響應面法優化甲烷氧化菌3011高產甲烷氧化菌素的研究

范洪臣,辛嘉英,,*,王　艷,夏春谷

(1.哈爾濱商業大學食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076;2.中國科學院蘭州化學物理研究所羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室,甘肅蘭州 730000)

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響應面法優化甲烷氧化菌3011高產甲烷氧化菌素的研究

范洪臣1,辛嘉英1,2,*,王艷1,夏春谷2

(1.哈爾濱商業大學食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076;2.中國科學院蘭州化學物理研究所羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室,甘肅蘭州 730000)

利用響應面方法對甲烷氧化菌3011發酵產甲烷氧化菌素(Mb)條件進行了優化。以Mb產量為考察指標,利用Plackett-Burman設計對影響產量的7個因素進行評價,篩選出具有顯著效應的3個因素,這三個因素分別為甲醇流加量、銅離子濃度和pH。利用Box-Behnken實驗設計對顯著因素進行優化,得到產Mb的最優發酵培養條件為甲醇流加量54.1 μmol/min,pH6.39,銅17.03 μmol/L,溫度30 ℃,接種量5×106CFU/mL,通氧量30 L/h,攪拌轉速400 r/min,此條件下Mb產量為3300.2 μg/mL。由此可得響應面優化得到的生產工藝是提高Mb產量的可行方法。

響應面法,甲烷氧化菌,甲烷氧化菌素,Plackett-Burman,Box-Behnken

甲烷氧化菌(Methanotrophicbacteria,methanotrophs),是能夠以甲烷作為唯一碳源和能源進行同化和異化代謝的微生物,可以在氧氣的作用下催化甲烷等低碳烷烴或烯烴羥基化或環氧化[1],其用甲烷生長的代謝途徑如圖1。甲烷氧化菌生長代謝過程中需要大量的銅,為了獲得大量的銅,甲烷氧化菌分泌一種胞外的銅結合化合物稱為甲烷氧化菌素(Mb)[2-3],甲烷氧化菌素不僅是顆粒性甲烷單加氧酶活性所必須,而且是甲烷代謝途徑中不可或缺的一部分[4-5]。Mb結構如圖2,結構中由類似氧唑環雜環、氨基酸、硫鍵組成,賦予了其特殊的性質,可廣泛應用在抗菌、醫療和食品抗氧化上。根據Mb的還原性,近些年還發現Mb可以制備納米金、銀、鈀、金鈀合金等[6-8],為綠色制備納米貴金屬催化劑提供了良好的材料。

圖1　甲烷氧化甲烷與甲醇、甲醛同化途徑Fig.1　Pathways for the oxidation of methane and assimilation of for maldehyde注:CytC為細胞色素C,FADH甲醛脫氫酶,FDH甲酸脫氫酶。

圖2　甲烷氧化菌素結構圖Fig.2　The structure of Mb

目前國內外的文獻報導中主要集中在Mb相關合成基因[9-11]、結構[12]、性質[13]和應用上[6-8,13-17],單純提高Mb產量的文章還沒見報導,且大多數培養都以甲烷氣體為碳源。在以甲烷為碳源的條件下,由于甲烷在水中溶解度差,菌體生長相對緩慢,生成的Mb產量很低,且培養過程中甲烷氣體屬于危險氣體而不適合工業化生產,有些甲烷氧化菌也能夠以甲醇、甲基胺,甲基化含硫化合物和鹵代甲烷等一碳化合物作為碳源生長[18],因此尋找合適的一碳營養物質是提高Mb產量可行的方法。本研究利用甲醇替代甲烷為碳源用于甲烷氧化菌3011發酵生產Mb,并利用響應面法對提高Mb產量進行了探討,克服了甲烷生產Mb的弊端,為發酵提高Mb產量和實現工業化生產提供了借鑒。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

甲烷氧化菌MethylosinustrichosporiumIMV3011由俄羅斯科學院催化研究所提供;NMS培養基按文獻配制[8];實驗室所有試劑均為分析純。

UV-2550紫外-可見分光光度計日本島津公司;2-16K高速冷凍離心機美國Sigma公司;RV8V旋轉蒸發儀德國IKA公司;5BG-生化發酵罐上海保興生物設備工程公司。

1.2實驗方法

1.2.1發酵方法將MethylosinustrichosporiumIMV3011按3×106CFU/mL接入到NMS培養基中,甲醇流加量42 μmol/min,培養溫度30 ℃,pH6.6,通氧量40 L/h,攪拌速度300 r/min,銅離子濃度12 μmol/L,培養時間96 h。

1.2.2Mb制備方法Mb分離純化采用將菌體離心,發酵液用大孔樹脂HP-20吸附,70%乙醇洗脫,洗脫液旋轉蒸發后冷凍干燥,其實驗操作見文獻[5]。

1.2.3Mb測定方法在25 mL容量瓶中加入2 mL濃度為0.02 mmol/L的鉻天青(CAS)溶液,1 mL濃度為0.02 mmol/L的CuSO4溶液,4 mL濃度為0.02 mmol/L的HTDMA溶液,3 mL的Mb溶液,15 min后比色,測定605 nm波長處的吸光值(As),以同樣方法測定未加Mb溶液的吸光值(Ar)作為參比值。按Ar-As值表示Mb含量。

1.3數據統計分析

1.3.1Plackett-Burman設計根據培養條件中對響應值的影響因素,選取甲醇流加量、通氧量、銅含量、pH、溫度、接種量、攪拌轉速7個因素另添加4個虛擬因素,每個因素取高(+1)低(-1)2個水平,選用N=11的Plackett-Burman設計各因素,因素水平及編碼見表1。

表1　Plackett-Burman實驗設計因素水平及編碼Table 1　Plackett-Burman test design factors and encoding

1.3.2Box-Behnken實驗設計在Plackett-Burman設計研究基礎上,采用Box-Behnken設計法,對Mb影響的關鍵因素作進一步研究和探討,以獲得其最佳發酵水平。將Plackett-Burman設計確定的3個重要因素甲醇、銅離子含量和pH,分別記為A、B、C,以Mb產量作為響應值,記為變量Y,進行因素、水平編碼,其具體數據見表2。

表2　Box-Behnken響應面設計實驗因素水平和編碼Table 2　Response surface design test factor level and encoding in the design of Box-Behnken

2　結果與分析

2.1發酵因素對Mb產量的影響

甲烷氧化菌3011產Mb受甲醇流加量、溫度、pH、通氧量、攪拌速率、接種量、銅離子密度的影響,其影響情況如下。

2.1.1甲醇濃度對菌體密度及甲醇流加量對Mb產量的影響從圖3可以看出,菌體密度隨著甲醇濃度的升高呈先升高后降低的趨勢,當發酵液中甲醇濃度達到9 mmol/L時菌體密度達到最大,再增大甲醇濃度菌體密度下降。從甲醇濃度對菌體密度影響看,發酵液中甲醇濃度超過9 mmol/L時,甲醇濃度對細胞產生了毒性,菌體生長受到抑制從而降低了Mb產量,因此考慮流加甲醇的方式。從圖4可以看出,隨著甲醇流加量的增大,Mb產量呈現上升趨勢,當甲醇流加量達到120 μmol/min時Mb產量最大,甲醇流加量再增大時Mb產量下降。從甲醇流加量對Mb影響看,在合適的甲醇流加量范圍內,增大甲醇流加量,Mb產量是增大的,但流加量超過120 μmol/min時Mb產量降低,有可能流加量過大造成甲醇濃度過高對菌體細胞產生了毒性從而對Mb產量有了較大影響。

圖3　甲醇濃度對菌體密度的影響Fig.3　Effect of methanol on cell density

圖4　甲醇流加量對Mb產量的影響Fig.4　Effect of methanol flow on the yield of Mb

2.1.2溫度對Mb產量的影響由圖5可以看出,Mb產量隨著溫度升高而升高,當溫度達到32 ℃時,Mb產量達到最高,溫度再升高時,產量基本恒定。從溫度對Mb產量影響看,溫度可能影響了合成Mb相關酶的活性及合成這些酶相關基因的開啟[18]。

圖5　溫度對Mb產量影響Fig.5　Effect of temperature on the yield of Mb

2.1.3pH對Mb產量的影響從圖6可以看出pH6～7范圍內,Mb產量隨著pH的升高先升高后降低,pH6.5時Mb產量最大。從pH對Mb產量影響看,pH可能影響了合成Mb相關酶的活性[18],在低于和高于pH6.5條件下都不利于酶合成Mb。

圖6　pH對Mb產量的影響Fig.6　Effect of pH on the yield of Mb

2.1.4通氧量對Mb產量的影響甲烷氧化菌3011在以甲烷為碳源的代謝途徑中氧氣是必不可少的[18],從圖1代謝途徑中可以看出,甲烷和氧氣在菌體相關酶的作用下合成甲醇,從而為菌體提供了更易于生長代謝的碳源。甲烷氧化菌3011直接添加甲醇生產Mb時氧氣對產Mb影響也是比較大的,從圖7可以看出,Mb產量隨著通氧量增大而升高,通氧量達到30 L/h時Mb達到最大,再增大通氧量Mb產量變化并不大,有可能在30 L/h供氧量的條件下培養基中溶解的氧滿足了菌體代謝需要。

圖7　通氧量對Mb產量的影響Fig.7　Effect of Oxygen content on the yield of Mb

2.1.5攪拌速率對Mb產量的影響從前面所得結果看甲烷氧化菌3011以甲醇為碳源產Mb,氧氣的供給是必不可少的,發酵罐的攪拌速度能促進氣液間傳質,提高溶氧濃度有利于發酵[19],提高Mb產量。從圖8可以看出,Mb產量隨著攪拌速度的增加而升高,攪拌速度達到400 r/min時,Mb產量達到最大,再增加攪拌速度,Mb產量保持恒定。從攪拌速度對Mb產量的影響看,在一定的通氧量下,增加攪拌轉速提高了發酵液中溶解氧含量,并且使流加的甲醇快速分散到整個發酵液中,從而有利于菌體產Mb。

圖8　攪拌速度對Mb產量的影響Fig.8　Effect of Stirring speed on the yield of Mb

2.1.6接種密度對Mb產量的影響從圖9可以看出,隨著接種量的增大,Mb產量也在增大,接種量達到5×106CFU/mL時Mb產量達到最大,再增加接種量對Mb產量無較大影響。從接種量對Mb產量的影響看,在甲醇流加量恒定條件下,當接種量少時,由于菌體開始階段數量較少所以消耗甲醇也少,隨著時間的增加,甲醇的累積量過早的達到了菌體耐受甲醇的范圍,對菌體產生了毒性,從而影響了Mb產量。

表3　Plackett-Burman設計因素編碼水平實驗安排表及響應值Table 3　Design factors level test schedule and response values of Plackett-Burman

圖9　接種量對Mb產量的影響Fig.9　Effect of inoculum density on the yield of Mb

2.1.7銅離子濃度對Mb產量的影響由圖10可以看出,隨著銅離子含量增加,Mb產量先升高后降低,在銅含量30 μmol/L時Mb產量達到最大。從銅含量對Mb產量的影響看,銅離子的加入在低濃度范圍內起調控作用,尤其是在亞適量銅存在下可以誘導Mb的產生[20],隨著銅離子濃度加大,過多的銅離子對細胞產生一定毒性,Mb產量有所降低。

圖10　銅含量對Mb產量的影響Fig.10　Effect of Cu2+ content on the yield of Mb

2.2Plackett-Burman設計篩選影響液體發酵的顯著因素

2.2.1Plackett-Burman分析根據Plackett-Burman設計進行實驗所得響應值見表3。

由實驗數據擬合通過Design-Expert得到線性回歸方程:

R1=2664.58-28.25X1+32.75X2+6.42X3-8.92X4+0.75X5-13.92X6+24.75X7+16.92X8+10.25X9-13.92X10+10.75X11

其顯著性分析見表4。由表4看出,實驗因素甲醇、銅離子含量和pH對響應值Y有顯著影響。因此,選取這三個顯著影響Mb的關鍵因素,并進一步作響應面分析,以確定它們所對應的最優水平。

表6　回歸模型1的方差分析Table 6　Variance analysis of regression model 1

表4　Plackett-Burman設計中各因素的顯著性分析Table 4　The significance of each factor in the design of Plackett-Burman

注：“+”表示顯著性，p<0.05。

2.2.2Box-Behnken響應面分析利用Box-Behnken實驗設計,設計3因素3水平共17個實驗點的實驗方案,其結果見表5。

表5　Box-Behnken設計實驗方案及響應值Table 5　Design test and response value in the design of Box-Behnken

運用Design-Expert軟件,按表5中的實驗數據擬合得到多元二次回歸方程如下:R1=3273.60-33.37A-10.62B+53.50C+9.00AB-11.75AC-28.25BC-68.05A2-59.05B2-77.30C2,對模型進行方差分析,分析結果見表6及表7。

由表6可看出,本實驗所選用模型具有高度的顯著性(p=0.0002);模型中,單個因素中A、C對響應值的影響顯著,交互項B與C的影響較顯著,二次項A2、B2及C2的影響也都非常顯著。模型的失擬概率僅為0.0063,說明擬合的回歸方程符合實際情況,可用此模型對發酵水平進行分析和預測。

表7　回歸模型2的方差分析Table 7　Variance analysis of regression model 2

由表7看出,相關系數R2=0.9681,校正系數R2=0.9270,即只有7.3%的降解率總變異不能由此模型進行解釋,表明模型與實際情況擬和較好。變異系數Cv=0.69%,說明模型能很好地反映真實的實驗值,即實驗的可靠性較高。

2.2.3優化為了進一步研究相關變量之間的交互作用和確定最優點,通過Design-Expert軟件做了三個關鍵影響因素對發酵水平交互影響的曲面圖(圖11～圖13),從圖可以直觀地反映出兩變量交互作用的顯著程度,結果表明B和C兩因素交互作用顯著。

圖11　因素A和B交互作用的響應面Fig.11　The interaction of response surface on the factors of A and B

圖12　因素A和C交互作用的等高線和響應面Fig.12　The interaction of response surface on the factors of A and C

圖13　因素B和C交互作用的等高線和響應面Fig.13　The interaction of response surface on the factors of B and C

由圖11～圖13中的響應面立體圖可以看出,響應值Y存在最大值。對應于響應值Y越大說明Mb發酵水平越高,其優化要求取最大值,因而在優化標準上可以對Y項選取最大值,由Design-Expert軟件得到優化結果,其結果見表8。

表8　響應面法優化結果Table 8　Optimization results of response surface method

根據計算,可得A、B、C對應實驗值A=54.1 μmol/min,B=6.39,C=17.03 μmol/L此時響應值Y取最大值,Ymax=3290.5 μg/L。由回歸方程根據效應的正負,其他因素可以取值為:溫度30 ℃,接種量5×106CFU/mL,通氧量30 L/h,攪拌轉速400 r/min。為驗證模型預測的準確性和可靠性,按照優化后的條件,并考慮到實際情況,按照甲醇流加量54.1 μmol/min,pH6.39,銅17.03 μmol/L,溫度30 ℃,接種量5×106CFU/mL發酵液,通氧量30 L/h,攪拌轉速400 r/min進行驗證實驗,所得結果為3300.2 μg/L,實驗值與模型預測值3290.5 μg/L非常接近(與模型計算值相差0.3%),表明該模型能很好地預測實際表達情況。

3　結論

將響應面分析法用于甲烷氧化菌3011提高Mb產量工藝參數的優化,確定的最佳工藝為甲醇流加量54.1 μmol/min,pH6.39,銅17.03 μmol/L,溫度30 ℃,接種量5×106CFU/mL,通氧量30 L/h,攪拌轉速400 r/min,進行驗證實驗,所得結果為3300.2 μg/L,實驗值與模型預測值3290.5 μg/L非常接近。優化得到的最佳發酵工藝是甲烷氧化菌3011利用甲醇提高Mb產量的有效途徑,為進一步工業化生產提供了可靠依據。

[1]VH David,VW Inka,H Sven,et al. Selection of associated heterotrophs by methane-oxidizing bacteria at different copper concentrations[J]. Antonie van Leeuwenhoek,2013,103(3):527-537.

[2]JA Zahn,AA DiSpirito. Membrane-associated methane monooxygenase from Methylococcus capsulatus(Bath)[J]. J Bacteriol,1996,178(4):1018-1029.

[3]HJ Kim,DW Graham,AA Dispirito,et al. Methanobactin,a copper-acquisition compound from methaneoxidizing bacteria[J]. Science,2004,305:1612-1615.

[4]DW Choi,RC Kunz,ES Boyd,et al. The membrane-associated methane monooxygenase(pMMO)and pMMO NADH:quinone oxidoreductase complex from Methylococcus capsulatus Bath[J]. J Bacteriol,2003,185(19):5755-5764.

[5]D W Choi,W E Antholine,Y S Do,et al. Effect of methanobactin on the activity and electron paramagnetic resonance spectra of the membrane-associated methane monooxygenase in methylococcus capsulatus bath[J]. Microbiology,2005,151:3417-3426.

[6]J Y Xin,LX Zhang,D D Chen,et al. Colorimetric detection of melamine based on methanobactin-mediated synthesis of gold nanoparticles[J]. Food Chemistry,2015,174:473-479.

[7]J Y Xin,D D Cheng,L X Zhang,et al. Methanobactin-Mediated One-Step Synthesis of Gold Nanoparticles[J]. Int J Mol Sci,2013,14:21676-21688.

[8]J Y Xin,K Lin,Y Wang,et al. Methanobactin-Mediated Synthesis of Gold Nanoparticles Supported over Al2O3toward an Efficient Catalyst for Glucose Oxidation[J]. Int J Mol Sci,2014,15:21603-21620.

[9]V N Khmelenina,O N Rozova,S Yu,et al. Biosynthesis of Secondary Metabolites in Methanotrophs:Biochemical and Genetic Aspects(Review)[J]. Applied Biochemistry and Microbiology,2015,51(2):150-158.

[10]W Gu,U Farhan,M Haque,et al. A TonB-Dependent Transporter is Responsible for Methanobactin Uptake by Methylosinus trichosporium OB3b[J]. Appl Environ Microbiol,2016,82(6):1917-1923.

[11]U M Farhan,B Kalidass,A Vorobev,et al. Methanobactin

from Methylocystis sp. strain SB2affects gene expression and methane monooxygenase activity in Methylosinus trichosporium OB3b[J]. Appl Environ Microbiol,2015,81(7):2466-2473.

[12]A A DiSpirito,J D Semrau,J C Murrell,et al. Methanobactin and the Link between Copper and Bacterial Methane Oxidation[J]. Microbiol Mol Biol Rev,2016,80(2):387-409.

[13]R Sesham,D Choi,A Balaji,et al. The pH dependent Cu(II)and Zn(II)binding behavior of an analog methanobactin peptide[J]. Eur J Mass Spectrom,2013,19(6):463-473.

[14]B S Baral,N L Bandow,A Vorobev,et al. Mercury binding by methanobactin from Methylocystis strain SB2[J]. J Inorg Biochem,2014,141:161-169.

[15]A Vorobev,S Jagadevan,B S Baral,et al. Detoxification of mercury by methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b[J]. Appl Environ Microbiol,2013,79(19):5918-5926.

[16]張鐵男,辛嘉英,張秀鳳.甲烷氧化菌素催化納米金合成[J]. 分子催化,2013,27(2):192-196

[17]辛嘉英,姜加良,張帥.甲烷氧化菌素-銅配合物催化過氧化氫氧化對苯二酚[J].高等學校化學學報,2013,34(5):1233-1239

[18]S H Richard,E H. Thomas. Methanotrophic Bacteria[J]. Microbiological Reviews,1996,60(2):439-471.

[19]溫擁軍,游玟娟,郭浪.芽孢桿菌配伍發酵菜籽粕產中性蛋白酶條件研究[J].食品工業科技,2015,36(1):166-170.

[20]辛嘉英,董靜,閆超澤.甲烷氧化菌素的產生和銅捕獲作用[J].中國生物工程雜,2011,31(8):40-46.

Application of response surface methodology on high yield methanobactin byMethylosinustrichosporiumIMV3011

FAN Hong-chen1,XIN Jia-ying1,2,*,WANG Yan1,XIA Chun-gu2

(1.Key Laboratory for Food Science & Engineering,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China;2.State Key Laboratory for Oxo Synthesis & Selective Oxidation,Lanzhou Institute of Chemical Physics,Chinese Academy of Sciences,Lanzhou 730000,China)

To optimize Methanobactin(Mb)fermentation conditions forMethylosinustrichosporium3011,Response Surface Methodology(RSM)were applied. The methanol flow,copper ion content and pH of seven factors were determined by Plackett-Burman design. The optimum condition was as follows:the methanol flow rate of 54.1 μmol/min,the pH of 6.39,the copper content of 17.03 μmol/L,the incubation temperature of 30 ℃,the inoculation amount of 5×106CFU/mL,the dissolved oxygen of 30 L/h,the stirring speed of 400 r/min. The optimum Mb production was 3300.2 μg/L. The RSM was feasible for high Mb production and this would improve the Mb production.

Response Surface Methodology;Methanobactin;methanotrophs;Plackett-Burman;Box-Behnken

2016-02-02

范洪臣(1978-)，男，博士，研究方向：食品科學，E-mail:fanhongchen1@sina.com。

辛嘉英(1966-)，男，博士，研究方向：生物催化，E-mail:xinjiayingvip@163.com。

國家自然科學基金項目(21073050,21573055)。

TS201.3

B

1002-0306(2016)15-0187-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.15.028