Ca2+對節旋藻生長和光合色素含量的影響

陳　瑾,王素英,孫　宏,董世瑞

(天津市食品生物技術重點實驗室,天津商業大學生物技術與食品科學學院,天津 300134)

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Ca2+對節旋藻生長和光合色素含量的影響

陳瑾,王素英,孫宏,董世瑞*

(天津市食品生物技術重點實驗室,天津商業大學生物技術與食品科學學院,天津 300134)

為探討Ca2+對節旋藻生物量、葉綠素、類胡蘿卜素及藻膽蛋白含量的影響,本實驗以節旋藻TJSD091藻株為研究對象,在AB液體培養基中加入不同濃度的Ca2+,在TJSD091藻株的快速生長期末測定生物量、葉綠素、類胡蘿卜素和藻膽蛋白的含量。結果表明:當Ca2+濃度在0.02 g/L時藻藍蛋白和別藻藍蛋白的濃度最高,分別為7.607、5.608 mg/L;當Ca2+濃度在0.06 g/L時生物量、葉綠素、類胡蘿卜素含量較低,分別為A560 nm=0.789、5.149、0.193 mg/L;當Ca2+濃度在0.08 g/L時生物量、葉綠素和類胡蘿卜素含量處于較高值,分別為A560 nm=1.193、16.13、0.257 mg/L。方差分析表明,Ca2+濃度對節旋藻TJSD091藻株的生長及光合色素含量均有顯著影響(p<0.05)。

Ca2+,節旋藻,生物量,葉綠素,類胡蘿卜素,藻膽蛋白

節旋藻屬藍藻門、顫藻科、節旋藻屬,是由單細胞或多細胞組成的螺旋形原核生物[1]。其營養豐富,蛋白質含量為60%～70%[2-3],主要是藻膽蛋白,包括藻藍蛋白(PC)、別藻藍蛋白(APC)及藻紅蛋白(PE)。節旋藻還含有人體必需氨基酸、多糖、維生素、類胡蘿卜素和藻藍素等多種生物活性物質[4],被用作膳食補充劑,是人類理想的食物和藥物。

Ca2+作為普遍的信號傳導因子,在細胞的分裂、生長和死亡過程中起著重要作用,能夠影響細胞壁的胞間層[5],還能穩定細胞壁、細胞膜及膜結合蛋白,調控細胞內各種生化過程[6-9]。趙聯芳等[10]設置不同水平的Ca2+濃度研究其對銅綠微囊藻和斜生柵藻生長的影響,發現銅綠微囊藻的生物量隨著Ca2+濃度的升高而降低,而斜生柵藻的生物量變化規律不明顯。Ca2+作為節旋藻培養基中重要的無機元素對于節旋藻的生長必不可少,但未見Ca2+對節旋藻天然色素和藻膽蛋白含量的影響相關的研究報道。本文旨在研究不同濃度的Ca2+對節旋藻的天然色素及藻膽蛋白含量的影響,為生產上合理使用Ca2+及開發相關富鈣節旋藻產品提供依據。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

藻株:Arthrospirasp.TJSD091為課題組自天津濱海濕地分離純化的純培養藻株。

節旋藻培養基為AB培養基[11],配方及配制方法如下:將993 mL蒸餾水分三份用于溶解A、B、C,PIV 6 mL,A5 1 mL。其中A:NaHCO313.61 g,Na2CO34.03 g,KH2PO40.5 g,NaNO32.5 g;B:K2SO41 g,NaCl 1 g,MgSO4·7H2O 0.2 g;C:CaCl2·2H2O 0.04 g;A5(g/L):H3BO32.86,MnCl2·4H2O 1.81,ZnSO4·7H2O 0.22,MnSO4·7H2O 2.50,CuSO4·5H2O 0.074,Na2MoO40.021;PIV(g/L):Na2EDTA 0.750,FeCl3·7H2O 0.097,MnCl2·4H2O 0.041,ZnCl20.005,CoCl2·6H2O 0.002,Na2MoO4·2H2O 0.004。按照配方稱量藥品,相應蒸餾水溶解,121 ℃滅菌20 min后,靜置,待液體溫度恢復至室溫時,將A、B、C混合并加入相應體積的PIV和A5,搖勻即可。以上試劑均為國產分析純試劑。

754型紫外可見分光光度計上海舜宇恒平科學儀器有限公司;Scientz--IID型超聲波細胞粉碎機寧波新芝生物科技股份有限公司;MGC-250型智能型光照培養箱上海一恒科學儀器有限公司;ECLIPSE Ci-L型科研顯微鏡尼康映像儀器銷售有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1節旋藻TJSD091的培養將藻種按10%的比例接種于200 mL AB培養基中擴大培養。培養條件:光暗周期12 h/12 h,溫度32 ℃/28 ℃,光照強度3000 lx,每日早中晚各搖勻一次,培養14 d至快速生長期末。實驗設定十個Ca2+濃度梯度,即0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20 g/L,每個梯度三個重復。

1.2.2節旋藻形態記錄生物顯微鏡測定并記錄節旋藻細胞寬度、螺徑和螺距。

1.2.3生物量測定紫外分光光度計測定藻液在560 nm處的吸光度值。

1.2.4葉綠素濃度的測定取4 mL藻液8000 r/min離心15 min,棄上清,加入4 mL無水乙醇振蕩搖勻后,4 ℃冰箱保存24 h,5000 r/min離心15 min,取上清液測定665 nm和649 nm處的OD值,根據公式計算葉綠素濃度[12]:

葉綠素濃度(mg/L)=13.70OD665-5.76OD649

注:公式中的系數單位為mg/L。

1.2.5類胡蘿卜素濃度的測定取藻液30 mL,過濾,將藻絲重新懸浮于20 mL蒸餾水中,反復凍融三次使藻細胞完全破碎。將藻液加蒸餾水定容至25 mL,混勻。取2.5 mL液體,置于50 mL離心管中,加入22.5 mL無水丙酮,加塞,避光放置30 min以提取色素。溶液經濾紙過濾,濾液即為光合色素提取液,測定其在440、644、662 nm處的OD值,根據公式計算類胡蘿卜素濃度[13]:

類胡蘿卜素濃度(mg/L)=4.7×OD440-(1.38×OD662+5.48×OD644)

注:公式中的系數單位為mg/L。

1.2.6藻膽蛋白濃度的測定取藻液30 mL,經1500目篩絹過濾,用20 mL磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L,pH6.8)沖洗藻絲使其重懸浮,-20 ℃冷凍1 h后置于43 ℃水浴鍋中10 min,反復凍融三次使細胞完全破碎,經超聲波細胞粉碎機破碎5 min,室溫下6000 r/min離心5 min,取上清液測量其在652 nm和615 nm處的OD值,根據公式計算藻藍蛋白和別藻藍蛋白的濃度[13-14]:

藻藍蛋白濃度(mg/L)=(OD615-0.208OD652)/5.34

別藻藍蛋白濃度(mg/L)=(OD652-0.208OD615)/5.09

注:公式中的系數單位為mg/L。

1.2.7數據處理應用SPSS16.0軟件進行ANOVA方差分析。

2　結果與討論

2.1Ca2+濃度對細胞形態的影響

表1為節旋藻在不同濃度的Ca2+條件下的細胞寬度、螺徑及螺距記錄表。從表中可以看出,當Ca2+濃度低于0.04 g/L時,節旋藻的細胞寬度、螺徑和螺距均隨Ca2+濃度的增加而增加;當Ca2+濃度在0.04～0.06 g/L時,隨著Ca2+濃度的升高,三者有所下降;當Ca2+濃度在0.06～0.08 g/L時,螺徑和螺距均呈上升趨勢,而細胞寬度略微下降;當Ca2+濃度在0.08～0.10 g/L時,螺徑和螺距略微減小,但細胞寬度增加;當Ca2+濃度在0.10～0.12 g/L時,藻細胞寬度減小,而螺徑和螺距增加;當Ca2+濃度超過0.12 g/L時,螺徑和螺距隨Ca2+濃度的增加而持續下降。對于藻細胞寬度,當Ca2+濃度在0.12～0.16 g/L時,細胞寬度增加;而當Ca2+濃度在0.16～0.20 g/L時,細胞寬度減小。三者的方差分析均為顯著。總體來說,節旋藻螺徑和螺距的變化趨勢相同,二者同細胞寬度的變化趨勢略有不同。

鈣作為節旋藻生長過程中所需的營養素,是構成細胞的重要物質。另外,Ca2+會使細胞膜厚度變薄。因此當Ca2+濃度低于0.04 g/L時,滿足節旋藻的生長需要,細胞寬度增加;而超過所需濃度后對細胞膜造成傷害,細胞壁也不穩定,所以藻細胞寬度變小;隨著細胞外Ca2+濃度的增加,通過胞內鈣信號系統感受濃度變化,從而調節Ca2+濃度回到正常水平,此時細胞寬度再次增加,超過某一范圍時鈣信號系統發揮調節作用。另外,節旋藻的形態特征與環境因子和光照輻射有關系。低濃度Ca2+(<0.04 g/L)范圍內,隨著Ca2+濃度增加,藻體生長,螺徑和螺距增加;當Ca2+濃度繼續增加,藻體生長受到抑制,所占空間體積縮小,此時螺徑和螺距明顯縮短。隨著抑制的解除,藻體再次生長,螺徑和螺距隨之增加,到達一定量時,由于藻體之間互相產生遮擋,影響對營養物質和光照的吸收,所以生物量降低,而節旋藻的螺徑和螺距也在下降。而Ca2+濃度超過0.12 g/L時,沒有出現再次上升的現象。由于節旋藻螺旋結構的變化與諸多因素有關,也可能通過光合作用而影響形態特征,具體的原因需要進一步的實驗驗證。

表1　Ca2+濃度對細胞形態的影響(μm)

注:圖中標注不同字母(a、b、c等)的表示均值間差異顯著(p<0.05)。

2.2不同濃度鈣離子對節旋藻生物量的影響

不同Ca2+濃度條件下節旋藻在560 nm處的吸光值見圖1。由圖可知,當Ca2+濃度處于0.02～0.04 g/L的范圍內,隨著Ca2+濃度的增大生物量也增加;當Ca2+濃度超過0.04 g/L時,生物量明顯呈下降趨勢,Ca2+濃度為0.06 g/L時,生物量處于最低值;而Ca2+濃度處于0.06～0.08 g/L時,生物量迅速上升;當Ca2+濃度處于0.08～0.10 g/L時,生物量明顯又降低;當Ca2+濃度處于0.10～0.14 g/L時,生物量呈現明顯的先上升后下降的趨勢;當Ca2+濃度超過0.14 g/L繼續增加Ca2+濃度達0.20 g/L時,節旋藻的生物量持續下降。生物量在0.08、0.12 g/L時處于相對較高的值,OD560 nm分別為1.193、1.217,生物量在0.06 g/L時處于較低值0.789。方差分析結果表明Ca2+濃度對節旋藻的生物量有顯著影響(p<0.05)。

圖1　不同濃度Ca2+下的560 nm吸光值Fig.1　The absorbance at 560 nm of different concentrations of Ca2+

一方面,Ca2+是控制生命體生長的重要信號因子。在細胞分化過程中,通過Ca2+信號蛋白調控細胞分化,從而控制生命體生長[15]。另一方面,生物大量利用水體中的碳源進行光合作用,在生成有機碳的同時,形成碳酸鈣沉積附著在藻體表面[16],從而對胞內Ca2+濃度起到調節作用,調控藻細胞生長。此外,藍藻可以通過放出胞內和吸收胞外Ca2+的轉運方式來感應和區分環境刺激調節細胞內Ca2+濃度[17],以使細胞能更好適應外部Ca2+環境。因此根據本研究結果可以推測,在較低Ca2+時,控制節旋藻生長的信號分子不足,生物量積累緩慢,隨著Ca2+濃度的升高至合適水平,節旋藻生長量達到一定值,繼而隨著Ca2+濃度的升高,細胞吸收過多鈣后,也會干擾細胞的正常生理代謝活動,影響細胞的生長,生物量明顯降低。而Ca2+濃度較高時,節旋藻的環境適應機制發揮作用,調節細胞內Ca2+濃度,促進細胞分化作用,生長得以部分恢復[18]。從圖中看出,Ca2+濃度在0.04～0.14 g/L時,節旋藻的生物量變化比較劇烈。當Ca2+濃度超過0.14 g/L時,Ca2+以碳酸鈣沉淀的形式存在,不再對生物量產生較大的影響。

2.3不同濃度Ca2+對節旋藻光合色素的影響

不同濃度的Ca2+對節旋藻TJSD091藻株葉綠素、類胡蘿卜素與藻膽蛋白濃度的影響見圖2至圖4。

由圖2可知,葉綠素的濃度變化趨勢與生物量的變化相似。當Ca2+濃度低于0.04 g/L時,葉綠素濃度升高;當Ca2+濃度超過0.04 g/L時,葉綠素濃度顯著下降;當Ca2+濃度為0.06 g/L時,葉綠素濃度達到最低值;隨后Ca2+濃度增加到0.08 g/L,葉綠素濃度達到最高值;當Ca2+濃度增加到0.10 g/L時,葉綠素濃度陡然下降;當Ca2+濃度在0.10～0.14 g/L之間時,葉綠素濃度呈現先上升再下降的趨勢;當Ca2+濃度超過0.14 g/L時,葉綠素濃度略有回升,然后出現下降趨勢,葉綠素在0.08 g/L時為最大值,此時的濃度為16.13 mg/L,在濃度0.06 g/L時為最低值為5.149 mg/L。方差分析結果表明,不同濃度的Ca2+條件下葉綠素的濃度變化顯著(p<0.05)。

圖2　不同濃度Ca2+條件下的葉綠素濃度Fig.2　The concentration of chlorophyll in different concentrations of Ca2+

葉綠素是一類與光合作用有關的必需色素物質。葉綠素從光中吸收能量,然后能量被用來將二氧化碳轉變為碳水化合物。葉綠素的合成必須有一定的營養元素,鎂是葉綠素的重要組成成分。鈣對葉綠素的合成過程無直接的影響,但通過影響其他營養素的吸收也間接影響葉綠素的合成。例如Ca2+過量后對其他元素如鎂的吸收產生了拮抗作用,因此導致鎂元素吸收不足,進而導致葉綠素的合成過程受阻,含量有所下降[19]。而且葉綠素的生物合成過程中有酶的參與,Ca2+通過影響相關酶的活性從而抑制葉綠素的合成,導致葉綠素的濃度下降。有研究認為,細胞內較高的Ca2+濃度會破壞細胞骨架和細胞膜的結構,影響以Ca2+為基礎的能量代謝[20],這或許也是影響葉綠素含量的重要因素。

圖3為節旋藻的類胡蘿卜素濃度隨Ca2+濃度的變化趨勢圖。相對于葉綠素濃度的變化過程,當Ca2+濃度處于0.02～0.08 g/L時,類胡蘿卜素的濃度也呈現上升-明顯下降-迅速上升的過程。不同的是,當Ca2+濃度超過0.08 g/L時,類胡蘿卜素的濃度依然有所上升;而Ca2+濃度處于0.10～0.12 g/L時,類胡蘿卜素的濃度明顯下降;隨著Ca2+濃度繼續上升,類胡蘿卜素的濃度也隨之升高,但當Ca2+濃度處于0.14～0.16 g/L時,類胡蘿卜素的濃度再次迅速下降;當Ca2+濃度處于0.16～0.20 g/L時,類胡蘿卜素的濃度呈現明顯的先上升再下降的趨勢。方差分析發現不同濃度的Ca2+條件下類胡蘿卜素的濃度變化顯著(p<0.05)。當Ca2+濃度不超過0.08 g/L時,類胡蘿卜素的濃度變化同葉綠素一致,均為上升-下降-再上升的趨勢;但當Ca2+濃度超過0.08 g/L時,類胡蘿卜素的濃度變化呈現出與葉綠素濃度變化相反的趨勢。類胡蘿卜素在0.02、0.04、0.08、0.10、0.14 g/L時含量處于較高值,濃度分別為0.263、0.264、0.257、0.264、0.268 mg/L,在濃度0.06 g/L時取得最小值,為0.193 mg/L。

圖3　不同濃度Ca2+條件下的類胡蘿卜素濃度Fig.3　The concentration of carotenoid in different concentrations of Ca2+

類胡蘿卜素作為藻類光合作用中的重要色素,不僅吸收部分光能,還能清除活性氧,具有抗氧化功能,從而保護光合作用的正常進行。在逆境時,類胡蘿卜素含量的增加提高藻類的抵抗能力[21]。本實驗中,當Ca2+濃度在0.08～0.10 g/L時,葉綠素濃度下降明顯,但類胡蘿卜素濃度卻仍在上升,表明藻株具有抗逆境脅迫的能力。

圖4為節旋藻的藻藍蛋白與別藻藍蛋白濃度的變化趨勢圖。從圖中可以明顯看出,當Ca2+濃度為0.02 g/L時,藻藍蛋白和別藻藍蛋白的濃度均為最高值;當Ca2+濃度處于0.02～0.08 g/L時,二者均為先下降再上升后下降的過程;當Ca2+濃度處于0.08～0.10 g/L時,藻藍蛋白濃度上升,但別藻藍蛋白濃度有所下降;當Ca2+濃度處于0.10～0.12 g/L時,藻藍蛋白濃度上升,別藻藍蛋白的濃度大幅度上升;在0.12 g/L時,二者均達到較高的濃度;當Ca2+濃度超過0.12 g/L后,別藻藍蛋白的濃度隨著Ca2+濃度的增加不斷下降;對于藻藍蛋白濃度,當Ca2+濃度處于0.12～0.14 g/L時,濃度有所下降,而當Ca2+濃度處于0.14～0.18 g/L時,濃度一直在增加,當Ca2+濃度超過0.18 g/L后,藻藍蛋白濃度下降,在0.20 g/L時為最低值。所以,當Ca2+濃度分別為0.02、0.12 g/L時,藻藍蛋白和別藻藍蛋白均處于一個相對較高的濃度值,藻藍蛋白濃度分別為7.607、6.962 mg/L,別藻藍蛋白的濃度分別為5.608和5.247 mg/L,另外藻藍蛋白濃度在0.18 g/L時也處于一個較高的值7.010 mg/L。

圖4　不同濃度Ca2+條件下的藻藍蛋白和別藻藍蛋白濃度Fig.4　The concentrations of PC and APC in different concentrations of Ca2+

藍藻中的藻膽素是藻類主要的光合色素,常與蛋白質結合為藻膽蛋白,分布在類囊體的外表面,具有收集和傳遞光能的作用。當Ca2+以碳酸鈣的形式附著在細胞表面時,影響細胞對營養素的吸收過程,因而對藻膽蛋白的合成產生阻礙作用[22]。

3　結論

從各項指標的分析結果可知,在不同質量濃度的Ca2+條件下,節旋藻的形態特征、生物量、葉綠素、類胡蘿卜素及藻膽蛋白濃度均有顯著變化(p<0.05)。生物量在0.08、0.12 g/L時處于相對較高的值,OD560 nm分別為1.193、1.217;葉綠素在0.08 g/L時為最大值,此時的濃度為16.13 mg/L;類胡蘿卜素在0.02、0.04、0.08、0.10、0.14 g/L時含量處于較高值,濃度分別為0.263、0.264、0.257、0.264和0.268 mg/L;對于藻膽蛋白而言,Ca2+在0.02、0.12 g/L時濃度最高,藻藍蛋白濃度分別為7.607、6.962 mg/L,別藻藍蛋白的濃度分別為5.608、5.247 mg/L;而且藻藍蛋白濃度在0.18 g/L時也處于較高值,即7.010 mg/L。

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Effects of Ca2+on the growth and content of photosynthetic pigment ofArthrospira

CHEN Jin,WANG Su-ying,SUN Hong,DONG Shi-rui*

(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology,College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce,Tianjin 300134,China)

To investigate the effect of Ca2+on biomass,the content of chlorophyll,carotenoid and phycobiliproteins ofArthrospira,Arthrospirastrain TJSD091 was taken as the research object in this experiment,different concentrations of Ca2+was added in AB liquid culture medium respectively,and the biomass,the content of chlorophyll,carotenoid and phycobiliproteins at the end of the rapid growth period ofArthrospirawere determined. The results showed that when the concentration of Ca2+was 0.02 g/L,the PC and APC were the highest,which were 7.607 mg/L and 5.608 mg/L respectively.When the concentration of Ca2+was 0.06 g/L,the biomass,content of chlorophyll and carotenoid were relatively low,which were A560 nm=0.789,5.149,0.193 mg/L respectively.When the concentration of Ca2+was 0.08 g/L,the biomass,content of chlorophyll and carotenoid were relatively high,which were A560 nm=1.193,16.13,0.257 mg/L respectively.The variance analysis showed that the concentration of Ca2+had a significant effect on the biomass and the contents of chlorophyll,carotenoid and phycobiliprotein(p<0.05).

Ca2+;Arthrospira;biomass;chlorophyll;carotenoid;phycobiliprotein

2015-09-02

陳瑾(1991-),女,碩士研究生,研究方向:微生物資源開發與利用,E-mail:398358677@qq.com。

董世瑞(1973-),男,博士,副教授,研究方向:食品科學,E-mail:dongshirui@163.com。

國家自然科學基金項目(31270050);天津市教委高等學校科技發展基金計劃項目(20130624);天津市高等學校創新團隊(TD12-5049)。

TS254.2

A

1002-0306(2016)11-0126-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.018