菌數快速推算出嗜冷菌的數量。

[1]Ingram M. Psychrophilic and psychrotrophic microorganisms[J]. Annals institute Pasteur Lille,1965,16:111-118.

[2]Morita R Y. Psychropphilic bacteria[J]. Bacteriology Reviews,1975,39(2):144-167.

[3]Niza-Ribeiro J,Louz? A C,Santos P,et al. Monitoring the microbiological quality of raw milk through the use of an ATP bioluminescence method[J]. Food Control,2000,11(3):209-216.

[4]IDF Standard101A. Milk enumeration of psychrotrophic microorganismscolony count technique at 6.5℃[S].

[5]IDF Standard132A. Estimation of numbers of psychrotrophic microorganisms(rapid colony count technique,25 hours at 21°C)[S].

[6]Mcmeekin T A,Ross T. Predictive microbiology:providing a knowledge-based framework for change management[J]. International Journal of Food Microbiology,2002,78(s 1-2):133-153.

[7]Mcmeekin T A,Olley J,Ratkowsky D A,et al. Predictive microbiology:towards the interface and beyond[J]. International Journal of Food Microbiology,2002,73(s 2-3):395-407.

[8]Mcmeekin T A. Predictive microbiology:Quantitative science delivering quantifiable benefits to the meat industry and other food industries.[J]. Meat Science,2007,77(1):17-27.

[9]Brul S,Mensonides F I C,Hellingwerf K J,et al. Microbial systems biology:New frontiers open to predictive microbiology[J].International Journal of Food Microbiology,2008,128(1):16-21.

[10]Mcmeekin T,Bowman J,Mcquestin O,et al. The future of predictive microbiology:Strategic research,innovative applications and great expectations[J]. International Journal of Food Microbiology,2008,128(1):2-9.

[11]Coleman M E,Dreesen D W,Wiegert R G. A simulation of microbial competition in the human colonic ecosystem.[J]. Applied & Environmental Microbiology,1996,62(10):3632-3639.

[12]Mcdonald K,Sun D W. Predictive food microbiology for the meat industry:a review.[J]. International Journal of Food Microbiology,1999,52(52):1-27.

[13]Fanny T A,Mariem E. Software for predictive microbiology and risk assessment:A description and comparison of tools presented at the ICPMF8 Software Fair.[J]. Food Microbiology,2015,45(PtB):290-299.

[14]Ferrer J,Prats C,López D,et al. Mathematical modelling methodologies in predictive food microbiology:a SWOT analysis. [J]. International Journal of Food Microbiology,2009,134(134):2-8.

[15]GB/T4789.2-2010.食品衛生微生物學檢驗菌落總數測定[S].

[16]BS ISO 17410-2001.Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for the enumeration of psychrotrophic micro-organisms[S].

[17]Gibson A M,Bratchell N,Roberts T A. The effect of sodium chloride and temperature on the rate and extent of growth of Clostridium botulinum type A in pasteurized pork slurry.[J]. Journal of Applied Bacteriology,1987,62(6):479-490.

[18]Buchanan R L,Phillips J G. Response surface model for predicting the effects of temperature,pH,sodium chloride content,sodium nitrite concentration and atmosphere on the growth of Listeria monocytogenes[J]. Journal of Food Protection,1990,53(5):370-376.

[19]S?rhaug T,Stepaniak L. Psychrotrophs and their enzymes in milk and dairy products:Quality aspects[J]. Trends in Food Science & Technology,1997,8(2):35-41.

[20]辛明秀,周培瑾. 低溫微生物研究進展[J]. 微生物學報,1998(5):400-403.

[21]Cempírková R,Cempírková R. Psychrotrophic vs. total bacterial counts in bulk milk samples[J]. Veterinární Medicína,2002,47(8):227-233.

Establishment of predicting model for raw milk at low temperature storage

ZHANG Hong-wei1,ZHENG Dong-mei1,*,KONG Bao-hua1,XIAO Hong-liang2,HAN Guang-yi2

(1.Food school of Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.Heilongjiang Wondersun Dairy Limited Company,Harbin 150036,China)

To predict the microbiological analysis of raw milk stored at low temperature in autumn. The Gompertz model was used to establish the growth kinetic model of total colony and psychrophilic in raw milk in the autumn raw milk stored in 4～14 ℃.The model could effectively simulate the growth of microorganisms in raw milk in autumn,and the correlation coefficient of the model was higher than 0.972,which could be used to predict the growth of microorganisms and the time to reach the control limit. The study showed that psychrophile was the main microorganism among raw milk stored at low temperature. It was good while the store temperature was between 4～8 ℃(R2=0.931). The number of the bacteria could be calculated by the total number of bacteria,which could ensure the quality of dairy products.

raw milk;low temperature storage;prediction microbiology

2015-12-02

張宏偉(1982-)，男，碩士，實驗師，研究方向：畜產品加工，E-mail:120680287@qq.com。

鄭冬梅(1963-)，女，碩士，教授，研究方向：食品安全，E-mail:zdm1234@126.com。

國家支撐計劃課題(2012BAD12B05)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)11-0122-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.017