有機氮源對出芽短梗霉發酵普魯蘭多糖的影響

馬賽箭,安　超,薛文嬌,常　帆,上官亦卿,丁　浩

(陜西省微生物研究所,陜西西安 710043)

?

有機氮源對出芽短梗霉發酵普魯蘭多糖的影響

馬賽箭,安超,薛文嬌*,常帆,上官亦卿,丁浩

(陜西省微生物研究所,陜西西安 710043)

以出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)CGMCC. 11062為出發菌株,研究了六種有機氮源對普魯蘭多糖產量、結構、純度及分子量的影響。結果表明:在不同有機氮源的發酵條件下,普魯蘭多糖產量由高到低依次為:酵母粉>牛肉膏>蛋白胨>胰蛋白胨>麥芽浸粉>尿素,其中以酵母粉為有機氮源時,普魯蘭多糖產量達到60.64 g/L;普魯蘭多糖的結構和純度受有機氮源種類的影響很小,相對穩定,表明該菌株能夠適用于各種有機氮源生產普魯蘭多糖,適合工業化生產;不同有機氮源所生成的普魯蘭多糖分子量由大到小的順序依次為:麥芽浸粉>牛肉膏>蛋白胨>胰蛋白胨>尿素>酵母,重均分子量范圍Mw在289039～604375 u之間,分子量分散指數在2.0～2.4。這些研究可為不同特性普魯蘭多糖的生產提供技術指導。

有機氮源,普魯蘭多糖,產量,純度,分子量

普魯蘭多糖是由出芽短梗霉(Aureobacidiumpullulans)發酵產生的細胞外純天然高分子多糖,是一種新型可降解生物材料。該多糖是以α-1,6-糖苷鍵連接的聚麥芽三糖,即3個葡萄糖以兩個α-1,4-糖苷鍵連接形成麥芽三糖,兩端再以α-1,6-糖苷鍵同另外兩個麥芽三糖結合形成高分子多糖,一般沒有分支結構,是直鏈多糖[1]。由于這種獨特的連接方式,使得普魯蘭多糖具有高度的結構柔韌性及良好的水溶性,制成的膜具有優異的阻氧性能,經過化學改性能夠改變其水溶性或提供活性反應基團。因此,普魯蘭多糖及其衍生物被廣泛地用于食品、醫藥、化工及電子等眾多領域,是一種具有極大開發價值和前景的多功能新型生物制品。

普魯蘭多糖的分子量在50～500 ku[2],主要受出芽短梗霉菌種差異、碳源種類、培養時間及發酵pH等因素的影響。目前,商業化的普魯蘭多糖的數均分子量大概在100～200 ku,重均分子量大概在362～480 ku,分子量分散指數一般在2.1～4.1之間[3-4]。分子量的分布范圍決定了普魯蘭多糖的應用范圍,例如30～90 ku大小的普魯蘭多糖分子片段可代替右旋糖酐作為血漿擴容劑[5-6]。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)CGMCC 11062,保藏于中國微生物菌種保藏中心。活化培養基(g/L):馬鈴薯去皮去芽眼,洗凈、切塊,稱200 g放入1000 mL蒸餾水中用文火煮沸30 min,雙層紗布過濾,濾液加水補至1000 mL,加20 g蔗糖,15 g瓊脂粉,121 ℃,20 min滅菌。種子培養基(g/L):葡萄糖50.0;MgSO4·7H2O 0.2;K2HPO45.0;酵母粉 1.7;(NH4)2SO40.6;NaCl 1.0;初始pH6.5,113～116 ℃,20 min滅菌。發酵培養基(g/L):蔗糖 50;MgSO4·7H2O 0.2;K2HPO45.0;(NH4)2SO40.6;NaCl 1.0,有機氮源(胰蛋白胨、牛肉膏、蛋白胨、麥芽浸粉、酵母粉、尿素)1.7。初始pH6.5,113～116 ℃,20 min滅菌。麥芽三糖標準品M106948-100 mg(阿拉丁),普魯蘭酶P1067-250U(Sigma),普魯蘭多糖標準品P4516-25G(Sigma),不同分子量普魯蘭多糖標準品(Mp范圍9.6-2560 ku,96351-1KT,05287-25MG,04661-25MG,Sigma)。

恒溫培養箱SPX-250北京科偉永興儀器有限公司;控溫搖床ZWY-2102上海智誠分析儀器制造有限公司;紫外可見分光光度計UV-1800島津;傅立葉變換紅外光譜儀Nicolet is 50Thermo Scientific;高效液相色譜儀(Waters 1515),示差檢測器(Waters 2414),凝膠色譜柱(UltrahydrogelTMLinear 7.8×300 mm column),預柱型號(UltrahyfrogelTM6×40 mm Guard Column)。

1.2培養方法

活化培養方法:將菌種在28 ℃恒溫培養箱培養5 d。

種子培養方法:將活化好的菌株接種在裝有50 mL種子培養液的250 mL三角瓶中,置于恒溫搖床上(230 r/min),28 ℃條件下培養48 h,即為種子液。

發酵培養方法:按照5%接種量將種子接種到裝有20%培養液的三角瓶中,置于恒溫搖床上(230 r/min),28 ℃條件下培養96 h。

1.3分析方法

1.3.1菌體生物量將發酵液30 mL裝入50 mL離心管中,8000 r/min,離心10 min,取沉淀于105 ℃干燥至恒重,生物量計算公式如下:

生物量(g/L)=(M實重-M空重)×1000/30

1.3.2普魯蘭多糖產量取上清液15 mL加入2倍體積的95%乙醇,4 ℃靜置12 h,8000 r/min離心10 min,收集沉淀,加水重溶,再次加入2倍體積95%乙醇進行沉淀,將沉淀于80 ℃烘至恒重,精確稱重,多糖含量計算公式如下:

多糖含量(g/L)=(M實重-M空重)×1000/15

1.3.3殘糖含量苯酚硫酸法[10]。

1.3.4結構測定應用傅里葉變換衰減全反射紅外光譜法(ATR-FTIR)直接測定制備獲得的普魯蘭多糖粉末[11]。

1.3.5純度測定利用普魯蘭酶酶解產物,使其成降解為還原糖麥芽三糖,然后利用DNS法測定麥芽三糖的含量,從而計算普魯蘭多糖的純度[12]。

1.3.6分子量測定利用高效液相色譜法(GPC)測定普魯蘭多糖分子量分布范圍。以0.1 mol/L NaNO3作為流動相,流速0.5 mL/mim,柱溫箱溫度35 ℃,樣品濃度1 g/L,進樣量20 μL,數據處理使用Waters自帶的Breeze軟件積分獲得[13]。

1.3.7數據統計分析使用SPSS軟件進行數據統計分析。

2　結果與分析

2.1有機氮源種類對出芽短梗霉發酵普魯蘭多糖的影響

圖1　有機氮源種類對普魯蘭發酵的影響Fig.1　The effects of organic nitrogen sources on pullulan by A. pullulans注:1.胰蛋白胨;2.牛肉膏;3.蛋白胨;4.麥芽浸粉;5.酵母粉;6.尿素。

由圖1可以看出,有機氮源的種類對普魯蘭多糖產量及底物碳源轉化率有顯著性影響,而對菌體的產量影響不顯著。其中,在以酵母粉為底物發酵時,普魯蘭多糖的產量最高,達到了60.64 g/L,其他依次分別為牛肉膏40.8 g/L、蛋白胨35.79 g/L、胰蛋白胨34.92 g/L、酵母浸粉30.56 g/L、尿素27.5 g/L;同時,以殘糖含量為考核指標,殘糖含量由小到大依次為酵母粉6.53 g/L、牛肉膏21.58 g/L、胰蛋白胨27.56 g/L、蛋白胨30.78 g/L、麥芽浸粉34.93 g/L、尿素42.12 g/L。有機成分比較復雜,除含有豐富的蛋白質、肽類、游離的氨基酸以外,還含有少量的糖類、脂肪和生長因子等,影響微生物的生長代謝及代謝產物合成。尿素雖然為有機氮源,但是其成分簡單,不含有微生物必需的氨基酸類。因此,在以尿素為有機氮源時,普魯蘭多糖的產量和底物的利用率都較低,這可能是由于缺乏微生物的必需氨基酸,導致微生物自主合成相關氨基酸及生長因子,進而延長了微生物的代謝周期。

2.2有機氮源種類對普魯蘭多糖結構的影響

目前研究多糖結構的方法有很多種,如紫外光譜、紅外光譜、核磁共振波譜、氣相色譜-質譜聯用以及多糖的分子修飾等。糖的紅外光譜技術起源于上世紀七十年代,由于紅外光譜技術的發展及糖化學的深入研究,紅外光譜成為糖結構研究的重要手段之一,主要用于不同糖的鑒別、吡喃糖和呋喃糖的識別、糖苷鍵及糖構型的確定、糖鍵上主要取代基的識別[14]。

紅外色譜分析的結果見圖2所示:六種不同有機氮源的培養液發酵合成的普魯蘭多糖樣品具有明顯的多糖特征吸收峰,與普魯蘭多糖標準品具有一致的紅外吸收。在3000～2800,1400～1200,1000～700 cm-1區域內顯示出特征的吸收峰。普魯蘭多糖在4000～400 cm-1范圍內大致可分為:3600～3200 cm-1出現一寬峰,是糖類存在的分子間或分子內的O-H伸縮振動產生的;3000～2800 cm-1存在吸收較弱的C-H的伸縮震動吸收峰;此兩組吸收峰是糖類的特征峰[15]。1400～1200 cm-1的吸收峰是由兩個C-O伸縮振動產生,其中一個屬于C-O-H,另一個是糖環C-O-C;1000～700 cm-1包含著糖類特征吸收峰,主要表現為糖的吡喃環的振動譜[16],圖譜的細微差別可能是由普魯蘭多糖的純度差異引起的。不同種類的有機氮源對普魯蘭多糖的結構未產生顯著性影響。

圖2　普魯蘭多糖標準品的紅外光譜曲線Fig.2　The curve on infrared ray spectreum of pullulan

2.3有機氮源種類對普魯蘭多糖純度的影響

本研究中利用DNS法測定麥芽三糖的標準曲線如圖3所示,在麥芽三糖濃度200～1000 mg/L范圍內,回歸方程Y=0.0008X+0.0386,R2=0.9951,具有很好的相關性。不同有機氮源對普魯蘭多糖純度的影響結果如表1所示,普魯蘭多糖的純度在95%～99%之間,純度較高,這可能與本研究使用的菌株有關。另外,本研究中選用蔗糖為底物、有機氮源、酒精都為試劑級,雜質較少,同時,采用搖瓶發酵方式、避免了攪拌式發酵罐機械攪拌造成的細胞破碎,同時,發酵周期比較短,出芽短梗霉細胞活力較高,自溶不明顯,離心效果好,上清液中胞內蛋白、細胞碎片等大分子殘留比較少,從而獲得的普魯蘭多糖純度較高。其次,二次酒精沉淀起到洗滌的目的,洗滌次數對提純得率和多糖純度均有一定的影響,多糖得率隨著洗滌次數的增加逐漸減少,而多糖純度隨洗滌次數的增加而增加,但兩者的變化幅度都不是很大,多次洗滌雖然可以提高多糖純度,但洗滌劑的用量及洗滌引起的多糖損失也會隨之增多。

圖3　麥芽三糖分光光度法測定標準曲線Fig.3　The standard curve of maltotriose spectrophotometry determination

項目胰蛋白胨牛肉膏蛋白胨麥芽浸粉酵母粉尿素純度(%)97.4898.3298.1295.8799.1695.21

2.4有機氮源對普魯蘭多糖分子量的影響

普魯蘭多糖的分子量決定了普魯蘭多糖的應用范圍及價值,高分子量的普魯蘭多糖更適用于商業用途。本研究中選用Sigma普魯蘭多糖分子量標準品,使用Waters 1515-2414(示差檢測器)檢測平臺,獲得了普魯蘭多糖分子量的標準曲線,如表2所示,分子量越大,出峰時間越早。通過GPC測定不同有機氮源條件下的普魯蘭多糖分子量大小,如圖4所示,生成的普魯蘭多糖分子量由大到小依次為:麥芽浸粉>牛肉膏>蛋白胨>胰蛋白胨>尿素>酵母粉。通過Waters GPC自帶的Breeze軟件,依據普魯蘭多糖分子量標準生成標準曲線,進而對不同有機氮源制備的普魯蘭多糖的分子量積分計算,具體參數見表3所示,其中以麥芽浸粉為有機氮源生產的普魯蘭多糖分子量最大,重均分子量Mw為604375 u,屬于高分子量的普魯蘭多糖制品,適用于水凝膠、藥物載體等領域,而以酵母粉為有機氮源生產的普魯蘭多糖分子量最低,重均分子量Mw為289039 u,與國內外同類產品的分子量相當。分散系數在2.0～2.4之間,相對較窄,這可能與發酵周期短,未被水解酶水解有關。

表3　有機氮源種類對普魯蘭多糖分子量分布的影響

表2　不同分子量普魯蘭多糖標準曲線測定

圖4　有機氮源種類對普魯蘭多糖分子量大小的影響Fig.4　The organic nitrogen on the influence of pullulan molecular weight size

3　討論

有關普魯蘭多糖發酵方面的研究主要集中在優化培養條件、縮短發酵時間、降低生產成本,提高產品純度以滿足食品、化妝品和醫藥品的需求,并提升產品附加值。普魯蘭多糖的純度主要受菌株類型、發酵方式及后處理工藝的影響。West和Strohfus[17]利用瓊脂和藻酸鈣珠固定化出芽短梗霉細胞發酵生產普魯蘭多糖,結果產生的普魯蘭多糖純度只有36%。可能是由于這些材料相對較小的孔徑阻礙了大分子普魯蘭多糖的釋放。于航[18]通過研究最終獲得普魯蘭多糖的產量約為20 g/L,提取得率為89.2%,最終產品純度為95.2%。Cheng[19]等人研究表明:75 g/L蔗糖,3 g/L酵母粉和5 g/L的硫酸銨組合下,普魯蘭多糖的產量最高,培養7 d后,收獲25.8 g/L的普魯蘭多糖,純度達到94.5%。高璇璇[20]等研究了脫色和干燥方式對普魯蘭多糖品質的影響,結果表明選用ZY-24×48-B型活性炭,添加量為1.0%(w/v)、pH5.0,時間40 min,溫度40 ℃,此時脫色率為94.98%,多糖得率為91.24%,通過噴霧干燥,所得樣品純度為91.07%。王長海[21]等在實驗室制備的短梗霉多糖純度為96.8%,與本實驗結果相接近。

氮源的水平和種類對菌體形態和代謝產物的合成起關鍵性作用,是一個重要且復雜的因素[22],也是一個嚴格調控的過程,賦予真菌能夠利用有限的氮源滿足細胞的生存所需[23]。目前,系統地研究有機氮源種類對普魯蘭多糖發酵影響的并不是很多,而且主要集中在無機氮源,特別是銨鹽對普魯蘭多糖合成的影響。Wiley和Lin等[24]人研究了碳源、氮源和磷酸鹽對普魯蘭多糖分子量分布的影響,其中氮源是影響分子量的最大因素,銨離子被證實比硝酸根離子更有利于生產高分子量的普魯蘭多糖。Catley等人[25]研究了氮源限制效應下出芽短梗霉合成普魯蘭多糖的情況,發現伴隨著相同的碳源消耗率,葡萄糖是流向胞內物質的合成還是普魯蘭多糖的合成取決于硫酸銨的濃度。盛龍等人[8]的研究表明,吐溫80的增加會降低普魯蘭多糖分子量的大小,這表明吐溫80確實影響到了普魯蘭從胞內向胞外的分泌。

4　結論

本文選擇實驗室常見的有機氮源,研究了有機氮源對出芽短梗霉CGMCC 11602發酵生產普魯蘭多糖的產量、結構、純度、分子量的影響,結果表明:在相同發酵條件下,不同有機氮源所生成的普魯蘭多糖產量由高到低依次為:酵母粉>牛肉膏>蛋白胨>胰蛋白胨>麥芽浸粉>尿素,以酵母粉為有機氮源時,普魯蘭多糖產量達到60.64 g/L;普魯蘭多糖的結構和純度受有機氮源種類的影響不顯著,表明該菌株能夠適用于各種有機氮源生產普魯蘭多糖,相對穩定,適合工業化生產;不同有機氮源所產生的普魯蘭多糖分子量由大到小的順序依次為:麥芽浸粉>牛肉膏>蛋白胨>胰蛋白胨>尿素>酵母,重均分子量范圍Mw在289039～604375 ku之間,分子量分散指數在2.0～2.4,其中由麥芽浸粉生產的高分子量普魯蘭多糖適用于水凝膠、藥物載體的領域,而由酵母粉生產的普魯蘭多糖分子量與同類產品基本一致。

[1]崔玉海. 出芽短梗霉G-58的發酵條件及動力學研究[D].無錫:江南大學,2008.

[2]劉暢. 出芽短梗霉的發酵條件及其糖酵解研究[D]. 無錫:江南大學,2012.

[3]楊西江,徐田華,徐玲,等.普魯蘭多糖的應用及研究生產現狀[J].發酵科技通訊,2010,39(4):25-28.

[4]Roukas T,Mantzouridou F J. Effect of aeration rate on pullulan production and fermentation broth rheological properties in an airlift reactor[J]. Journal of Chemical Technology & Biotechnology,2001,76(4):371-376.

[5]Igarashi T,Nomura K,Naito K,et al. Plasma extenders[P]. US Patent Office,Pat. No. 4370472,1983.

[6]Kulicke W M,Heinze T. Improvements in Polysaccharides for use as Blood Plasma Expanders[J]. Macromolecular Symposia,2005,231(1):47-59.

[7]盧輝官. 出芽短梗霉的胞外多糖在氮源作用下的積累及其應用[D].揚州:揚州大學,2010.

[8]盛龍. 普魯蘭多糖生物合成的關鍵影響因素及其機理研究[D].無錫:江南大學,2015.

[9]Kudryashova O A,Yurlova N A. Effect of the nitrogen source on the biosynthesis,composition,and structure of the exopolysaccharides of Aureobasidium pullulans(de Bary)Arnaud[J]. Microbiology,2000,69(4):428-435.

[10]Sena R F,Costelli M C,Gibson L H,et al. Enhanced production of Pulllulan by two strains of A.pullulans with Different concentrations of soybean oil in sucrose solution in batch fermentations[J]. Brazilian Journal of Chemical Engineering,2006,23(4):507-515.

[11]Zou J,Zhang F,Chen Y,et al. Responsive organogels formed by supramolecular self assembly of PEG-block-allyl-functionalized racemic polypeptides intoβ-sheet-driven polymeric ribbons[J]. Soft Matter,2013,9(25):5951-5958.

[12]Wu S J,Kim J M,Chao Z,et al. Estimation of pullulan by hydrolysis with pullulanase[J]. Biotechnology Letters,2010,32

(8):1143-1145.

[13]Sugumaran K R,Sindhu R V,Sukanya S,et al. Statistical studies on high molecular weight pullulan production in solid state fermentation using jack fruit seed[J]. Carbohydrate Polymers,2013,98(1):854-860.

[14]趙瑛,程建新,李紅玉,等. 茁霉多糖的結構分析及含量測定[J]. 食品與發酵工業,2009,35(6):162-164.

[15]夏朝紅,戴奇,房韋,等. 幾種多糖的紅外光譜研究[J]. 武漢理工大學學報,2007,29(1):45-47.

[16]林雨露.多糖的化學結構及構效關系的研究[J]. 江漢大學學報:人文科學版,2000(6):34-37.

[17]West T P,Strohfus B. Polysaccharide production by immobilized Aureobasidium pullulans cells in batch bioreactors[J]. Microbiological Research,2001,156(3):285-288.

[18]于航. 低色素出芽短梗霉的選育及其培養條件優化[D]. 無錫:江南大學,2007.

[19]Cheng K C,Demirci A,Catchmark M J. Evaluation of medium composition and cultivation parameters on pullulan production by Aureobasidium pullulans[J]. Food Science and Technology International,2011,17(2):99-109.

[20]高璇璇,鄭志達,孟迪,等. 脫色和干燥方式對普魯蘭多糖品質的影響[J]. 食品工業科技,2014,35(14):250-255.

[21]王長海,李焰紅,鞠寶,等.短梗霉多糖在海產品保鮮方面的應用研究[J].煙臺大學學報：自然科學與工程版,1999,12(2):148-152.

[22]Auer,Desmond P F,Seviour R J. Influence of varying nitrogen sources on polysaccharide production by Aureobasidium pullulans in batch culture[J]. Applied Microbiology & Biotechnology,1990,32(6):637-644.

[23]Donofrio N M,Oh Y,Lundy R,et al. Global gene expression during nitrogen starvation in the rice blast fungus,Magnaporthe grisea[J]. Fungal Genetics & Biology Fg & B,2006,43(9):605-617.

[24]Lin Y,Zhang Z,Thibault J. Aureobasidium pullulans batch cultivations based on a factorial design for improving the production and molecular weight of exopolysaccharides[J]. Process Biochemistry,2007,42(5):820-827.

[25]Catley B J,Ramsay A,Servis C. Observations on the structure of the fungal extracellular polysaccharide,pullulan[J]. Carbohydrate Research,1986,153(1):79-86.

Effects of organic nitrogen sources on the fermentation of Pullulan byAureobasidiumpullulans

MA Sai-jian,AN Chao,XUE Wen-jiao*,CHANG Fan,SHANGGUAN Yi-qing,DING Hao

(Microbiology institute of Shaanxi,Xi’an 710043,China)

The effect of six organic nitrogen sources on pullulan yield,structure,purity and molecular weight was studied by usingAureobasidiumpullulansCGMCC 11062. The results showed that the pullulan yield was different by using different organic nitrogen source,the highest yield was yeast extract,which can reach 60.64 g/L,then was beef extract,peptone,trypton,malt extract and the least was urea. The structure and purity of pullulan by different organic nitrogen species were consistent,which indicated that this strain can be applied to a variety of organic nitrogen to produce pullulan,and it was suitable for industrial production. The molecular weight of produced pullulan under different organic nitrogen was also great difference. The highest molecular weight was the one produced from malt extract,then were beef extract,peptone,trypton,urea and the lowest was yeast. Their weight average molecular weight(Mw)were between 289039～604375 u,molecular weight distribution was 2.0～2.4. These studies could provide technical guidance for the different characteristics of pullulan production.

organic nitrogen sources;pullulan;yield;purity;molecular weight

2015-12-08

馬賽箭(1982-),女,碩士,助理研究員,主要從事微生物代謝產物研究,E-mail:masaijian@163.com。

薛文嬌(1976-),女,博士,副研究員,主要從事微生物發酵及代謝產物研究,E-mail:x-wenjiao@163.com。

西部之光(2013DF01);陜西省自然科學基金(2014JM2-2015);陜西省科學院科技計劃項目(2013K-06);陜西省科學院科技計劃重點項目(2014K-01)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)11-0169-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.027