雙發射熒光探針在F-離子檢測中的應用

張志秋，張紀梅，張　坤，馬慶運

(天津工業大學 環境與化學工程學院，天津 300387)

?

雙發射熒光探針在F-離子檢測中的應用

張志秋，張紀梅，張坤，馬慶運

(天津工業大學 環境與化學工程學院，天津 300387)

利用Turkevich-Frens法制備金納米粒子，然后利用St?ber法將水熱條件下制備的摻雜Zn的CdTe量子點(CdTe∶Zn QDs)修飾在SiO2微球上得到一種熒光微球。利用AuNPs和熒光微球構建雙發射熒光探針，基于F-能夠使熒光探針的熒光恢復的原理，實現對F-的檢測。同時研究了平衡時間和pH值對該探針的影響。結果表明該探針具有較好的抗干擾性且在pH值=7.0的HEPES緩沖溶液中檢測限低達149 nmol/L。

量子點；微球；氟離子；熒光探針

0　引　言

熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 是一種非輻射的能量轉移，當兩個基團之間的距離在1～10 nm以內時，通過分子間的電偶極相互作用，將給體激發態能量轉移到受體激發態[1]。量子點由于其獨特的光學性能及尺寸效應和較高的量子產率等優點，使其在生物、環境、醫學等方面有廣泛的應用前景[2-3]，尤其是量子點獨特的熒光性能，使其在FRET廣泛應用[4]。金納米粒子(AuNPs)是一種優良的淬滅劑，具有高的淬滅系數，其吸收光譜與量子點的發射光譜有較大范圍的重疊[5]，因此，利用AuNPs對量子點的熒光淬滅效應可構建一個熒光共振能量轉移體系，實現對某種離子的檢測[1, 6-7]。為了解決量子點在水溶液中與目標分析物相互作用的問題，通常將量子點功能化修飾來提高檢測的靈敏度。Guo等[8]合成了表面帶正電荷CdTe QDs和帶負電荷AuNPs，實現了對Pb2+的檢測。

陰離子的檢測在化學監測中占有重要的地位，其中氟離子檢測尤為重要[9]。氟離子廣泛地存在自然界中，且是人體必須的微量元素之一。但是，過量的氟使得釉原蛋白在成熟階段存留時間延長，從而抑制釉質晶體生長，對人體造成危害。近年來已有不少關于氟離子化學傳感器的報道，但存在靈敏度低，便捷性差等缺點[10-11]。Tao Wu等將 NBDAE共聚合成新的熒光聚合物，用于構建熒光探針來檢測F-1，其檢測限接近0.8 μmol/L。

本文通過水熱法合成了高熒光量子產率和光穩定的摻雜Zn的CdTe QDs，降低了CdTe QDs的毒性，減少了對環境的污染。以此為基礎利用St?ber法合成一種修飾量子點的SiO2熒光微球[13]，討論并優化了影響熒光微球與AuNPs之間的體系的條件。同時基于F-能夠恢復熒光微球的熒光的原理，構建了雙共振能量轉移熒光探針，實現了對水溶液中F-1的靈敏檢測，在環境監測中具有重要的意義。

1　實　驗

1.1金納米粒子的合成

采用Turkevich-Frens法[14-15]制備AuNPs。即向燒瓶中加入98 mL的二次水和1 mL氯金酸(1%(質量分數))，加熱回流至95 ℃，加入2 mL的檸檬酸鈉(1%(質量分數))，反應25 min，冷卻后得到AuNPs溶液。

1.2紅色量子點的合成和表面修飾

采用水熱法合成CdTe∶Zn QDs[16-17]。取40 mL乙醇和1 mL紅色(650 nm)CdTe∶Zn QDs溶液及0.5 mL TEOS加入燒瓶中，攪拌30 min后，加入1 mL25%的氨水，密封攪拌24 h。然后，再加入50 μL APTES和25 μL TEOS，反應12 h。離心分離后，得到包覆紅色量子點的SiO2微球，將其溶解在二次水中，超聲分散備用。

1.3雙發射熒光微球的制備

取1 mL綠色CdTe∶Zn QDs溶液和0.5 mL修飾氨基的紅色量子點[18]及8 mL PBS緩沖液加入燒瓶中，再加入2 mg EDC·HCl和2 mg NHS，避光攪拌12 h，離心分離。最后將沉淀溶于二次水中，超聲分散備用。

1.4氟離子的檢測

為了研究熒光微球與AuNPs之間的能量轉移，在熒光微球溶液中加入不同濃度的AuNPs，用緩沖溶液(pH值=7)稀釋至2 mL，反應30 min后，測定混合液的熒光強度。

在AuNPs與熒光微球的能量體系中加入不同濃度的F-1，然后稀釋至2 mL，反應10 min后，測量體系的熒光強度，研究體系能量轉移的關系，從而實現對F-1的檢測。

2　結果與討論

2.1金納米粒子的TEM圖

從圖1可以看出，合成的AuNPs的粒徑分布比較均一，粒子間穩定分散且沒有團聚，經測定其粒徑為15 nm。

圖1　AuNPs的TEM圖

2.2雙發射熒光微球的TEM圖

圖2(a)為SiO2包裹紅色量子點熒光納米微球(QDs紅色-SiO2)的TEM圖，圖2(b)為外包綠色量子點的SiO2紅色量子點熒光納米微球(QDs紅色-SiO2-QDs綠色)的TEM圖。

圖2　熒光微球TEM圖

由圖2可看出，合成的熒光納米粒子顆粒較均勻，QDs紅色-SiO2大小約為100 nm，QDs紅色-SiO2-QDs綠色大小約為101 nm，表明外包綠色量子點并沒有引起SiO2球粒徑太大的變化。同時，從圖2(a)可知，紅色量子點已經被均勻地包進了SiO2微球且圖2(b)顯示微球表面由于連接綠色量子點變得粗糙。TEM圖表明成功合成了雙發射熒光微球。

2.3雙發射熒光微球的發射光譜與AuNPs的吸收光譜

熒光微球的熒光發射光譜與AuNPs的紫外吸收光譜如圖3所示。從圖3可知，熒光微球的熒光發射光譜與AuNPs的紫外吸收光譜有較大范圍的重疊，尤其是量子點在530 nm左右的發射峰幾乎完全重疊，因此AuNPs能夠使雙發射量子點發生熒光淬滅，故AuNPs與該量子點能構建一個能量共振轉移體系。

圖3熒光微球的熒光發射光譜與AuNPs的紫外吸收光譜

Fig 3 The fluorescence emission spectrum of fluorescent microspheres and UV absorption spectrum of AuNPs

2.4雙發射熒光微球與AuNPs體系的相互作用平衡時間的選擇

本文在pH值=7.0，10 mmol/L HEPES緩沖液中研究了平衡時間對雙發射熒光微球和AuNPs能量體系的影響。結果如圖4所示，從圖4可知，隨著平衡時間的增加，AuNPs的淬滅效率逐漸增強，25 min后基本不變，在后續實驗中可以選擇30 min作為二者相互作用的時間。

圖4　不同時間下熒光微球的淬滅效率

Fig 4 The effect of the time on the quenching efficiency of fluorescent microspheres

2.5雙發射熒光微球與AuNPs體系的相互作用pH值的選擇

維持體系中AuNPs的濃度為1 nmol/L，pH值對雙發射熒光微球與AuNPs能量體系的影響如圖5所示。

圖5　不同pH值下熒光微球的淬滅效率

從圖5可看出，不同pH值下熒光微球的淬滅效率明顯不同，在pH值<7.0時，AuNPs對熒光微球有較好的淬滅效率，隨著pH值的增大，淬滅效率逐漸降低。考慮到熒光微球與AuNPs的穩定性選擇pH值=7.0。

2.6雙發射熒光微球與AuNPs體系的相互作用

本文研究了pH值=7.0時AuNPs濃度對雙發射熒光熒光探針體系的影響得到圖6(a)，圖6(b)為對應的淬滅效率曲線。其中，I0和I分別為AuNPs不存在和存在時熒光微球穩定的熒光強度，(I0-I)/I0表示熒光淬滅效率。

由圖6可知，隨著AuNPs濃度的增加，熒光微球的淬滅效率逐漸增強，當AuNPs濃度達到1 nmol/L后，淬滅效率的變化趨于平緩且溶液顏色由粉紅色逐漸變紫，AuNPs濃度越高，顏色變化越明顯。

圖6　不同AuNPs濃度下雙發射熒光微球熒光淬滅譜和淬滅效率曲線圖

2.7雙發射熒光探針對F-的檢測

不同濃度F-對熒光體系熒光強度恢復的影響如圖7(a)所示，并以(I-I0)/I0的值對F-濃度作圖，得到圖7(b)所示的恢復效率曲線，其中，I0和I分別為F-不存在和存在時雙發射熒光探針穩定的熒光強度，(I-I0)/I0表示熒光恢復效率，圖7(c)為熒光探針熒光恢復效率的擬合直線。

圖7　不同F-濃度下探針的熒光譜圖和熒光效率增強曲線及擬合曲線

Fig 7 The fluorescence spectra of fluorescence probe; the curves of fluorescence efficiency enhancement; the fitting lines at different concentrations of F-

從圖7(a)和(b)可以看出，當F-加入探針體系后，探針的熒光強度增強且熒光增強效率也逐漸提高，外層量子點(FERT-1)的增強效率要高于內層量子點(FRET-2)。由圖7(c)的直線方程可算出未知的F-濃度C(C=(C1+C2)/ 2)。實驗中選取10 μmol/L，F-標液做11組平行實驗，根據所得數據算出增強效率的標準方差(SD)，根據下列公式

可計算出該熒光探針的檢測限(LOD)。

表1熒光探針的檢測限

Table 1 The detection limit of the fluorescence probe

HEPES檢測限FRET-1FRET-2149nmol/L340nmol/L

2.8特異性實驗

在特異性實驗中，分別向體系中加入50 μmol/L Cl-、Br-、I-、SO42-、NO3-、HPO4-和Ag+、Hg+、Pb2+、K+、Na+等干擾離子，測量對應的熒光強度值，用(I-I0)/I0的比值作圖。得到圖8所示的熒光增強(淬滅)效率圖，其中I0和I分別為離子不存在和存在時熒光探針的熒光強度，(I-I0)/I0表示熒光增強效率，負值表示探針的熒光強度減弱。結果表明該熒光探針具有較好的特異性，在陰離子溶液中可以實現對F-的特異性檢測。

2.9F-離子的檢測機理

在檢測F-的體系中，隨著AuNPs的加入，熒光微球的熒光強度逐漸減弱，兩者之間發生了圖9中所示的熒光共振能量轉移(FRET-1和FRET-2)，其作用機理是熒光微球表面的巰基丙酸與AuNPs表面的檸檬酸之間形成氫鍵[19]，其相應的O—H鍵(dO-H=1.08，WBI=0.116)和氫橋鍵(dOH…O=1.41，WBI=0.053) 使得在巰基丙酸和檸檬酸之間存在高的結合能，最終導致熒光淬滅。當加入F-后， 由于F-與檸檬酸的結合能及其與巰基丙酸的結合能遠遠高于巰基丙酸與檸檬酸之間的結合能，所以F-迅速與橋氫反應，同時結合AuNPs，使得熒光微球與AuNPs之間的氫鍵斷裂，即FERT被終止，導致熒光微球的熒光得到恢復，從而實現對F-的檢測。

圖8　不同離子作用下的熒光增強(淬滅)效率圖

Fig 8 Schematic of fluorescent probes enhancement (quenching) efficiency in different ions

圖9　雙發射熒光探針對F-檢測的過程示意圖

3　結　論

利用St?ber法合成了一種修飾量子點的雙發射的熒光微球，探討了熒光微球與AuNPs之間的相互作用，由于熒光微球表面的巰基丙酸與AuNPs表面的檸檬酸之間形成氫鍵，從而發生熒光共振能量轉移(FRET)。而F-能夠和熒光微球與AuNPs之間的橋氫反應，恢復熒光微球的熒光，從而實現對F-的檢測。通過特異性實驗可知該該熒光探針具有很強的抗干擾性且檢測限低達149 nmol/L。

[1]Chen G, Song F, Xiong X, et al. Fluorescent nanosensors based on fluorescence resonance energy transfer (FRET) [J]. Industrial and Engineering Chemistry Research, 2013, 52 (33): 11228-11245.

[2]Biju V, Itoh T, Anas A, et al. Semiconductor quantum dots and metal nanoparticles: syntheses, optical properties, and biological applications [J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2008, 391 (7): 2469-2495.

[3]Chen L, Han H. Recent advances in the use of near-infrared quantum dots as optical probes for bioanalytical, imaging and solar cell application [J]. Microchimica Acta, 2014, 181 (13-14): 1485-1495.

[4]Wang X, Sheng P, Zhou L, et al. Fluorescence immunoassay of octachlorostyrene based on forster resonance energy transfer between CdTe quantum dots and rhodamine B [J]. Biosensors and Bioelectronics. 2014, 60: 52-56.

[5]Aldeek F, Ji X, Mattoussi H. Quenching of quantum dot emission by fluorescent gold clusters: what it does and does not share with the forster formalism [J]. Journal of Physical Chemistry C, 2013, 117(29): 15429-15437.

[6]Lim K R, Ahn K S, Lee W Y. Detection of concanavalin a based on attenuated fluorescence resonance energy transfer between quantum dots and mannose-stabilized gold nanoparticles [J]. Analytical Methods, 2013, 5 (1): 64-67.

[7]Zhang S, Wu H, Huan S, et al. Gold nanoparticle based fluorescence resonance energy transfer immunoassay for the detection of the histone deacetylase activity using a fluorescent peptide probe [J]. Analytical Letters, 2013, 46 (13): 2029-2039.

[8]Wang X, Guo X. Ultrasensitive Pb2+detection based on fluorescence resonance energy transfer (FRET) between quantum dots and gold nanoparticles [J]. Analyst, 2009, 134 (7): 1348-1354.

[9]Chetia B, Iyer P K. Selective fluoride anion sensing by simple benzimidazolyl based ligand [J]. Sensors and Actuators B Chemical, 2014, 201: 191-195.

[10]Wade C R, Broomsgrove A E, Aldridge S, et al. Fluoride ion complexation and sensing using organoboron compounds [J]. Chem Rev, 2010, 110(7): 3958-3984.

[11]Liu B, Tian H. A ratiometric fluorescent chemosensor for fluoride ions based on a proton transfer signaling mechanism [J]. Journal of Materials Chemistry, 2005, 15 (27-28): 2681-2686.

[12]Wu T, Zou G, Hu J, et al. Fabrication of photoswitchable and thermotunable multicolor fluorescent hybrid silica nanoparticles coated with dye-labeled poly(N-isopropylacrylamide) brushes [J]. Chemistry of Materials, 2009, 21 (16): 3788-3798.

[13]Wang C G, Ma Z F, Su Z M. Synthesis and self-assembly of silica-coated anisotropic gold nanoparticle films [J]. Nanotechnology, 2006, 17(8):1819-1824.

[14]Turkevich J, Stevenson P C, Hillier J. A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold [J]. Discussions of the Faraday Society, 1951, 11: 55-75.

[15]Frens G. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions [J]. Nature, 1973, 241(105): 20-22.

[16]Zhang H, Wang L, Xiong H, et al. Hydrothermal synthesis for high-quality CdTe nanocrystals [J]. Advanced Materials, 2003, 15 (20): 1712-1715.

[17]Zhao D, Fang Y, Wang H, et al. Synthesis and characterization of high-quality water-soluble CdTe∶Zn2+quantum dots capped by N-acetyl-l-cysteine via hydrothermal method [J]. Journal of Materials Chemistry， 2011, 21(35): 13365-13370.

[18]Wang Y Q, Zhao T, He X W, et al. A novel core-satellite CdTe/silica/Au NCs hybrid sphere as dual-emission ratiometric fluorescent probe for Cu2+[J]. Biosensors and Bioelectronics, 2014, 51: 40-46.

[19]Chen S J, Chang H T. Nile red-adsorbed gold nanoparticles for selective determination of thiols based on energy transfer and aggregation [J]. Analytical Chemistry, 2004, 76 (13): 3727-3734.

Dual emission fluorescent probefor the detection of F-

ZHANG Zhiqiu, ZHANG Jimei, ZHANG Kun, MA Qingyun

(School of Environment and Chemical Engineering, Tianjin Polytechnic University, Tianjin 300387,China)

The AuNPs were first synthesized by turkevich-frens method and SiO2fluorescent microspheres modified Zn doped CdTe QDs (CdTe∶Zn) were prepared using St?ber process. Next, we built fluorescent probes using AuNPs and fluorescent microspheres. Because of the ability to restore the fluorescence intensity of fluorescent probes, the F-ion could be detected by such probes. At the same time, the fluorescence intensity might be influenced by pH value and equilibrium time in the detect process. The results showed that fluorescent probes have good anti-interference and detection limit was as low as 149 nmol/L in HEPES buffer solution at pH=7.0.

quantum dots; microspheres; fluoride ions; fluorescent probe

1001-9731(2016)08-08128-05

國家自然科學基金資助項目(21106101);天津市應用基礎及前沿技術研究計劃資助項目(12JCZDJC29500);天津市青年基金資助項目(13JCQNJC06300)

2015-05-12

2015-07-05 通訊作者：張紀梅，E-mail: zhangjimei6d311@163.com

張志秋(1991-)男，山東鄆城人，在讀碩士，師承張紀梅教授，從事熒光納米材料方面研究。

O657

A

10.3969/j.issn.1001-9731.2016.08.022