四種乳酸桿菌在全谷物糙米乳中發酵特性的研究

陳妍婕,朱力杰,何余堂,劉　賀,王　勃,馬　濤

(渤海大學糧油科學與技術研究所,遼寧省食品安全重點實驗室,生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心,遼寧錦州 121013)

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四種乳酸桿菌在全谷物糙米乳中發酵特性的研究

陳妍婕,朱力杰,何余堂,劉賀,王勃,馬濤*

(渤海大學糧油科學與技術研究所,遼寧省食品安全重點實驗室,生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心,遼寧錦州 121013)

選用植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)、嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、干酪乳桿菌(L.casei)4株乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)分別發酵糙米乳,通過測定發酵乳的pH、滴定酸度、活菌數、脫水收縮敏感性(susceptibility to syneresis,STS)、蛋白分解力、黏彈性等指標進行綜合評定。結果表明:4株乳酸桿菌均能耐受酸和膽鹽環境。L.rhamnosus的pH在4.45～4.5之間,pH環境更穩定;L.rhamnosus后酸化程度較弱;4 ℃貯藏21 d活菌數均超過8 lg cfu/g其中L.rhamnosus在貯藏期內乳酸菌的減少量較均勻且脫水收縮敏感性較低,保水性較好;其蛋白分解力維持在0.74～0.76 mmol/L;四種乳酸桿菌發酵的糙米乳都具有良好的黏度和黏彈性,L.rhamnosus的滯后環面積是687.92 Pa/s,發酵乳凝膠結構破壞后較易恢復,具有類固體的性質。綜上,各方面均表現較好的L.rhamnosus適合發酵糙米乳。

乳酸桿菌,糙米乳,發酵特性

糙米是指僅除去稻谷外穎殼的米粒,被“封固”在糠皮之內的活的胚芽也屬于它的營養成分[1]。糙米中營養成分如維生素B1、維生素B2、維生素E、纖維素、鐵、磷等均高于白米,并且含有豐富的營養保健因子谷胱甘肽、γ-谷維醇[2]、γ-氨基丁酸[3]、胞外多糖[4]、米糠纖維等。雖然糙米的營養價值高,但其口感粗糙,咀嚼難度大,不易被人體消化和吸收,風味也不比精米。為此,將糙米磨成粉,并制成糙米乳,進而利用乳酸菌的發酵作用制成發酵糙米乳,產品的營養價值,口感,風味都得到很大程度的改善,可接受度提高。國內外對發酵乳的研究主要集中在以下幾方面:乳酸菌在豆乳,牛、羊乳,含益生元如低聚糖、蜂蜜,膳食纖維,雜糧如苦蕎麥、玉米等乳品中的發酵性能及其相關產品開發[5-9];具有降膽固醇、抗氧化性、降血糖等生理功能,產γ-氨基丁酸,胞外多糖等乳酸菌的篩選及其在發酵乳品中的應用[10-11];發酵乳品質的改善[12-13]。

表1　乳酸桿菌酸耐受性

為了開發質優味美的發酵糙米乳產品,本實驗以植物乳桿菌(L.plantarum)、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)、嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)、干酪乳桿菌(L.casei)四種乳酸桿菌分別發酵糙米乳,通過耐酸、耐膽鹽、酸度、活菌數、脫水收縮敏感性、蛋白分解力、黏彈性等指標研究其在糙米乳中的發酵特性。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

L.plantarum、L.rhamnosus、L.acidophilus、L.casei四川高福記生物科技有限公司;液體MRS培養基用于菌種活化,固體MRS培養基用于活菌計數;糙米乳培養基:用于制備母發酵劑與發酵糙米乳;實驗中所采用的其他化學試劑均為分析純天津市風船化學試劑科技有限公司。

DHR-1流變儀美國TA公司;雷磁PHS-3C上海雷磁儀器廠;DHP-9082電熱恒溫培養箱上海一恒科學儀器有限公司;UV-2550紫外可見分光光度計日本島津公司;AD300S-H實驗室數顯分散均質機上海昂尼儀器儀表有限公司;Czone5F抑菌圈測量及菌落計數儀杭州訊數科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1菌種的活化稱取一定量菌粉接種于三角瓶MRS液體培養基中,37 ℃恒溫培養12 h,以3%體積比接種于試管MRS液體培養基中37 ℃恒溫培養12 h。將3%試管MRS菌液接種于糙米乳培養基中,37 ℃恒溫培養,3～5 h凝乳后即為母發酵劑。

1.2.2工藝流程糙米粉→酶解(中溫α-淀粉酶65 ℃酶解40 min)→煮沸滅酶10 min→過濾→加大豆蛋白粉→超微粉碎(20000 r/min,10 min)→蔗糖調配(蔗糖添加量為質量濃度70 g/L)→殺菌(90 ℃,10 min)→冷卻→接入母發酵劑(5%體積比)恒溫發酵→凝乳→4 ℃后熟

1.2.3耐酸耐膽鹽測定將活化2代的4株乳酸桿菌以3%體積比接種于pH為1.5、2.0、3.0、4.0無菌MRS液體培養基中;膽鹽濃度為0.05%、0.1%、0.3%、0.5%無菌MRS液體培養基中。不同pH條件下37 ℃恒溫培養2 h,不同膽鹽濃度37 ℃恒溫培養4 h;然后立即取出采用傾注法進行活菌計數,48 h觀察實驗結果[14]。以0 h、未添加膽鹽的活菌數為對照。測3次取平均值。

1.2.4pH測定將待測發酵糙米乳于室溫下平衡一段時間后用玻璃棒攪拌均勻,測定pH,測3次取平均值。

1.2.5滴定酸度發酵糙米乳的酸度參考GB5413.34-2010中的方法測定。

1.2.6活菌數無菌條件下稱取25.0 g樣品于盛有225 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中,用混勻器制成10-1均勻樣液。然后用無菌生理鹽水10倍梯度稀釋,選擇3個合適梯度,采用傾注法37 ℃恒溫培養48 h進行活菌計數,測3次取平均值[15]。

1.2.7脫水收縮敏感性準確稱取20.0 g發酵糙米乳于帶有中速定性濾紙的漏斗中,4 ℃放置2 h,稱量析出的濾液重量[16]。測3次取平均值。

脫水收縮敏感性(%)=濾液重量/樣品重量×100

1.2.8蛋白分解力蛋白分解力的測定采用鄰苯二甲醛衍生比色法[17-18]。在340 nm波長下用紫外可見分光光度計測定吸光度,確定蛋白分解力。測3次取平均值。

1.2.9剪切與頻率掃描實驗選擇直徑為40 mm的不銹鋼平板,平板與底面間隙設置為0.5 mm,樣品測試溫度定為25 ℃。剪切掃描:剪切速率從0.01 s-1增大到150 s-1,然后從150 s-1減小至0.01 s-1;頻率掃描:頻率從0.1～10 Hz進行掃描。測試前需將發酵糙米乳攪拌均勻[19]。

2　結果與分析

2.1酸和膽鹽耐受性

人體胃液的pH從1.5至4.5波動,通常保持在3左右,進食酸性食物可降至2,食物在胃中停留時間較短,一般為1～2 h[20-21]。由表1可得,同一菌株在pH1.5～4.0,隨著pH的升高,活菌數逐漸增多。不同菌株在pH2.0時均超過6.00 lg cfu/mL,滿足乳酸菌發揮功能特性的活菌數臨界值6.00 lg cfu/mL的要求[22];pH3.0時乳酸菌存活率都在94%以上;pH4.0時L.plantarum、L.rhamnosus都超過了初始活菌數。Ashraf M等[23]測定了L.rhamnosus在pH2.0、4.0、7.0的MRS培養基中培養2 h后的活菌數,pH4.0時高于初始活菌數,其他兩組均低于初始活菌數。Balcázar J L等[24]將L.plantarum在pH3.5和6.5的MRS培養基中培養1.5 h,結果pH3.5的活菌數高于pH6.5,可能是適當的pH促進了乳酸桿菌的增殖。綜上,4株乳酸桿菌均能耐受胃酸環境,最終到達腸道,進而發揮其功能性食補因子的作用。

表2　膽鹽耐受性

表3　活菌數變化

人體小腸中膽鹽濃度在0.03%～0.3%之間[25]波動。食入的乳酸菌只有通過苛刻的胃酸環境及含高濃度膽汁鹽的十二指腸到達腸道下部才能發揮其功能特性。由表2可知,同一菌株膽鹽濃度在0.05%～0.5%,隨著膽鹽濃度降低,活菌數逐漸增多。4株菌在0.3%時,活菌數仍大于6.00 lg cfu/mL;在0.05%時均達到8.00 lg cfu/mL,超過初始活菌數,可能適量膽鹽有助于乳酸桿菌的增殖。范藝興[14]對3株L.acidophilus在含0.1%膽鹽的MRS培養基中培養2 h,菌株存活率為100%左右,也得到了相同的結論。綜上,4株乳酸桿菌都能耐受0.3%的高濃度膽鹽,滿足對人體小腸中膽鹽濃度0.3%耐受性的要求。

2.2pH測定

如圖1所示,從發酵結束到貯藏結束21 d,L.plantarum的pH從4.50降到3.81,蘇芳[26]以6株L.plantarum發酵豆乳,貯藏21 d時其pH均下降到4.0以下,這可能與其能夠較好地利用蔗糖等其他糖類有關,L.plantarumNCIMB8826的全基因序列測定也證實L.plantarum具有編碼吸收和利用不同糖和肽的基因;L.acidophilus次之,pH從4.4降到4.04,可能因為其屬于專性同型發酵菌[27],不能發酵戊糖或葡萄糖酸鹽產酸而使其在貯藏中后期pH較L.plantarum高;L.rhamnosus和L.caseipH變化較小,貯藏期間L.rhamnosus維持在4.45～4.5之間,L.casei為4.6～4.7。L.plantarum貯藏期間pH變化最大,這與菌株自身的發酵性能有關,但貯藏期發酵糙米乳pH大幅度下降其品質將會受到直接影響,所以應盡量篩選pH變化相對較小的菌株[28]或者與其他菌株復配嘗試減弱后酸化程度。

圖1　各菌株發酵糙米乳pH變化Fig.1　The curve of pH of fermented brown rice milkby LAB during the storage

2.3滴定酸度測定

滴定酸度反映了發酵糙米乳中包括游離氨基酸殘基和肽段在內的所有酸性基團的總和[29]。產品的組織狀態和風味,保質期,活菌數等指標都會受到菌株的產酸能力和酸耐受性的影響[30-31]。發酵結束時,四種發酵糙米乳酸度均偏低,L.acidophilus最高只有56.85 °T,另外三種均低于40 °T。貯藏期間L.plantarum、L.acidophilus前7 d酸度增幅較大(p<0.05),分別為29.67、13.51 °T;L.rhamnosus平穩增長,但酸度變化大于L.casei;L.casei略有下降,21 d時升高。L.plantarum發酵糙米乳滴定酸度共增加了48.94 °T,可能與其在冷藏期間菌株的產酸能力有關,但這種變化會影響產品的風味、組織狀態等,后酸化程度嚴重,不利于產品的質量控制;L.acidophilus次之為22.4 °T;L.rhamnosus是20.97 °T,可能在貯藏期產生了較多的酸性物質,對產品口感產生一定影響;L.casei最小為5.7 oT,說明此菌后酸化能力最弱。綜合考慮pH和滴定酸度,貯藏期間pH變化大的菌株其滴定酸度變化也大。

圖2　各菌株發酵糙米乳滴定酸度變化Fig.2　The graph of titratable acidity of fermented brown rice milk by LAB during the storage

2.4活菌數

發酵乳品中高含量的活菌才可能確保最終有較多的乳酸菌進入人體發揮其生理功效,這是活性乳酸菌具有保健性的重要指標之一[32]。貯藏期內,各菌株發酵的糙米乳活菌數都保持在8 lg cfu/g以上,由此推斷糙米乳可以做為四種乳酸菌良好的生長基質。L.plantarum前14 d活菌數持續增長,可能是一定酸度范圍內能夠促進其生長,酸度繼續上升,發酵基質成分改變等導致其生長受阻,數量下降,21 d時降至8 lg cfu/g,與其他三種菌差異顯著(p<0.05)。L.rhamnosuspH處于4.45～4.5,可能是糙米乳對此菌株具有較好的pH緩沖作用,菌體損傷小,使得其在整個貯藏期活菌數變化平穩;L.acidophilus在貯藏1 d時活菌數上升較快,到7 d時卻也有較大下降,這可能與其在前7 d酸度上升較多有關(p<0.05),抑制了乳酸菌的生長,而Donkor O N[33]報道L.acidophilus對酸有較高的耐受性,這可能由于菌株間存在差異性;L.casei在貯藏1 d時活菌數最高,7 d較1 d下降最多為0.66 lg cfu/g,此后活菌數基本不變。此外三種菌均在貯藏1 d時活菌數較高,與其第7、14、21 d差異顯著(p<0.05),并且隨著pH下降,滴定酸度上升,活菌數下降。Mani-López E等[34]以L.acidophilus和L.casei發酵牛乳得出了相同的結論。由于乳酸菌需要通過胃腸道,所以其治療劑量一般認為是8～9 lg cfu/g[35],四種發酵糙米乳在21 d的貯藏期內滿足要求。

2.5脫水收縮敏感性

脫水收縮敏感性[36]反映的是發酵糙米乳凝膠體系對各種水及小分子物質總的保持能力。體系保持力越強,那么發酵乳凝膠體系中束縛水含量就越多,即膠體脫水收縮敏感性越差,STS值越小,產品的持水性越好,在不破乳的情況下產品較好的滋氣味更能得以保持,口感更佳。貯藏期間各菌株STS是呈下降趨勢的,即保持力隨著貯藏時間延長而增強。Prasad L N等[37]指出STS的降低可能由于貯藏期內凝膠網絡之間的作用力減弱,乳清被重新吸收入蛋白凝膠。同一菌株除L.rhamnosus外在7、14、21 d STS差異不顯著(p>0.05),而L.rhamnosus在14 d時趨于穩定。Lucey J A[38]指出脫水收縮作用與蛋白凝膠的收縮有關,從而導致乳清析出,由此:L.rhamnosus的蛋白凝膠收縮作用在前14 d減弱較明顯(p<0.05),L.plantarum、L.acidophilus、L.casei為7 d。而王水泉等[39]用L.fermentum發酵豆乳,在21 d的貯藏期內STS呈緩慢上升趨勢,可能與發酵基質、菌種、乳清在蛋白凝膠中的滲透性等有關。21 d時L.casei的STS最高為17.64%,另外3株菌差異不顯著(p>0.05),盡管四種產品在貯藏期內的STS值有差異,但總體偏低,7 d及之后的時間內均未超過20%。

圖3　各菌株發酵糙米乳脫水收縮敏感性變化Fig.3　Changes of STS of fermented brown rice milk by LAB

2.6蛋白分解力

乳酸菌一方面通過水解反應作用于發酵乳中的蛋白質,使之分解形成多種短肽和氨基酸,部分短肽和氨基酸能夠被乳酸菌利用,進而促進菌體的生長;另一方面這些短肽和氨基酸是發酵乳中風味物質的前體或是風味物質[40]。同一菌株在貯藏期間蛋白分解力是增強的。不同菌株蛋白分解力不同,但四種菌均較弱。L.plantarum蛋白分解力較弱,Georgieva R[35]等以8株L.plantarum發酵豆乳,其蛋白分解力在0.170～0.609 mmol/L之間,Michiel K等[41]研究分析L.plantarumWCFS1的基因組,表明其缺失編碼胞外蛋白酶的基因,使其蛋白分解力弱。L.rhamnosus在貯藏期內維持在0.74～0.76 mmol/L之間,差異不顯著(p>0.05)。L.acidophilus蛋白分解力從1.14 mmol/L增加到1.74 mmol/L,游離氨基酸含量相對增加較多,這可能是因為菌株自身酶系能很好地利用多肽,并且可能對乳酸桿菌的增殖也有促進作用;Hernandez-Hernandez O等[42]研究發現蛋白分解力高的發酵乳提高了發酵劑的存活率。L.casei21 d時達到0.98 mmol/L,比發酵結束時增加了0.27 mmol/L;Wang J等[43]以L.caseiZhang發酵豆乳、牛乳,產品均有較好的蛋白分解力。蛋白分解力弱的乳酸桿菌可以通過與酸乳發酵劑混合發酵,此時它們的貢獻主要在于分解多肽,從而增加小肽、游離氨基酸、風味前體物質的含量[35]。

圖4　各菌株發酵糙米乳蛋白分解力變化Fig.4　The curve of proteolytic activity of LAB in fermented brown rice milk

2.7黏彈性測定

2.7.1剪切掃描如圖5所示,當剪切速率在0.001～0.02 s-1區間內,發酵乳黏度都在700～1000 Pa·s之間,候保朝[44]等人制備的發酵乳黏度在650～802 Pa·s,說明這四種發酵糙米乳入口時可能比發酵乳呈現的黏稠度高,可能具有較強的保水能力,這一點在結果2.5中已得到證實,即產品的脫水收縮敏感性均較差,7 d及之后的時間內STS均未超過20%。當剪切速率繼續升高至10～70 s-1時產品黏度低于上述文獻中的發酵乳,可能在咀嚼過程中會感到產品順滑,并且易于吞咽。四種產品黏度都是隨著剪切速率的增大而減小,但是在降速期間黏度未能恢復到最初黏度,可能是由于產品內部結構被破壞,從而只有一定程度地回升。這一現象說明了它們都是典型的觸變性流體,會形成一個滯后環,恢復速率的差異性導致滯后環面積不同,其中L.plantarum、L.rhamnosus、L.acidophilus和L.casei的滯后環面積分別為584.93、687.92、779.55、644.58 Pa/s。說明L.plantarum、L.rhamnosus和L.casei經外力作用后黏度變化較小,凝膠網絡結構被破壞后恢復所需能量小,恢復能力較強。

圖5　各菌株發酵糙米乳剪切速率-表觀黏度曲線圖Fig.5　The curve of viscosity with shear rate in fermented brown rice milk

圖6　各菌株發酵糙米乳貯藏模量(G′)和損失模量(G″)隨頻率的變化Fig.6　Storage modulus(G′)and loss modulus(G″)of fermented brown rice milk with frequency sweeps

2.7.2頻率掃描如圖6所示,在0.1～10 Hz掃描范圍內,隨著頻率的增大,四種發酵糙米乳的G′和G″值都呈增加的趨勢,而且G′均高于G″,說明四種產品都表現為典型的凝膠特性,固體性質占主導地位,劉曉恒[45]以部分大豆蛋白代替牛乳蛋白制備的酸乳也具有類固體的性質。但是四種發酵糙米乳G′與G″的差值不同,其值越大,產品飽滿程度越高,越偏向固體,彈性越大。L.plantarum差值較大,說明其彈性大,凝膠網絡結構緊密;另外其滯后環面積最小可能與其彈性大有關。其他三種產品的凝膠結構相對較為疏松,彈性較小。

3　討論

發酵糙米乳中各指標并不是孤立存在的,它們會互相影響,相互作用。四種發酵糙米乳的pH與滴定酸度呈負相關,其中L.plantarum、L.acidophilus顯著(p<0.05),但其后酸化程度嚴重,不利于產品質量控制。除L.plantarum外,滴定酸度與活菌數和STS均呈負相關,其中L.rhamnosus和L.acidophilus顯著相關(p<0.05),說明隨著發酵糙米乳酸度的上升,乳酸菌數量下降,可能與其對酸的耐受性有關;L.plantarum和L.acidophilus滴定酸度與蛋白分解力呈正相關,且相關性顯著(p<0.05),這兩種發酵乳的酸性基團部分來自蛋白質的分解產物短肽,游離氨基酸等?；罹鷶蹬c蛋白分解力相關性不顯著。

4　結論

綜合考慮各指標間相關性,滴定酸度與pH、STS負相關;活菌數與蛋白分解力不顯著相關;其他指標間相關性不一致。經酸和膽鹽耐受性測定,L.plantarum、L.rhamnosus、L.acidophilus、L.casei4株菌均對酸和膽鹽具有一定耐受性,能夠順利通過胃腸道。4株菌分別發酵糙米乳至凝乳,4 ℃貯藏21 d。L.rhamnosus、L.acidophilus后酸化程度較L.plantarum弱,但L.acidophiluspH變化較大,L.rhamnosus維持在4.45～4.5,pH環境更穩定,更利于乳酸菌的生長及維持產品的優良特性。貯藏期間四種菌株的活菌數均達到了8 lg cfu/g 以上,滿足乳酸菌發揮功能特性的要求,L.rhamnosus活菌數降低的趨勢較平緩。脫水收縮敏感性測試結果表明1～21 dL.plantarum、L.rhamnosus、L.acidophilus持水性較強,即乳清析出較少。4株菌蛋白分解力均較弱,L.acidophilus最高達1.74 mmol/L,L.plantarum、L.rhamnosus、L.casei小于1 mmol/L。發酵結束后24 h的黏彈性結果表明四種發酵產品具有較好的入口黏度及咀嚼性質,L.plantarum、L.rhamnosus和L.casei凝膠網絡結構破壞后較易恢復;都表現出類固體的性質,彈性較好,是很好的凝固性產品。綜上,可選擇各方面指標相對較好的L.rhamnosus用于發酵糙米乳。

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Study on the fermentating characteristics of four LAB in whole grain made from brown rice milk

CHEN Yan-jie,ZHU Li-jie,HE Yu-tang,LIU He,WANG Bo,MA Tao*

(Bohai University Grain and Oil Science and Technology Institute;Food Safety Key Lab of Liaoning Province;National & Local Joint Engineering Research Center of Storage,Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products;Jinzhou 121013,China)

Lactobacillusplantarum,L.rhamnosus,L.acidophilusandL.caseiwere used to ferment brown rice milk respectively. The pH,titratable acidity,the viable count of strains,STS,proteolytic activity and viscoelasticity of fermented brown rice milk were determined in the duration of storage at 4 ℃ for 21 d respectively. The results showed that every strain could tolerate the acid and bile of high concentration and the viable count of bacteria exceeded 8 lg cfu/g during storage at 4 ℃ for 21 d,the viable count ofL.rhamnosusdeclined steadily. The pH ofL.rhamnosuswas between 4.45～4.5 during whole storage periods and pH was more stable. The sample fermented byL.rhamnosusdisplayed weak post acidification. The product fermented byL.rhamnosushad low score of STS. The proteolytic activity ofL.rhamnosuswas between 0.74～0.76 mmol/L. The four strains were well in viscoelasticity. In addition,the area of hysteresis loop ofL.rhamnosuswas 687.92 Pa/s,and the fermented brown rice milk could recover more easily when it was broken. Besides,the specimen fermented byL.rhamnosushad the property of solid. From the above,L.rhamnosuscould be suitable for the production of fermented brown rice milk.

LAB;brown rice milk;properties of fermentation

2016-01-09

陳妍婕(1990-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：糧食油脂與植物蛋白工程，E-mail:xhmchyj0127@163.com。

馬濤(1962-)，男，博士研究生，教授，研究方向：食品科學,E-mail:1040732408@qq.com。

TS201.3

A

1002-0306(2016)11-0179-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.029