超高效液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜快速篩查豬肉中29種抗菌藥物的殘留

郝　杰,姜　潔,邵瑞婷,路　勇,馮　楠

(北京市食品安全監控和風險評估中心,北京 100041)

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超高效液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜快速篩查豬肉中29種抗菌藥物的殘留

郝杰,姜潔*,邵瑞婷,路勇,馮楠

(北京市食品安全監控和風險評估中心,北京 100041)

采用超高效液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜儀(UPLC-Q-TOFMS)建立了豬肉中磺胺、喹諾酮、大環內酯、林可酰胺等4類29種抗菌類藥物殘留的篩查數據庫;并結合快速高通量的前處理方法實現了豬肉中抗菌類藥物的快速篩查測定。樣品經Mcllvaine緩沖液提取,HLB固相萃取柱凈化,采用BEH C18UPLC色譜柱分離,梯度洗脫,采用全信息串聯質譜掃描模式(MSE)進行檢測,精確質量數的母離子定量。結果表明:29種抗菌藥物的定量限(LOQ,S/N≥10)為0.5～10 μg/kg,高、中、低3個添加水平平均回收率為50.10%～118.33%,相對標準偏差(RSD)為0.31%～14.90%,該方法能夠達到高通量、多組分、快速開放的篩查目的,可用于豬肉基質中抗菌藥物的批量快速篩查工作。

飛行時間質譜,抗菌藥物,快速篩查

抗菌藥物是指能抑制或殺滅細菌,用于預防和治療細菌性感染的藥物。其中包括人工合成或半合成類的藥物以及微生物(細菌、真菌和放線菌屬)的代謝產物-抗生素。從化學結構和作用機理上,合成藥物又可分為磺胺類、喹諾酮類、硝基咪唑類、硝基呋喃類等;抗生素又可分為β-內酰胺類、大環內酯類、林可酰胺類、氨基糖苷類、四環素類、氨酰醇類等[1]。

近年來,各類抗菌藥物在現代畜牧生產中的使用量明顯增加、使用范圍明顯擴大,由此帶來了許多食品安全風險的隱患[2-5]。動物源性食品中抗菌類藥物殘留的問題日漸突出,對消費者造成了嚴重的健康威脅,國內外都開始關注并采取了各種措施控制抗菌藥物的濫用[6-10]。我國制定了關于食品中抗菌類藥物的殘留限量,例如所有動物食品中磺胺類藥物總量最大殘留為100 μg/kg,對林可酰胺類及大環內酯類藥物的最大殘留限量為40～1500 μg/kg,牛奶和畜類肌肉中喹諾酮類藥物的最大殘留量為30～400 μg/kg[11]。

目前,食品中抗菌藥物的檢測多為液相色譜串聯質譜法,其中又以串聯四極桿質譜方法居多[12-15]。前處理方法多為固相萃取法和基質分散固相萃取法[16-17]。這些方法都相對比較獨立,只能完成某一類物質的檢測,且方法固定不開放,一旦定型,很難再加入新的檢測物質。無法滿足食品安全突發事件快速處置工作所要求的高效率、多組分、開放性等要求。

高分辨飛行時間質譜(time of flight mass spectrometry,TOFMS)近年來在食品安全分析領域的應用越來越廣泛,與低分辨的串聯四極桿質譜相比,其具有定性準確,精確質量數,方法開放等優勢,Oertelli等研究了基于UPLC-TOFMS的牛奶中150種獸藥殘留的快速多殘留篩查方法[18],高馥蝶等利用UPLC-Q-TOFMS對牛奶中42種農、獸藥殘留[19],張潔等利用UPLC-Q-TOFMS建立牛奶中19種抗菌藥物的篩查方法[20]。

本文使用高分辨飛行時間質譜進行豬肉中磺胺類,喹諾酮類,林可酰胺類,大環內酯類等4類29種抗菌藥物同時檢測方法的研究,建立了基于精確質量數的篩查數據庫和優化的定量方法,滿足了食品安全風險突發事件的快速應急處理工作中高通量、高可靠性確證和定量分析的要求。為相關工作提供了可靠的技術保障。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

磺胺二甲嘧啶(純度99.0%)、磺胺地索辛(純度99.5%)、磺胺甲基嘧啶(純度99.2%)、磺胺嘧啶(純度99.5%)、磺胺間甲氧嘧啶(純度98.5%)、磺胺對甲氧嘧啶(純度98.0%)、磺胺多辛(純度99.0%)、磺胺噻唑(純度99.5%)、磺胺甲噁唑(純度99.0%)、磺胺吡啶(純度99.0%)、磺胺二甲異噁唑(純度99.0%)、磺胺喹噁啉(純度98.0%)、磺胺醋酰(純度99.5%)、磺胺氯噠嗪(純度100.0%)、磺胺甲氧噠嗪(純度99.2%)、鹽酸二氟沙星(純度98.0%)、奧比沙星(純度99.0%)、司帕沙星(純度98.9%)、馬波沙星(純度99.0%)、鹽酸沙拉沙星(純度95.5%)、甲磺酸丹諾沙星(純度93.5%)、氟羅沙星(純度98.0%)、培氟沙星(純度99.0%)、依諾沙星(純度99.0%)、林可霉素(純度98.0%)、克林霉素(純度98.0%)、螺旋霉素(純度96.0%)、紅霉素(純度95.3%)、替米考星(純度95.3%)、泰樂菌素(純度96.0%)均購自于德國Dr. Ehrenstofer GmbH公司。

乙腈、甲醇、乙酸銨、正己烷,色譜純美國Thermo Fisher公司;甲酸,色譜純德國CNW Technology GmbH公司;無水硫酸鈉分析純,北京化學試劑廠;亮氨酸腦啡肽美國Waters公司;HLB固相萃取柱150 mg/6 mL、MCX固相萃取柱150 mg/6 mL QuEChERS提取管(內含1.5 g無水硫酸鈉和6 g無水硫酸鎂)、QuEChERS凈化管(內含150 mg無水硫酸鎂,50 mg PSA,50 mg C18)美國Waters公司。實驗用水為Milli-Q制備的超純水。

Waters Acquity UPLC超高效液相色譜系統、Waters Synapt G2四極桿串聯飛行時間質譜儀,配有電噴霧離子源及Masslynx 4.1 SCN791軟件系統美國Waters公司;Milli-Q純水儀美國Millipore公司;3K18高速冷凍離心機美國Sigma公司;固相萃取裝置美國Waters公司。

1.2標準溶液的配制

各標準品于10 mL棕色容量瓶中用甲醇溶解,并定容到刻度,配制成1000 μg/mL的標準儲備液,轉入棕色樣品瓶中于-20 ℃保存。

1.3樣品前處理

豬肉肌肉組織樣品經處理均質后,稱取5.0 g樣品于離心管中,加入10 mL Mcllvaine緩沖液,渦旋振蕩1 min至充分混勻,超聲波提取20 min,于4 ℃下10000 r/min離心10 min,取出上清液,殘渣用10 mL Mcllvaine緩沖液再提取一遍,合并上清液待用。

HLB固相萃取柱用5 mL甲醇,5 mL水活化,取10 mL上清液上柱,保持上柱速度不超過3 mL/min,用5 mL 5%甲醇淋洗小柱,使用正向氮氣流壓干后用6 mL甲醇洗脫并收集洗脫液,洗脫液于室溫下用氮氣吹干,用1 mL流動相A∶流動相B=9∶1(v∶v)復溶,再加入1 mL正己烷,充分渦旋后,4 ℃ 14000 r/min離心10 min,取下層液體過0.22 μm聚四氟乙烯濾膜,待儀器分析。

1.4色譜條件

液相色譜柱:Waters Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流速0.45 mL/min;柱溫45 ℃;流動相:A 1 mol/L pH5.0乙酸銨溶液10 mL+990 mL水,B 1 mol/L pH5.0乙酸銨溶液10 mL+990 mL甲醇;梯度洗脫條件:0～0.25 min 98% A,0.25～12.25 min 98%～1% A,12.25～13.00 min 1% A,13.00～13.01 min 1%～98% A,13.01～17.00 min 98% A;進樣量5 μL,進樣溫度10 ℃。

1.5質譜條件

電噴霧離子源;毛細管電壓3.0 kV;離子源溫度120 ℃;萃取電壓4.0 V;錐孔電壓20.0 V;錐孔氣流量50 L/h;脫溶劑氣溫度550 ℃;脫溶劑氣流量1000 L/h。采用全信息串聯質譜法(MSE)采集數據,質量掃描范圍m/z 50～1000;低場碰撞能量4 eV;高場碰撞能量10～45 eV。實驗中使用亮氨酸腦啡肽(2 ng/mL,乙腈∶水=1∶1稀釋)進行質量數實時校正。

2　結果與分析

2.1前處理方法的優化

2.1.1提取溶劑的優化考慮到29種化合物的快速篩查需要通用、快速、回收率優化的前處理方法,本研究考察的前處理方法需要均能有效凈化基質中的干擾。選取總體回收率較差的磺胺二甲異惡唑、磺胺氯噠嗪、培氟沙星、紅霉素、泰樂菌素5種化合物作為依據,考察了乙腈、0.1%乙酸乙腈、乙酸乙酯、Mcllvaine緩沖液等不同提取液的回收率。結果如圖1所示。

圖1　不同提取溶劑的提取效率Fig.1　Recoveries of different extract solvent注:加標水平20 μg/kg,其余化合物的回收率均好于此五種，圖2同。

結果表明,使用Mcllvaine緩沖液作為提取溶液,在均為2次提取的情況下,可以達到較好的回收率,其中最差的5種化合物回收率也能保持在45%以上。

2.1.2凈化條件的優化考察了HLB固相萃取柱,MCX固相萃取柱、QuEChERS基質分散固相萃取以及QuEChERS基質分散固相萃取+0.1 g Na2EDTA共四種凈化條件的效果。以總體回收率較差的磺胺二甲異惡唑、磺胺氯噠嗪、培氟沙星、紅霉素、泰樂菌素5種化合物作為依據進行評價,結果如圖2表示:

圖3　克林霉素的質譜分析圖Fig.3　Total ion chromatogram and spectrogram of Clindamycin

圖2　不同凈化條件的凈化效果Fig.2　Recoveries of different clean-up method

實驗發現,使用MCX柱凈化,在紅霉素和泰樂菌素的回收率上相近甚至稍優于HLB柱,但由于其在磺胺類化合物的低回收表現,并不如HLB柱適用,而QuEChERS方法的稀釋倍數過大,影響了其方法的檢出限。另外,在QuEChERS提取管中加入Na2EDTA可見明顯改善了各類化合物的回收率,推測Na2EDTA消除了易于目標化合物形成螯合物的金屬離子的影響,起到了優化凈化的效果,這也解釋了在提取溶劑中含有Na2EDTA的Mcllvaine緩沖液的提取效率要優于其他溶劑。

綜上所述,使用Mcllvaine緩沖液作為提取溶劑,選擇HLB固相萃取柱作為凈化方法,可以得到29種抗菌類藥物較好的前處理提取-凈化效果,目標化合物的回收率均在50%以上。

2.2色譜-質譜分析

2.2.1飛行時間質譜儀的校正在實驗工作開展之前,使用甲酸鈉對儀器質量軸進行校正,將儀器的測定質量誤差控制在5 ppm之內。實驗過程中,使用亮氨酸腦啡肽(C28H37N5O7,單一同位素精確質量數555.2693)進行實時校正。質譜方法分為3個通道(Function),通道1為低場碰撞能量采集母離子信息,通道2為高場碰撞能量采集碎片離子信息,通道3為亮氨酸腦啡肽實時質量數矯正通道。

2.2.2篩查信息數據庫的建立本研究根據國家相關的動物源性食品中抗菌藥物使用相關標準,選取了4類共29種常用抗菌藥物,這些化合物的相對分子質量和理化性質各有不同。

圖4　克林霉素的碎片分析結果Fig.4　Product ion analysis result of Clindamycin by massfragment

用前處理過程中的復溶液(流動相A∶流動相B=9∶1 v∶v)將29種藥物分別配制成100 ng/mL的單個標準工作溶液,經色譜進入飛行時間質譜儀,根據化合物分子式與加合離子狀態推算母離子的質荷比,在±20 mu的偏差下提取該質荷比的XIC,確定該化合物的保留時間。以克林霉素(C18H33ClN2O5S,相對分子質量424.1799)為例,圖3a1是克林霉素的1通道(低場碰撞能量=4 eV)提取離子流圖,可以得到在固定色譜條件下克林霉素的保留時間為8.35 min,圖3a2為克林霉素的1通道8.35 min處的質譜圖,克林霉素的母離子電離形式為[M+H]+,母離子質荷比m/z 425.1877。通過Elemental Composition的同位素模型對圖3a2中425.1894質譜峰進行分析(結果如圖3a3),可以得到同位素分布的iFit置信值為99.11%,為所有可能化學式中理論同位素峰匹配度最高的一個,該質譜峰(m/z 425.1894)即為克林霉素的[M+H]+峰。

圖3b2為克林霉素的2通道(高場碰撞能量=10～45 eV)下,8.35 min處的質譜圖,在Mass Fragment軟件中導入化合物結構式,經軟件自動對高低場碰撞能量質譜圖進行對比,得到三個較易形成,豐度較高的碎片離子信息,分別為m/z 126.1283,m/z 377.1843,m/z 279.1015。圖3b1為2通道下m/z 126.1283的提取離子流圖。

圖4為massfragment對克林霉素在MSE模式下子離子的分析圖。對找到豐度較大的碎片離子(m/z 126.1297,m/z 279.0975,m/z 377.1857)進行分析,對比從結構式得到的理論碎片,所檢測到的碎片與理論碎片符合,并且從結構式的斷裂形式上可以看出,這些碎片都較易形成,因此可以確定這幾個碎片作為篩查方法中克林霉素的碎片離子。

結合上述論證,可以得到克林霉素在固定色譜-質譜條件下,保留時間為8.35 min,母離子精確分子量為425.1877,碎片離子為m/z 126.1283,m/z 377.1843,m/z 279.1015。建立成文本形式的數據庫后,利用MassLynx中ChromaLynx XS組件的識別篩查功能,對比保留時間(偏差0.2 min以內),母離子精確分子量(偏差20 mu以內),碎片離子精確分子量(偏差20 mu以內),同位素峰匹配度(最高且>80%)四個參數,來對樣品中的目標化合物做定性判定。29種化合物的色譜及質譜采集參數見表1。

2.2.3儀器定量方法的建立根據歐盟2002/657/EC[21]要求,高分辨質譜儀得到的母離子得分為2.0,子離子為2.5,因此在定量方法中,一個母離子與一個子離子即可滿足4分的定性要求。在質量誤差為20 mu窗口內提取母離子,以濃度與母離子峰面積響應值進行線性回歸定量。

2.3方法學驗證

2.3.1標準曲線的繪制根據29種抗菌藥物響應的強弱,配制不同的質量系列濃度的混合標準工作溶液,29種化合物的線性范圍由1～100 ng/mL,相關系數均大于0.99。線性方程、相關系數和線性范圍見表2。

表1　29種抗菌藥物的色譜及質譜采集參數

2.3.2方法的檢出限和回收率研究了豬肉中,29種抗菌藥物篩查方法的檢出限及回收率。取空白樣品,添加不同系列水平的混合標準溶液,繪制基質加標工作曲線。在基質中加入不同量的混合標準溶液,制成加標陽性樣品,進行前處理,將得到的樣品上機檢測,得到信噪比至少10∶1的目標化合物的最低加標濃度。即為本方法在基質中的檢出限。取空白基質,添加3個不同水平濃度的加標量,經過前處理并上機檢測,每個濃度水平做6組平行實驗,計算回收率及相對標準偏差。方法檢出限、回收率和相對標準偏差見表3。

其中磺胺多辛、磺胺氯噠嗪在各水平下的加標回收率均在60%左右,在后續實驗中,嘗試在含有Na2EDTA的Mcllvaine緩沖液中加入一定比例的乙腈,二者的回收率有所提高,考慮可能是藥物在鹽溶液中的溶解性所限,加入乙腈可以提高其溶解度,乙腈的比例有待后續工作繼續優化。

紅霉素和泰樂菌素等大環內脂類藥物在酸性提取液中的提取效率普遍不佳,在pH4.0的Mcllvaine緩沖液中回收率會受到影響,但在各加標水平上依然能穩定在60%左右,且方法檢出限在10 μg/kg,可以滿足獸藥篩查工作的要求。

表2　29種抗菌藥物的線性方程、相關系數、線性范圍

續表

表3　29種抗菌藥物的方法檢出限、回收率和相對標準偏差

2.4方法應用

應用本方法對市售豬肉進行了篩查,共計21個樣本,其中2個樣品檢出磺胺二甲基嘧啶,含量分別為51,12 μg/kg;1個樣品檢測出丹諾沙星,含量為12.2 μg/kg。為了驗證實驗結果,使用國標方法GB/T 21316-2007 《動物源性食品中磺胺類藥物殘留量的測定 高效液相色譜-質譜質譜法》和GB/T 20366-2006 《動物源產品中喹諾酮類殘留量的測定液相色譜-串聯質譜法》對檢出的陽性樣品進行了復測,檢測結果磺胺二甲基嘧啶為44,10.8 μg/kg,丹諾沙星為14.9 μg/kg,與本文方法結果吻合。

3　結論

本文利用固相萃取的凈化手段,結合超高效液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜研究建立了豬肉中,磺胺類,喹諾酮類,林可酰胺類,大環內酯類等4類29種抗菌藥物的快速篩查方法。該方法準確,靈敏,快捷,方法開放,并且進行了方法學驗證應用。適合用于食品安全風險突發事件的快速應急處置工作。

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Rapid screening of 29 kinds of antibacterial drugs in pork by UPLC-Q-TOFMS

HAO Jie,JIANG Jie*,SHAO Rui-ting,LU Yong,FENG Nan

(Beijing Municipal Center for Food Safety Monitoring,Beijing 100041,China)

A screening database for 29 kinds of antibacterial drugs including sulfonamides,fluoroquinolones,macrolides and lincosamides in meat was established by ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole-time of flight mass spectrometry. Combined with a rapid high throughput pretreatment,it can fast screen and test the antibacterial drugs in pork. Samples were extracted by Mcllvaine buffer and cleaned up by HLB solid phase extraction tube. Chromatography method was separated by BEH C18UPLC column,eluted whit gradient solvent,detected by MSEacquisition and quantitative by parent ion with exact mass. The result showed that the LOQs of 29 antibacterial drugs in matrixes were between 0.5 μg/kg and 10 μg/kg. Average recoveries in 3 different spiked levels were 50.10%～118.33%,RSD were 0.31%～14.90%. This method can achieve a high throughput,multi-components,rapid and open screening and appropriate in rapid screening antibacterial drugs in pork.

time of flight mass spectrometry;antibacterial drugs;screening

2015-08-27

郝杰(1984- )，男，碩士，工程師，研究方向：食品安全，E-mail：haojiecrab@126.com。

姜潔(1972- )，女，博士，高級工程師，研究方向:分析化學，E-mail：jybjj2004@126.com。

北京市科技計劃項目(Z121100000312014)。

TS207.3

A

1002-0306(2016)11-0293-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.052