復合酶二次酶解法制備紫菜多肽原液及其ACE抑制活性的研究

雷桂潔,蘇國成,2,江曉穎,周常義,2,劉靜雯,李　健,2,4,*

(1.集美大學食品與生物工程學院,福建廈門 361021；2.廈門市食品科技研發檢測中心,福建廈門361021；3.廈門中集信檢測技術有限公司,福建廈門 361021；4.廈門市海洋功能食品重點實驗室,福建廈門 361021)

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復合酶二次酶解法制備紫菜多肽原液及其ACE抑制活性的研究

雷桂潔1,蘇國成1,2,江曉穎3,周常義1,2,劉靜雯1,李健1,2,4,*

(1.集美大學食品與生物工程學院,福建廈門 361021；2.廈門市食品科技研發檢測中心,福建廈門361021；3.廈門中集信檢測技術有限公司,福建廈門 361021；4.廈門市海洋功能食品重點實驗室,福建廈門 361021)

壇紫菜用粉碎、研磨、蛋白酶酶解處理法提取多肽,考察了破碎酶解法對蛋白質含量、蛋白質提取率、ACE抑制率的影響;多肽提取物采用脫腥處理,考察了β-環糊精對腥味的影響;多肽提取物采用殺菌處理,考察了殺菌對感官指標、菌落總數和ACE抑制率的影響。結果發現,壇紫菜經粉碎、研磨、蛋白酶酶解處理后蛋白質含量和蛋白質提取率得到顯著提高,ACE抑制率也得到一定程度的提高。不同蛋白酶酶解效果差異較大,其中以胰蛋白酶和堿性蛋白酶進行復合酶二次酶解的效果較好,蛋白質提取率達85.22%,ACE抑制率達93.51%。提取物添加1.5%β-環糊精具有較好的脫腥效果。提取物經滅菌后仍有較好的ACE抑制作用。

壇紫菜,復合酶二次酶解,蛋白質提取率,ACE抑制率

壇紫菜盛產于福建,是我國特有的暖溫帶性經濟藻類,其在福建的年產量至2010年時已接近全國總產量一半[1]。目前紫菜的加工仍處于初級階段,主要產品為干制品,經濟價值不高。紫菜含有豐富的營養成分,干紫菜中含有蛋白質(25%～50%)、多糖(20%～40%)、脂肪(1%～3%)、灰分(7.8%～26.9%)和多種維生素[2],是理想的保健食品原料。紫菜提取物具有降血糖[3]、降血壓[4]、抗腫瘤[5]、抗衰老[6]等多種生理活性,其中紫菜多肽的降血壓活性成為研究的熱點之一。由于紫菜細胞壁難以被破壞,人體不能充分消化吸收紫菜的營養成分。因此,研究者們采用不同的方法進行破壁提取紫菜內容物。肖海芳等[7]比較了反復凍融法、溶脹法、低鹽濃度法和超聲波法對條斑紫菜藻紅蛋白提取效果的影響,鄭惠彬等[8]用纖維素酶和木瓜蛋白酶聯合處理壇紫菜,較大地提高了蛋白質提取率和固形物得率等特性,鄭溫翔等[9]利用納豆芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌對紫菜進行發酵,并結合木瓜蛋白酶酶解的方法,較大地提高了蛋白質提取率。本文采用粉碎、研磨、蛋白酶酶解分別或聯合處理壇紫菜,并對提取物進行脫腥、殺菌處理,考察了提取物的蛋白質含量、蛋白質提取率、血管緊張素轉移酶抑制率、提取物的感官指標和細菌菌落,優化了降血壓活性的紫菜多肽原液制備工藝,為紫菜的深加工提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

壇紫菜干制品集美菜市場;木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、新風味酶南寧龐博生物工程有限公司;胰蛋白酶廈門仁馳化工有限公司;胃蛋白酶鄭州超凡化工有限公司;馬尿酰-組氨酰-亮氨酸水合物、血管緊張素轉移酶(來源于兔肺)Sigma公司;β-環糊精郁南縣永光環狀糊精有限公司;其他試劑均為國產分析純。

電熱恒溫鼓風干燥箱上海精宏實驗設備有限公司;高速藥物粉碎機青州市精誠機械有限公司;實驗室臥式砂磨機上海索廷機電設備有限公司;電熱恒溫水浴鍋上海精宏實驗設備有限公司;pH計北京賽多利斯科學儀器有限公司;冷凍離心機Thermo公司;Quawell Q5000微量核酸測定儀Quawell Technologylnc 公司;

1.2實驗方法

1.2.1測定指標蛋白質含量的測定依據GB 50095-2010中的第一法凱氏定氮法測定[10]。蛋白質提取率按下式計算:

蛋白質提取率(%)=m1/m2×100

式中,m1為上清液中的蛋白質含量(g),m2為原料中的蛋白質含量(g)。

ACE抑制率的測定參考Cushman and Cheung[11]的方法加以調整,并按下式計算:

ACE抑制率(%)=[a-(b-d)]/(a-c)×100

式中,a為無抑制劑管的吸光值,b為含抑制劑管的吸光值,c為空白對照管的吸光值,d為抑制劑空白管的吸光值。

菌落總數的測定依據GB 47892-2010[12]菌落總數。

1.2.2干紫菜粉的制備將壇紫菜在50 ℃下烘2 h,放入高速粉碎機中粉碎,紫菜放入量約為粉碎腔體積的4/5,粉碎5次,每次約2 s。

1.2.3紫菜研磨工藝的確定分別按料水比1∶15、1∶25的比例將干紫菜粉在4 ℃下過夜浸泡,研磨,轉速為2000 r/min,每隔20 min取出一批研磨樣品,一共取4次,冷凍離心(15000×g,4 ℃,30 min),取上清棄沉淀,觀察上清的色澤及物性,并測定其蛋白質含量,計算蛋白質提取率。

1.2.4紫菜酶解工藝的確定

表1　七種蛋白酶的基本信息

1.2.4.1不同料水比對酶解效果的影響按料水比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的比例將干紫菜粉與水混合均勻,加入2.5%的木瓜蛋白酶,在其最適溫度和最適pH下酶解5 h,在沸水浴中滅酶10 min,冷凍離心(8000×g,15 min,4 ℃),取上清,棄沉淀。另設一組,按料水比1∶15加酶量1.5%的比例加入水和木瓜蛋白酶,在其最適溫度和最適pH下酶解3 h,冷凍離心,收集上清,保留沉淀,按料水比1∶10加酶量1.0%的比例向沉淀物中加入水和木瓜蛋白酶使之重懸,在其最適溫度和最適pH下酶解2 h,冷凍離心,取上清,棄沉淀,合并兩次得到的上清液。測定以上五組所得上清液的蛋白質含量,并計算蛋白質提取率。本文中料水比和加酶量均以干紫菜粉重量計。

1.2.4.2七種蛋白酶酶解效果的比較選取A-F七種蛋白酶在其各自最適溫度和最適pH條件下進行二次酶解實驗。第一次酶解的料水比為1∶15,加酶量為1.5%,酶解時間為3 h,第二次酶解的料水比為1∶10,加酶量為1.0%,酶解時間為2 h,合并兩次酶解得到的上清液,棄去沉淀,將上清液在沸水浴中滅酶10 min,冷凍離心(8000×g,15 min,4 ℃),取上清,棄沉淀。分別測定以上七組所得的上清液中的蛋白質含量,計算蛋白質提取率,并測定ACE抑制率。

1.2.4.3雙酶復合酶解效果的比較同時作用:按A+B、A+C、A+D、A+E、A+F,分成五組實驗組進行二次酶解實驗,兩次酶解時添加的復合酶比例均為1∶1。先后作用:按A+B、A+C、A+D、A+E、A+F,分成五組實驗組進行二次酶解實驗,第一次酶解時均添加蛋白酶A,第二次酶解時分別添加蛋白酶B-F。同時以A+A作為對照實驗組。

第一次酶解時,將紫菜勻漿作為酶解底物,加酶量為1.5%,酶解時間為3 h,第二次酶解的料水比為1∶10,加酶量為1.0%,酶解時間為2 h,合并兩次酶解得到的上清液,棄去沉淀,將上清液在沸水浴中滅酶10 min,冷凍離心(8000×g,30 min,4 ℃),取上清,棄沉淀。分別測定以上所得的上清液中的蛋白質含量,計算蛋白質提取率,并測定ACE抑制率。

表3　不同研磨條件下的色澤和物性

1.2.4.4復合酶二次酶解正交優化將優選出的復合酶組合進行正交優化,確定最優的酶解工藝，酶解時間和酶用量見表2。

表2　復合酶(A+D)二次酶解L9(34)因素水平表

1.2.5脫星工藝的確定選取β-環糊精作為腥味掩蔽劑,按伍宏等[13]方法進行實驗和評價。

1.2.6殺菌工藝的確定將經酶解的紫菜上清液按以下方式處理:不殺菌處理、90 ℃恒溫15 min、100 ℃恒溫10 min、120 ℃恒溫3 min、130 ℃恒溫1 min,觀察處理后的紫菜液的色澤及狀態,測定菌落總數,冷凍離心后測定ACE抑制率。

2　結果與分析

2.1紫菜研磨工藝的確定

由圖1可知,隨著研磨時間的延長,上清液的蛋白質含量和蛋白質提取率呈上升的趨勢。料水比為1∶25時增幅較小,蛋白質含量由原來的0.49%增加到0.64%,蛋白質提取率由原來的24.57%增加到31.79%。料水比為1∶15時增幅較大,蛋白質含量由原來的0.69%增加到1.28%,蛋白質提取率由原來的21.88%增加到38.07%。

圖1　研磨對蛋白質指標的影響Fig.1　Effect of grinding on the content and extraction rate of protein

蛋白質含量和蛋白質提取率越高,酶解時得到的多肽含量相對越多,因此研磨時的料水比選取1∶15。盡管圖1中在80 min時仍有上升的趨勢,但由表3可知,隨著研磨時間的延長,紫菜勻漿流動性變差,物料循環速度緩慢,考慮到制備時的時間、電力等成本,研磨時間選取80 min。

紫菜藻膽蛋白在研磨時高剪切作用力下發生變性,蛋白結構伸展交聯,使得溶液粘稠度增加流動性減弱,此外,紫菜溶液的顏色是由藻膽蛋白的四種發色基綜合體現的,這四種發色基是僅雙鍵位置不同的同分異構體,即藻紅膽素(PEB)、藻藍膽素(PCB)、藻尿膽素(PUB)和phycobiliviolin(PXB)[14]。高剪切作用力還可能導致藻膽蛋白的發色團共價鍵位置轉移,使得溶液顏色發生變化。

2.2紫菜酶解工藝的確定

2.2.1不同料水比對酶解效果的影響由圖2可知,單次酶解時,隨著料水比的減小,蛋白質含量逐漸減小,蛋白質提取率逐漸增加并趨于平緩。水量的增加雖然稀釋了蛋白質肽,使得上清液中蛋白質含量減小,但沉淀物中截留的蛋白質肽也減少,使得提取出來的蛋白質肽盡可能地轉移至水相,從而提高了蛋白質提取率。總料水比同為1∶25時,1∶15+1∶10二次酶解與1∶25單次酶解相比,蛋白質含量提高了23.46%,達到1.00%,蛋白質提取率提高了18.72%,達到57.13%。原因是第二次酶解可以進一步將沉淀物殘渣中的蛋白質酶解提取出來,還能將沉淀物截留的蛋白質肽轉移至水相。因此,酶解時選取料水比1∶15+1∶10二次酶解法。

圖2　料水比對蛋白質指標的影響Fig.2　Effect of ratio of material to water on the content and extraction rate of protein

2.2.2七種蛋白酶酶解效果的比較由圖3可知,七種蛋白酶的酶解效果差異較大,其中最適pH在偏中堿性范圍內的蛋白酶酶解效果較好,蛋白質含量均在1%以上,蛋白質提取率均在50%以上。在這些蛋白酶中又以胰蛋白酶的酶解效果最好,蛋白含量達到1.27%,蛋白質提取率達到72.54%,比未經酶解的紫菜上清液的蛋白含量和蛋白質提取率都提高了2倍。最適pH在2.0的胃蛋白酶的酶解效果最差,蛋白含量僅0.25%,蛋白質提取率僅14.22%,比未經酶解的紫菜上清液的蛋白含量和蛋白質提取率都降低,原因是紫菜蛋白在pH2.0時已經發生變性聚沉,不能充分與胃蛋白酶接觸而觸發酶解反應,只有少部分蛋白質肽溶解,因而上清液中的蛋白質含量減少。

圖3　酶種類對蛋白質指標的影響Fig.3　Effect of protease on the content and extraction rate of protein

降壓肽抑制ACE酶活性主要與兩個因素有關,即多肽分子量和多肽的氨基酸組成結構。活性較強的降壓肽分子量一般在1500 u以下,多為3～6肽[4],有學者提出降壓肽結構模型假說[15],假說認為當肽的C端為芳香族氨基酸或Pro時,或N端為疏水性氨基酸或堿性氨基酸時,其抑制活性較高。

卡托普利(Captopril)是一種ACE抑制劑,被應用于治療高血壓和某些類型的充血性心力衰竭。本實驗選用1 mg/mL的卡托普利溶液作為陽性對照,其ACE抑制率為83.39%。

由圖4可知,經七種蛋白酶酶解后的紫菜上清液均對ACE酶有較強的抑制作用,抑制率在75%以上,均比只經浸泡和研磨的紫菜上清液的ACE抑制率有提高,其中以經木瓜蛋白酶酶解的紫菜上清液的抑制率最高,達到完全抑制的作用。表明了紫菜中本身含有部分降壓肽,經蛋白酶酶解后產生了更多的降壓肽。七種蛋白酶對蛋白質的作用位點不同,且作用位點廣泛,因此得到的蛋白質肽的種類很多,其中包括了多種降壓肽,其含量、分子量、組成結構均不同,具體為何種降壓肽在起作用,需要對其進一步分離純化鑒定結構才可知。

圖4　酶種類對ACE抑制率的影響Fig.4　Effect of protease on ACE inhibitory activity

對于蛋白質含量、蛋白質提取率,胰蛋白酶的作用效果顯然最好,對于ACE抑制效果,胰蛋白酶的抑制率達到93.41%,接近100%,綜合考慮三項指標,選取胰蛋白酶為最優酶。

2.2.3雙酶復合酶解效果的比較經研磨、胰蛋白酶(A+A)酶解處理得到的紫菜上清液中蛋白質含量達1.03%,蛋白質提取率達82.12%,比未經研磨、僅A+A酶解處理得到的紫菜上清液蛋白質提取率提高了13.20%。

由圖5可知,當兩種不同蛋白酶同時進行酶解時,得到的紫菜上清液中的蛋白質含量和蛋白質提取率均比只用一種蛋白酶(A+A)時明顯減小,因為兩種不同蛋白酶的最適酶解條件不同,且其本質是蛋白質,在同一酶解條件下,兩種蛋白酶同時作用會互相干擾,使得酶解效果明顯下降。而當兩種不同蛋白酶先后進行酶解時,得到的紫菜上清液中的蛋白質含量和蛋白質提取率與只用一種蛋白酶(A+A)時基本相同,其中以胰蛋白酶和堿性蛋白酶復合(A+D)的效果較好,蛋白質含量達1.06%,提高了2.90%,蛋白質提取率達84.10%,提高了2.40%。

圖5　復合酶作用對蛋白質含量(a)和蛋白質提取率(b)的影響Fig.5　Effect of enzymolysis with composite protease on the content(a)and extraction rate(b)of protein

由圖6可知,當兩種不同蛋白酶先后進行酶解時,得到的紫菜上清液的ACE抑制率與只用一種蛋白酶(A+A)時基本相同,均在80%～90%之間,復合酶作用較單酶作用幾乎沒有提高。

表4　復合酶(A+D)二次酶解L9(34)正交實驗結果

注：*表示在蛋白質指標的方差分析中B因素具有顯著性。

圖6　復合酶作用對ACE抑制率的影響Fig.6　Effect of enzymolysis with composite protease on ACE inhibitory activity

以上六組經研磨后的單酶酶解或復合酶酶解所得到的紫菜上清液的蛋白質提取率均比未經研磨、僅A+A酶解處理得到的紫菜上清液蛋白質提取率有所提高,但是ACE抑制率有所下降,可能是經研磨后紫菜細胞壁破壞程度增加,細胞內的蛋白質更充分的溶于水中并與蛋白酶接觸,酶解效果加強,蛋白質提取率得到提高,而部分降壓肽因酶解過度轉化成氨基酸,使得ACE抑制作用有所降低,但仍然保持較高的ACE抑制活性。因此,綜合考慮三項指標,選取胰蛋白酶和堿性蛋白酶(A+D)作為最優復合酶。

2.2.4復合酶二次酶解正交優化將優選出的復合酶組合(A+D)按先后作用的方式進行正交優化,酶解環境為其最適溫度和pH,結果見表4。

由表4可知,對于蛋白質含量,優組合為A1(2)B3C1(3)D2(3),而實驗組實際最優組合為A1B3C3D3和A2B3C1D2,因素主次順序為B>D>A(C),B因素具有顯著性。對于蛋白質提取率,優組合為A3B3C3D3,而實驗組實際最優組合為A1B3C3D3,因素主次順序為B>A>D>C,B因素具有顯著性。對于ACE抑制率,優組合為A1B2C3D2(3),而實驗組實際最優組合為A1B2C2D2,因素主次順序為A>B>C>D,無顯著性因素。

綜合考慮三項指標及成本因素,優水平應控制在A1C3D2,又因在ACE抑制率指標中B因素不顯著,而蛋白質指標中B因素顯著,因此控制在B3水平,得優組合A1B3C3D2,即第一次酶解時,胰蛋白酶的酶解時間為2 h,添加量為2%,第二次酶解時,堿性蛋白酶的酶解時間為3 h,添加量為1%。在此條件下進行驗證實驗,測得酶解液的蛋白質含量為1.25%,蛋白質提取率為85.22%,ACE抑制率為93.51%,與正交實驗的最優值接近,因此選取A1B3C3D2作為復合酶(A+D)的最優酶解工藝。

2.3脫腥工藝的確定

藻類的腥味成分主要是萜烯類化合物、胺類物質及吡啶類物質[16]。β-環狀糊精是海產品加工中經常選用的脫腥劑,具有內部疏水、外部親水的環狀結構。疏水性的腥味有機物易被β-環狀糊精的環內疏水部分吸附,形成包結物,達到遮掩腥異味效果。

由圖7可知,當β-環糊精添加量為1.5%時,紫菜液的脫腥效果較好,這與吳克剛等[17]、姚興存等[18]和伍宏等[13]的結果相近。因此選取1.5%作為最適添加量。

圖7　β-環糊精添加量對脫腥效果的影響Fig.7　Effect of β-cyclodextrin dosage on removing fishy

2.4殺菌工藝的確定

由表5可知,隨著殺菌溫度的提高,紫菜液褐變的程度逐漸加深,由于紫菜液含有高濃度的蛋白質肽和多糖,經熱殺菌處理后會發生美拉德反應,使溶液褐變。此外,經高壓殺菌后紫菜液中的細菌能夠被完全滅活,但是會產生少量沉淀,而經常壓殺菌后紫菜液中仍有少量細菌存活,不利于貯存,但溶液不會產生沉淀。因此選取120 ℃恒溫3 min作為殺菌條件。

表5　不同殺菌條件下的色澤、狀態和菌落總數

由圖8可知,在90、100 ℃這兩個常壓殺菌處理下的紫菜液的ACE抑制率較不殺菌處理的紫菜液有提高,可能是部分較大分子的多肽在此條件下受熱變性,多肽分子鏈展開,暴露出更多的具有抑制ACE酶的活性位點。而在120、130 ℃這兩個高壓殺菌處理下的紫菜液的ACE抑制率較常壓殺菌處里的紫菜液有下降,可能是部分ACE抑制肽在高壓高溫條件下活性基團被破壞。總體來看,紫菜液的ACE抑制作用具有較好的熱穩定性。

圖8　殺菌條件對ACE抑制率的影響Fig.8　Effect of sterilization on ACE inhibitory activity

3　結論

壇紫菜經粉碎、研磨、蛋白酶酶解處理后,蛋白質含量和蛋白質提取率得到顯著提高,ACE抑制率也得到一定程度的提高,不同蛋白酶酶解效果差異較大,其中以胰蛋白酶和堿性蛋白酶進行復合酶二次酶解的效果較好,蛋白質提取率達85.22%,ACE抑制率達93.51%。表明粉碎、研磨、蛋白酶酶解處理可以較大程度地獲得具有一定降血壓功能的物質,經此處理的紫菜多肽原液可以作為制備降血壓功能保健食品的原料。添加1.5%β-環糊精具有較好的脫腥效果,可以為制作保健食品改善紫菜令人不愉快的風味。紫菜液經滅菌后仍有較好的ACE抑制作用,有利于降血壓功能保健食品的生產。

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Studies on preparation of the polypeptide extracts fromPorphyrahaitanensisby composite protease method and ACE inhibitory activity

LEI Gui-jie1,SU Guo-cheng1,2,JIANG Xiao-ying3,ZHOU Chang-yi1,2,LIU Jing-wen1,LI Jian1,2,4,*

(1.College of Food and Bioengineering,Jimei University,Xiamen 361021,China;2.Xiamen Food Techonology R&D and Testing Center,Xiamen 361021,China;3. Xiamen ISL Detection Technology Co.,Ltd,Xiamen 361021,China;4. Key Laboratory of Xiamen for Marine Functional Food,Xiamen 361021,China)

The content and extraction rate of protein,ACE inhibitory activity,sensory evaluation index and total plate count of extracts fromPorphyrahaitanensistreated by means of smash,grinding,protease hydrolysis,removing fishy and sterilization were investigated. It was found that the content and extraction rate of protein of laver extracts treated by means of smash,grinding and protease hydrolysis were increased observably and ACE inhibitory activity was also improved. It had great different effects on hydrolysis with various proteases. The results showed that extraction rate of protein reached 85.22% and ACE inhibitory activity was 93.51% using trypsin combined with alcalase,which was better than that with other protease. Besides,it had good removing fishy effects on extracts using 1.5%β-cyclodextrin. What’s more,it remains good ACE inhibitory activity of extracts treated by sterilization.

Porphyrahaitanensis;twice composite protease hydrolysis;extraction rate of protein;ACE inhibitory activity

2015-10-12

雷桂潔(1989-),女,碩士研究生,研究方向:食品科學,E-mail:m18359228479@163.com。

李健(1980-),男,博士,副教授,研究方向:天然活性物質、食品安全、食品生物技術,E-mail:lijian2013@jmu.edu.cn。

廈門市海洋經濟創新發展區域示范項目(14CZP047HJ21、13PZP002SF24);教育部留學回國人員科研啟動基金(201507030002);福建省教育廳中青年教師教育科研項目(JA15276)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)11-0141-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.021