藍莓花色苷對過氧化氫所致血管內皮細胞凋亡的保護作用

李亞巍,昌　盛,梁承武,王黎明,金　瑛

(吉林醫藥學院,藥物化學教研室,吉林吉林 132013)

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藍莓花色苷對過氧化氫所致血管內皮細胞凋亡的保護作用

李亞巍,昌盛,梁承武,王黎明,金瑛*

(吉林醫藥學院,藥物化學教研室,吉林吉林 132013)

目的:觀察藍莓花色苷對過氧化氫(H2O2)所致血管內皮細胞凋亡的保護作用及其機制。方法:人靜脈血管內皮細胞EVC-304經不同濃度藍莓花色苷(10、20、40 μg·mL-1)預培養24 h后,加入100 μmol/L H2O2再進行培養12 h。MTT法檢測細胞存活率,流式細胞儀檢測EVC-304細胞凋亡的變化,Western blot法檢測細胞內激活型Caspase-3、細胞色素C(Cyto c)、Bax和Bcl-2蛋白表達變化。結果:同正常組相比,H2O2損傷組細胞存活率顯著降低(p<0.01),細胞凋亡率顯著升高(p<0.01),激活型Caspase-3、細胞質中Cyto c表達水平,Bax/Bcl-2比值升高(p<0.01)。與H2O2損傷組相比,20 μg·mL-1和40 μg·mL-1藍莓花色苷處理組細胞存活率明顯升高(p<0.01),凋亡細胞率明顯下降(p<0.01),細胞內激活型Caspase-3,Cyto c表達,Bax/Bcl-2比值下降(p<0.01)。結論:藍莓花色苷對H2O2所致血管內皮細胞凋亡具有保護作用,其機制可能與保護線粒體功能相關。

藍莓花色苷,細胞凋亡,過氧化氫,線粒體損傷

藍莓又名篤斯越橘,屬于杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vacciniumspp.),小果類果樹品種之一,廣泛分布于世界各地。花色苷是藍莓果實中最重要的次生代謝產物[1-2]。藍莓花色苷類是一種天然的抗氧化劑,具有很強的體外抗氧化活性,具有抗菌和抗糖尿病、改善大腦記憶、減少人體膽固醇積累、促進視黃素再合成等功效,且對人體無任何毒副作用,在食品加工業和提高人類健康方面具有重要作用[3-4]。歐美國家及日本對藍莓花色苷的研究已多年,但我國藍莓花色苷研究剛剛起步[5-6],對藍莓花色苷的研究還不夠深入,對藍莓花色苷的抗氧化研究主要通過化學模擬方法評價其抗氧化效果,其作用機制還不淸楚。

內皮細胞損傷誘導產生的活性氧自由基(ROS)在血管疾病發展早期起著重要的作用,ROS引起的氧化損傷會導致血管內皮細胞內脂質、蛋白以及酶的損傷,引起細胞功能受損和發生嚴重的凋亡。作為最重要的ROS成員之一的H2O2能輕易地穿過細胞膜損傷鄰近的組織,被廣泛的用于體外模型中誘導氧化應激。氧化應激誘導的血管內皮細胞凋亡在心血管疾病的發病機制中具有重要作用,因此研究抗氧化劑和自由基清除劑可以部分逆轉凋亡過程,可對治療心血管疾病提供有益的干預[7]。本研究采用H2O2處理血管內皮細胞,模擬氧化應激調節下血管內皮細胞的損傷,觀察藍莓花色苷對H2O2所致血管內皮細胞凋亡作用的保護作用及其機制進行研究,旨在為藍莓資源的綜合利用和開發提供參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

長白山野生藍莓8月份采收,于-80 ℃冰箱中保存備用;人臍靜脈血管內皮細胞株EVC-304由吉林醫藥學院生物化學教研室保存;小牛血清杭州四季青公司;DMEM高糖培養液美國Gibco公司;Bax、Bcl-2、caspase-3和Cyto c抗體美國Santa Cruza公司;HRP-Goatanti-RabbitIg中國北京中杉金橋生物技術有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒和ECL發光液上海碧云天生物技術研究所;硝酸纖維素膜美國密理博。其他試劑均為國產分析純。

680型全自動酶標儀美國Bio Rad;超凈工作臺(DL-CJ-1N)北京東聯哈爾濱儀器制造有限公司;細胞培養箱(MCO-18AIC)日本SANYO;倒置顯微鏡(CKX41-A32PH UIS2)日本奧林巴斯;高速臺式冷凍離心機(3-30K)德國SIGMA;Muse智能觸控細胞分析儀德國默克密理博公司。

1.2實驗方法

1.2.1藍莓花色苷的制備和含量測定花色苷是由花青素和糖以糖苷鍵結合而成的一類生物活性物質,藍莓花色苷的提取詳見參考文獻[8]。從冰箱取出冷凍保存的長白山篤斯越橘,稱重20 g,研磨至勻漿狀,按比例加入,用95%乙醇-1.5 mol/L HCl(85∶15)作為溶劑進行提取,浸提3次,每次30 min,用真空抽濾去殘渣,花色苷提取液旋轉蒸發儀進行濃縮,含量測定采用pH示差法[9]。

1.2.2細胞培養將EVC-304細胞培養于含10%小牛血清的DMEM培養液中,置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的細胞培養箱中培養24 h。待細胞長滿至培養瓶底,采用0.25%胰酶消化傳代。

1.2.3MTT實驗檢測細胞存活率取對數生長期細胞進行實驗,調整細胞密度為1×105/mL,接種于96孔板,每孔200 μL,培養24 h后隨機分為正常對照組、H2O2損傷模型組,花色苷防護組,每組設5個復孔。預先加入不同終濃度的藍莓花色苷(10、20、40 μg·mL-1)處理細胞24 h后,將濃度為100 μmol/L的H2O2加入損傷模型組和藍莓花色苷各組,每孔100 μL,處理12h。棄培養液,每孔加入100 μL新配制的0.5 mg·L-1MTT溶液,37 ℃孵育4 h,小心吸棄孔內液體,每孔再加入DMSO 150 μL,振蕩10 min,選擇490 nm波長處在酶標儀檢測各孔光吸收(A)值,按公式計算細胞活力抑制率。

細胞活力抑制率(%)=(1-A實驗組/A對照組)×100

1.2.4流式細胞儀檢測細胞凋亡取對數生長期EVC-304細胞接種于6孔培養板過夜,按照1.2.3方法分組處理后,PBS洗滌細胞1次,0.25%胰酶消化,1000 r/min離心5 min,每組收集細胞約1×105個,棄去培養液,加100 μL培養液重懸細胞。按照試劑盒說明書,每組加入100 μL Muse細胞分析儀凋亡試劑盒染料,Muse細胞分析儀檢測心肌細胞凋亡。

1.2.5免疫印跡實驗細胞按1.2.3方法分組處理后,取各組EVC-304細胞,0.25%胰酶消化,4 ℃離心收集細胞1000 r/min離心10 min,以PBS洗2次,用PIPA細胞裂解液置冰浴裂解,4 ℃、12000 r/min離心5 min,收集上清。經BCA法進行蛋白定量后,取等量樣品以12% SDS-PAGE進行電泳。電泳后將蛋白轉印至硝酸纖維素膜上,5%脫脂奶粉封閉1 h后,Bax、Bcl-2、Cyto c和Casepase-3抗體按照濃度1∶1000稀釋,孵育過夜,再以過氧化酶標記的二抗封閉液孵育1 h,用ECL顯影,化學發光成像系檢測。

2　結果與分析

2.1藍莓花色苷抑制H2O2誘導的血管內皮細胞活力降低

如圖1所示,與正常對照組相比,H2O2處理組EVC-304細胞活力顯著降低(p<0.01)。而經過不同濃度藍莓花色苷預處理組的EVC-304細胞,其增殖活性呈現升高趨勢,且隨著藍莓花色苷濃度的升高呈現一定的劑量依賴性(圖1)。同損傷組相比,20 μg·mL-1和40 μg·mL-1花色苷預處理組細胞的存活率顯著升高(p<0.01),說明藍莓花色苷對H2O2誘導的血管內皮細胞損傷具有保護作用。10 μg/mL防護組藥物作用不明顯,后續沒有進行此濃度的實驗研究。

圖1　藍莓花色苷對H2O2誘導EVC-304細胞活性降低的影響Fig.1　Effect of Blueberry anthocyanins on hydrogen peroxide-induced injury of EVC-304 cells cells activity注:##p<0.01,與正常對照組相比;**p<0.01與模型組相比,圖2、圖3同。

2.2藍莓花色苷對H2O2誘導的EVC-304細胞凋亡的影響

100 μmol/L H2O2誘導后血管內皮細胞損傷明顯,細胞凋亡率為33.72%±2.5%,與對照組相比4.45%±1.29%,顯著升高(p<0.01)。而20 μg·mL-1和40 μg·mL-1藍莓花色苷預處理組的EVC-304細胞凋亡率分別為25.38%±3.79%和13.48%±1.57%,同H2O2損傷組相比,明顯降低,差異具有統計學意義(p<0.01)。說明藍莓花色苷對H2O2誘導的血管內皮細胞凋亡具有抑制作用(圖2)。

圖2　藍莓花色苷對H2O2誘導EVC-304細胞凋亡的影響Fig.2　Effect of Blueberry anthocyanins on hydrogenperoxide-induced apoptosis of EVC-304 cells注：A：對照組；B：模型組；C：20 μg·mL-1花色苷組；D:40 μg·mL-1花色苷組。

2.3Western blot檢測細胞內蛋白表達結果

如圖3顯示,經過100 μmol/L的H2O2作用1 h后,EVC-304細胞內Bax/Bcl-2蛋白比例、激活型Caspase-3和細胞質中Cyto c蛋白表達同對照組相比明顯升高(p<0.01)。而同H2O2損傷組相比,經過不同濃度藍莓花苷預處理組細胞內Bax/Bcl-2蛋白比例、激活型Caspase-3和細胞質中Cyto c蛋白表達成呈下降趨勢(p<0.01),且隨著藍莓花色苷濃度的增加呈現一定的劑量依賴性(圖3)。

圖3　藍莓花色苷對H2O2誘導EVC-304細胞凋亡相關蛋白表達的影響Fig.3　Effects of Buleberry anthocyanidin on the eprotein express in EVC-304 cell injured by H2O2注:1. 對照組;2. H2O2損傷組;3. 20 μg·mL-1藍莓花色苷防護組;4. 40 μg·mL-1藍莓花色苷防護組。

3　結論與討論

目前許多研究者發現自由基是引起疾病的新致病因,它與生物膜中不飽和脂肪酸的弱鍵和不飽和鍵均具有高度的親和力,而且能夠進一步啟動脂質過氧化物反應鏈,進而導致酶、DNA等結構和功能的改變,從而引起動脈粥樣硬化、糖尿病、腫瘤等多種疾病的發生[10-11]。通過食用具有抗氧化能力的食物可以有效防止多種疾病的發生。近年來,學者對于各種花色苷給予了很大的關注。藍莓花色苷具有很強的抗氧化活性,是一種非常好的氧自由基清除劑,但是關于藍莓花色苷對氧化應激所致血管內皮細胞損傷研究相對較少[12]。

本研究應用H2O2處理EVC-304細胞,模擬氧化應激條件下血管內皮細胞的損傷。實驗結果表明,預先加入藍莓花色苷能夠降低H2O2對血管內皮細胞損傷,提高細胞存活率,降低細胞凋亡率,說明藍莓花色苷對氧化應激所致的血管內皮細胞凋亡具有保護作用。線粒體在細胞凋亡過程中起著樞紐作用,線粒體膜電位的下降被認為是細胞凋亡中最早發生的事件[13-14]。線粒體在細胞存亡機制中的作用越來越引起人們的重視,一方面是由于線粒體膜間隙的細胞色素C釋放至胞質后觸發caspase級聯,導致細胞死亡。另一方面,線粒體外膜上的Bcl-2蛋白家族調控細胞色素C自線粒體的釋放。實驗結果顯示,藍莓花色苷能夠抑制H2O2誘導的血管內皮細胞Caspase-3的活化,并可抑制細胞色素C的釋放,還可增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,減少促凋亡蛋白Bax 的表達,從而發揮抗凋亡作用。

綜上所述,藍莓花色苷可以提高氧化損傷所致血管內皮細胞增殖活性,并顯示出血較強的抗凋亡作用,其機制可能通過保護線粒體功能相關。本實驗從細胞水平上對藍莓花色苷的抗氧化作用進行研究,為其今后在心血管疾病治療中的應用提供理論基礎,但是具體機制仍需要進一步的深入研究。

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Protective effects of blueberry anthocyanins on hydrogen peroxide-induced injury of vascular endothelial cells

LI Ya-wei,CHANG Sheng,LIANG Cheng-wu,WANG Li-ming,JIN Ying*

(Department of pharmaceutical chemistry,Jilin medical college,Jilin 132013,China)

Objective:To investigate the protective effects of blueberry anthocyanins on hydrogen peroxide(H2O2)-induced apoptosis of vascular endothelial cells. Methods:The EVC-304 cells cultured in logarithmic growth phase were incubated with 100 μmol/L H2O2for another 12 h after pretreatment with blueberry anthocyanins(10,20,and 40 μg·mL-1)for 24 h. Cell viability was determined by MTT assay,the change of cell apoptosis were measured with cytoanalyzer,and the expression levels of Cleaved Caspase-3,Cyto c,Bax,and Bcl-2 were detected by Western blotting. Results:Compared with the normal control group,the survival rate of H2O2-treated cells was decreased and the apoptosis ratio was increased significantly(p<0.01),the proportion of cleaved Caspase-3,Cytoc and Bax/Bcl-2 was increased(p<0.01). Compared with H2O2-treated group,the survival rate of cells in blueberry anthocyanins-pretreated groups was increased significantly(p<0.01),the apoptosis rate was decreased significantly(p<0.01).The expression of intracellular cleaved caspase-3,Cyto c and Bax/Bcl-2 was decreased(p<0.01). Conclusion:Blueberry anthocyanin had protective effect on hydrogen peroxide-induced vascular endothelial cells apoptosis and the possible mechanism may be associated with protection the function of mitochondrion.

blueberry anthocyanins;apoptosis;hydrogen peroxide;mitochondrion injuries

2015-12-10

李亞巍(1984- )，女，碩士, 講師，研究方向：藥物化學，E-mail:jlmpclyw@163.com。

金瑛(1973- )，女，博士，教授，研究方向：天然藥物有效成份的研究，E-mail：lyw135@163.com。

國家自然科學基金(21102055)資助項目。

TS201.2

A

1002-0306(2016)11-0338-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.061