鎮江香醋醋醅中優勢高產酸醋酸菌菌株的篩選

張志燕,錢靜亞,馬　真,張正沛,郁曉晨,馬海樂,*

(1.江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮江 212013;2.江蘇大學生命科學研究院,江蘇鎮江 212013)

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鎮江香醋醋醅中優勢高產酸醋酸菌菌株的篩選

張志燕1,2,錢靜亞1,馬真1,張正沛1,郁曉晨1,馬海樂1,*

(1.江蘇大學食品與生物工程學院,江蘇鎮江 212013;2.江蘇大學生命科學研究院,江蘇鎮江 212013)

鎮江香醋是中國傳統發酵香醋之一,具有較高的營養價值。本實驗對鎮江香醋醋醅中高產酸的優勢醋酸菌進行了篩選和分離鑒定。最終分離得到15株產酸菌,通過16S rDNA序列分析,鑒定出8株醋酸菌。8株醋酸菌產酸分析結果表明,醋酸菌D-3-4的產酸量達到60 g/L,為高產酸菌株。對8株醋酸菌進行耐酒精、耐溫度、耐乙酸性能測試后發現:在酒精濃度不超過9%時,醋酸菌D-3-4的產酸量最高;當酒精濃度大于9%時,醋酸菌C-3-2-1的產酸量最高,酒精轉化率最高;當溫度為42 ℃時,醋酸菌D-3-4和R-4-2仍有30 g/L的產酸量;當乙酸濃度大于30 g/L時,醋酸菌D-3-4與C-3-2-2的產酸量在各菌株中最高;綜合各性能比較得出醋酸菌D-3-4性能最優,為優勢高產酸醋酸菌。

鎮江香醋,醋酸菌,分離

食醋作為一種食品調味品,在人們的日常生活中扮演著重要的角色。其以谷物蔬果為原料,在多種有益菌的參與下,歷經淀粉糖化,酒精發酵和醋酸發酵[1-2]三個階段發酵而成,具有較高的營養價值。醋酸菌在食品工業中具有重要作用,尤其是在食醋生產過程中起著關鍵作用[3-4]。分離潛在的醋酸菌在持續探索新的優良菌株和改進其生物性能方面是十分必要的。

除了產酸能力外,近年來有關工業發酵醋中醋酸菌的耐受力的研究又重新得到關注,醋酸菌對溫度、酒精、醋酸的耐受性直接影響著醋酸的產量,與經濟效益息息相關[5]。目前醋酸菌對熱、乙酸、乙醇和糖的耐受性研究已有初步研究[6-8]。夏季由于溫度較高的原因,常常導致醋酸發酵速率急速下滑,食醋生產受到嚴重影響,且發酵成本成倍提升[9]。另外,醋酸菌將乙醇氧化為乙酸的過程中會出現高濃度乙醇底物抑制和高濃度醋酸產物抑制的問題,從而影響醋酸菌的生長和產酸活性,甚至發生過氧化反應,降低產酸量[10]。因此,優良的醋酸菌應具備高效氧化酒精的酶系,以及耐高酸、耐高溫及高產酸的性能。

鎮江香醋屬于四大名醋之一,其天然發酵的醋醅中存在大量的優良醋酸菌。因此,本實驗以鎮江恒順香醋發酵過程中的醋醅為原料,分離篩選產酸菌,并進行生物學鑒定和產酸及耐溫度、耐酒精、耐乙酸等耐受力測定,以期得到性能優良的優勢醋酸菌菌株,不僅能豐富食醋行業的優質醋酸菌庫,而且也能為研究開發新醋奠定良好的基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

樣品來源以鎮江恒順香醋廠醋酸發酵第3 d的醋醅為實驗樣品;蛋白胨,酵母提取物,購自Oxoid公司;葡萄糖,瓊脂,酒精,NaOH,無水乙醇,冰醋酸,溴甲酚紫,酚酞國藥集團化學試劑有限公司。

BS2000S電子天平北京賽多利斯儀器有限公司;HVE-50立式壓力蒸汽滅菌器HIRAYAMA公司;VS-1300-U超凈工作臺江蘇省蘇州凈化設備有限公司;PSX-280H恒溫恒濕培養箱寧波萊福科技有限公司;BS-2FD雙層立式全溫培養搖床蘇州威爾實驗用品有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1培養基的制備平板分離培養基[11]:葡萄糖1%,蛋白胨0.3%,酵母提取物1%,瓊脂1.8%,0.04%溴甲酚紫5%,pH 6.8左右,121 ℃ 0.1 MPa滅菌20 min,等溫度降到55 ℃左右時加入無水乙醇3%(v/v)。

基礎發酵液體培養基[12]:葡萄糖1%,蛋白胨0.3%,酵母提取物1%,pH6.8左右,121 ℃ 0.1 MPa滅菌20 min,等溫度降到55 ℃左右時加入無水乙醇3%(v/v)。

斜面保藏培養基[11]:葡萄糖1%,蛋白胨0.3%,酵母提取物1%,瓊脂1.8%,pH 6.8左右,121 ℃ 0.1 MPa滅菌20 min,等溫度降到55 ℃左右時加入經過了滅菌的無水乙醇3%(v/v)。

1.2.2產酸菌分離鑒定步驟取樣→稀釋涂布→分離純化→挑取單菌落→形態觀察→菌懸液制備→16S rDNA分子鑒定→斜面保藏

1.2.2.1產酸菌的分離稱取10 g醋醅樣品,放入事先滅菌的250 mL三角瓶中(裝有玻璃珠和90 mL無菌水),125 r/min振蕩20 min后靜置2 min,得到10-1的菌懸液,用無菌水以10-2、10-3、10-4梯度稀釋,分別取0.2 mL的10-3和10-4梯度于分離培養基平板上,每個濃度涂布三塊平板,以溴甲酚紫為指示劑[11]。于28 ℃倒置培養2～3 d。根據菌落周圍有無黃色圈來判斷是否產酸。

1.2.2.2產酸菌的純化挑取透明圈較大且長勢良好的單菌落,在分離培養基平板上劃線分離純化,4 ℃冰箱保存,用于進一步分子鑒定[11]。

1.2.2.3產酸菌的鑒定產酸菌送至上海生工,選用細菌16S rDNA的通用引物27F和1492R進行測序[13],根據提供的檢測結果中的16S rDNA 基因序列,在Genbank數據庫中找到同源性最大的相關菌種,之后進行系統發育分析,利用MEGA6.06對所得到的DNA序列進行同源性比對,并構建其BioNJ進化樹。

1.2.3醋酸菌產酸量定性實驗方法分別挑取已鑒定的產酸菌單菌落接入基礎發酵液體培養基中,30 ℃、150 r/min培養,分別取發酵液用分光光度計測OD600,調整OD600=1,然后分別吸2 μL于兩塊溴甲酚紫顯色平板上,培養2～3 d后對比透明圈大小,以此判斷是否產酸以及初步估計產酸量大小。

1.2.4醋酸菌產酸定量實驗方法將相同濃度的醋酸菌液分別接種于100 mL基礎發酵液體培養基中,在35 ℃、150 r/min的條件下搖床培養。72 h后取出發酵液,用堿式滴定法檢測每株菌的具體產酸量,取10 mL發酵液,滴定前在發酵液中滴加2～3滴酚酞指示劑。用0.1% NaOH標準液滴定,由消耗的NaOH溶液的量來計算醋酸菌產酸量。產酸量計算公式為:

(1)

式中:V=發酵液樣品滴定所耗的NaOH標液毫升數;V0=對照組(空白培養基)滴定所耗的NaOH標液毫升數;60=醋酸的摩爾分數質量。

1.2.5耐酒精性能測定方法將菌體濃度相同的各株醋酸菌液以10%接種量分別接入五個酒精濃度梯度的發酵培養基中,分別為:5% Vol、7% Vol、9% Vol、11% Vol、13% Vol,35 ℃、150 r/min的搖床中震蕩培養4 d。取10 mL發酵液,測定產酸量。同時計算不同酒精濃度下酒精轉化率的大小。

酒精轉化率計算公式[14]:

(2)

1.2.6耐溫性能測定方法將菌體濃度相同的各株醋酸菌以10%接種量分別接入發酵培養基中,設定發酵梯度溫度分別為26、30、34、38、42 ℃,150 r/min的搖床中震蕩培養4 d。取10 mL發酵液,測定產酸量。

1.2.7耐乙酸性能測定方法將菌體濃度相同的各株醋酸菌以10%的接種量接入100 mL含不同濃度乙酸的發酵培養基中,乙酸的濃度梯度為10 g/L Vol、20 g/L Vol、30 g/L Vol、40 g/L Vol、50 g/L Vol,每個菌株設定3個平行實驗,35 ℃、150 r/min的搖床中震蕩培養4 d。取10 mL發酵液,測定產酸量。

1.3數據處理

所有實驗數據均重復測定3次,結果與平均值±標準偏差(X±SD)來表示,實驗的數據采用Excel統計分析軟件來進行處理。

2　結果與討論

2.1產酸菌的分離純化結果

當溶液pH在5.2～6.8之間,溴甲酚紫的顏色由黃色變為紫色,所以可作為產酸指示劑。其常用濃度為0.04%[15],顏色變化明顯。Swings[16]等于1992年將該方法列入醋酸菌的表征中。這種方法簡便易操作,極易在平板上觀察到產酸反應,便于分離產酸菌。

將醋醅樣品的菌懸液梯度稀釋后,涂布于分離培養基平板上,由于具有產酸菌特性的菌株,在溴甲酚紫平板上生長過程中釋放酸,酸可以使平板上紫色的溴甲酚紫變為黃色,使菌落周圍的培養基呈黃色的變色圈。根據產酸菌的分離方法得到產酸菌菌落(圖1)。挑取長勢良好的單菌落,劃線分離,初步分離得到20個產酸單菌落,再經28 ℃恒溫培養2 d后,得到17個產酸菌菌落,再挑取其上黃色圈明顯、形態完整的單菌落再進行分離,再次分離后得到黃色圈較大的15個單菌落。

圖1　溴甲酚紫顯色平板上的產酸菌菌落形態Fig.1　The colony morphology of acid producing bacterium on GYEC plates

2.2產酸菌的鑒定結果

由于傳統的細菌鑒定方法,即觀察菌株形態、分析菌株的生理學特征,存在一些缺點,如耗時費力,且結果不夠準確[17],而16S rDNA序列分析方法快速且準確,是非常有用的細菌鑒定方法。Sievers和Swings[18]于2005年構建了醋酸菌科的近乎完整的16S rDNA序列的系統發育樹,詳見第二版的伯杰氏系統細菌學手冊。因此,16S rDNA序列分析方法可以作為醋酸菌分類鑒定的強有力工具[19-21]。

將15株產酸菌進行16S rDNA鑒定,鑒定結果顯示其中8株為醋酸菌,將它們分別命名為:D-3-4、D-3-1、C-3-2-1、R-4-2、C-3-2-2、C-3-1-1、C-4-1-1、D-3-5。Hagstrom[22]將16S rDNA序列相似度為97%的判定為一個種,所以這8株都可以鑒定到種。

根據測序結果,用16S rDNA測序序列構建系統發育樹,如圖2所示。NJ進化樹的自舉檢驗值均大于50,同源性的拓撲結構正確。8個菌株在Blast檢測后顯示出為巴氏醋酸桿菌但菌株R-4-2所屬亞種與其余7種不相同,D-3-4也在亞種上與其余菌種有較大區分。

圖2　分離菌株的N-J系統發育樹Fig.2　The phylogenetic tree of isolated strainsby N-J method

2.3醋酸菌產酸量定性實驗結果

平板分離培養基,已被認為是一種理想的分離產酸菌的培養基[11,19]。采用溴甲酚紫作為產酸指示劑,根據黃色變色圈的大小,可以初步判斷產酸量的多少。對8株醋酸菌進行產酸定性實驗測定,結果如圖3所示。由圖可知,D-3-4、D-3-1、C-3-2-1、D-3-5與R-4-2的產酸透明圈較為明顯、邊緣整齊且較大,由此初步判定這5株醋酸菌的產酸量較大;而C-3-2-2、C-3-1-1與C-4-1-1透明圈較為不清晰。

圖3　分離菌株在溴甲酚紫顯色平板上的產酸透明圈Fig.3　The transparent circle on GYEC plates created by isolated strains

2.4醋酸菌產酸量定量實驗結果

對8株醋酸菌進行產酸量的測定,結果如圖4所示,其中最高產酸量大于60 g/L(D-3-4),最低產酸量小于40 g/L(D-3-5、C-3-1-1、C-4-1-1)。邵向麗[23]等對醋醅中優良醋酸菌株篩選的研究中發現,巴氏醋酸桿菌的產酸量最高為55.51 g/L,最低為32.40 g/L;張燁和張磊[24]對山西老陳醋優勢醋酸菌菌株的研究發現,產酸量最高為67.88 g/L,最低為42.84 g/L。因此,認為菌株D-3-4為高產酸醋酸菌;C-3-2-2、D-3-1、C-3-2-1、R-4-2的產酸量均高于40 g/L,為產酸較高的醋酸菌;而D-3-5、C-3-1-1與C-4-1-1為普通產酸醋酸菌。總的來說,我們所篩選出的醋酸菌產酸量較高,特別是D-3-4。

圖4　醋酸菌的產酸量Fig.4　Acetic acid production of isolated strains

2.5醋酸菌的耐性實驗結果

2.5.1醋酸菌的耐酒精性能醋酸菌能夠高效地將高濃度的酒精氧化,是生產高濃度酸的必備條件。但是,較高初始濃度的酒精會抑制醋酸菌生長,使得乙醇轉化率和產酸的速率下降,導致發酵周期延長數倍,使整個醋酸發酵效率嚴重降低。對不同酒精濃度下醋酸菌的產酸量和對酒精的轉化率進行測定,其結果分別如圖5、圖6所示。由圖可知,各醋酸菌在酒精濃度為5%產酸量最大,酒精轉化率最高,隨著酒精濃度的增加,產酸量呈下降趨勢,酒精轉化率下降。D-3-4在酒精濃度為5%、7%時產酸量最高,酒精轉化率最高,但當酒精濃度為9%時出現較大的下降。C-3-2-1和C-3-2-2在酒精濃度為5%、7%時的產酸量僅小于D-3-4,當酒精濃度大于等于9%時,C-3-2-1的產酸量在各菌株中最高。D-3-5在各酒精濃度下,產酸量都很小,酒精轉化率也很小。R-4-2、D-3-1、C-3-1-1和C-4-1-1在各酒精濃度下的產酸量在各醋酸菌處于中等水平,酒精轉化率也處于中等水平。

圖5　不同菌株在不同酒精濃度下的產酸量Fig.5　Growth of different strainsat different alcohol concentration

圖6　不同菌種在不同酒精濃度下的酒精轉化率Fig.6　The alcohol conversation rate of different strains at different concentration

同時,通過圖5和圖6可以看出,最高能夠耐受13%的酒精濃度,在酒精濃度為9%時,雖然產酸量下降,但是仍有15%的產酸量。而在酒精濃度為5%、7%時產酸量最高,酒精轉化率也最高。2013年Yuan Yi[20]等研究從恒順香醋發酵中分離的耐酒精醋酸菌,能夠耐受7%的酒精濃度。由于產酸速率的快慢,反應了酒精轉化率的高低,也影響著發酵周期的長短。因此在生產中采用產酸速率較高的菌株,從而縮短發酵時間,提高醋酸的產率。由此可見,我們選出的菌株總體上在產酸量高的同時,還能耐受高濃度的酒精,尤其是菌株D-3-4,可以進一步對其開發應用于生產上。

2.5.2醋酸菌的耐溫度性能醋酸菌在30～35 ℃均能良好生長,但不同菌屬的醋酸菌具有不同的最適溫度。溫度過高會使醋酸菌菌體老化加快,產酸速率降低,甚至導致菌體死亡[25]。對醋酸菌在不同溫度下的產酸量進行測定,其結果如圖7所示,由圖可知,在26～42 ℃的溫度范圍內,各醋酸菌的產酸量隨著溫度的上升先增加后下降。D-3-4與C-3-2-2在34 ℃時產酸量最高,34 ℃可能是它們生長的最適溫度。R-4-2與C-3-2-1在30 ℃時的產酸量最高,30 ℃可能是它們生長的最適溫度。C-4-1-1在38 ℃時與34 ℃時具有幾乎相同的產酸量,說明該菌株具有較寬的培養溫度范圍。當溫度為38 ℃,D-3-4和C-2-2的產酸量在各菌株中最高;當溫度為42 ℃時,R-4-2、D-3-4仍能有30 g/L的產酸量,表現出較好的耐高溫性。

圖7　不同菌株在不同溫度下的產酸情況Fig.7　Aciduricity of different strains at different temperature

恒順香醋醋酸發酵過程中溫度為40～46 ℃[26],而醋酸菌的最適生長溫度是25～30 ℃,如果通過降低醅溫來達到醋酸菌最適發酵溫度,需要很高的制冷費,這不利于工廠的效益。因此,選育耐高溫的、產酸量高的醋酸菌有著顯著的經濟效益。從本實驗可以看出,分離出的D-3-4、R-4-2,可進一步對其馴化培養,得到更優良的耐高溫菌株。

2.5.3醋酸菌的耐乙酸性能醋酸菌具有復雜的耐酸機制[10],在受多基因控制的同時,還有多種物質的交叉調節機制,乙酸在過量時,醋酸菌將失去氧化乙醇的能力,以及對乙酸的抗性迅速減弱,最終導致終產物醋酸的累積不足,醋酸菌的產酸性能大受影響。對醋酸菌在不同乙酸濃度下的產酸量進行測定,結果如圖8所示,除C-3-2-1和C-4-1-1在乙酸濃度為20 g/L時產酸最高外,其余菌株在乙酸濃度為10 g/L時產酸量最高。在各乙酸濃度下,D-3-4的產酸量在各菌株中均最高,當乙酸濃度為10 g/L時,D-3-4的產酸量最高,可達41.2 g/L。當乙酸濃度超過30 g/L時,各菌種的產酸量均出現驟降的現象,D-3-4和C-3-2-2的產酸量在各菌株中最高,當乙酸濃度為50 g/L時,D-3-4和C-3-2-2的產酸量為5 g/L,說明D-3-4和C-3-2-2在耐乙酸方面具有一定的潛力。

圖8　不同菌株在不同乙酸濃度下的產酸情況Fig.8　Aciduricity of different strainsat different aceticacid concentratio

朱瑤迪[9]等研究發現,恒順香醋醋酸發酵過程中,隨著發酵時間的增加,乙酸的濃度逐漸增加,從開始的接近0的酸度,到最后結束的61.2 g/L。本研究中,是直接在起始培養液中加入不同濃度的乙酸,菌株D-3-4和C-3-2-2沒有經過酸度的馴化,仍然能在50 g/L的乙酸濃度下,生長產酸,可見它們有較強的耐乙酸能力,因此,可用來作為優勢醋酸菌株,進一步對其開發應用。

3　結論

本研究從恒順醋醅中分離鑒定出8株巴氏醋酸桿菌。利用產酸量對這8株菌株研究發現,菌株D-3-4產酸量達到60 g/L,為高產酸菌株;進一步通過產酸性能研究發現,菌株D-3-4能夠耐受9%的高濃度酒精,42 ℃的高溫,以及50 g/L的高濃度乙酸,而且在這樣的條件下,還能夠有一定的產酸量。綜合產酸以及耐酒精、耐溫度、耐乙酸等比較,發現醋醅中篩選得到的醋酸菌D-3-4的性能最好,為優勢高產酸醋酸菌菌株。

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Screening of acetic acid bacteria with high yield of acid from vinegar pei of Zhenjiang aromatic vinegar

ZHANG Zhi-yan1,2,QIAN Jing-ya1,MA Zhen1,ZHANG Zheng-pei1,YU Xiao-chen1,MA Hai-le1,*

(1.School of Food and Biological Engineering,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China;2.Institute of Life Sciences,Jiangsu University,Zhenjiang 212013,China)

Zhenjiang aromatic vinegar is traditionally fermented vinegar in China and bears valuable nutritions.In this study,acetic acid bacteria(AAB)with high yield of acetic acid were investigated by screening from vinegar Pei of Zhenjiang aromatic vinegar.Fifteen strains of producing acid bacteria were isolated and eight strains of AAB were identified by 16S rDNA sequencing analysis.Among these eight strains,strain D-3-4 had a higher ability to produce acetic acid,reaching 60 g/L.The results of resistance testing to alcohol,temperature and acetic acid showed that the strain D-3-4 had the highest yield of acid when alcohol concentration was no more than 9%;but strain C-3-2-1 had the highest yield of acid and a conversion efficiency of alcohol when alcohol concentration was more than 9%.The study of thermo-tolerance demonstrated that strains D-3-4 and R-4-2 still had higher ability to yield acid,reaching 30 g/L at 42 ℃.The experiment of resistance to acetic acid showed strains D-3-4 and C-3-2-2 had the highest yield of acid at 30 g/L acetic acid concentration.Totally,the acid production of strain D-3-4 was superior to other strains.Therefore,the strain D-3-4 was finally selected as the dominant AAB of high production.

Zhenjiang aromatic vinegar;acetic acid bacteria;isolation

2015-10-12

張志燕(1977-)，女，博士研究生，助理研究員，研究方向：微生物發酵和食品生物技術，E-mail:yanziljh@163.com。

馬海樂(1963-)，男，博士，教授，研究方向：功能食品與食品加工，E-mail:mhl@ujs.edu.cn。

TS201.3

A

1002-0306(2016)11-0174-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.028