均布載荷對膠原纖維取向性的誘導作用及ZnO纖維的模板法生長

柳浩然，于　美，劉建華，李松梅

(北京航空航天大學 材料科學與工程學院，北京 100191)

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均布載荷對膠原纖維取向性的誘導作用及ZnO纖維的模板法生長

柳浩然，于美，劉建華，李松梅

(北京航空航天大學 材料科學與工程學院，北京 100191)

在分子擁擠環境及均布載荷下，利用Ⅰ型膠原蛋白制得定向有序排列的膠原纖維。以定向有序膠原纖維為模板，負載Zn2+，高溫煅燒后制得ZnO纖維。利用掃描電鏡(SEM)、X射線衍射(XRD)、物性分析儀對膠原纖維形貌和力學性能以及ZnO纖維形貌進行了表征，討論了均布載荷作用及膠原蛋白濃度對膠原纖維定向性的影響，膠原蛋白濃度及Zn2+濃度對ZnO生長形貌的影響等。結果表明，分子擁擠環境下，施加在膠原溶液上的均布載荷對成膠后的膠原纖維的取向存在誘導作用，使膠原纖維呈定向有序排列。定向排列的膠原纖維拉伸強度高于非定向膠原纖維約56%。低濃度膠原蛋白/Zn2+溶液可形成保留了膠原纖維形貌的ZnO纖維。

膠原纖維；取向性；誘導作用；ZnO纖維；模板法

0　引　言

膠原蛋白是自然界中豐富的資源，骨頭[1]、鱗片[2]等重要生物組織的主要成分就是膠原蛋白，這些生物組織中，膠原纖維往往呈定向有序排列。當這些生物組織受損時，利用外界材料對其進行修復和移植便顯得尤為重要，因此選擇合適的材料對受損組織進行修復和移植也成為了生物醫學工程的一個重要研究方向。醫學中使用鈦合金、高分子材料等作為修復材料植入人體，結果表明這些材料能夠在一定程度上替代受損組織，但是生物體對這些材料的排斥作用是困擾醫學工作者多年的問題。因此，利用與受損組織相同的材料，即膠原蛋白來制備修復或移植材料便受到了科研人員的關注[3]，而制備定向有序膠原纖維便成為了研究的基礎[4]。

研究人員在人工合成有序膠原纖維方面進行了大量的探索，例如采用模板法[5]、剪切流沉積[6]、磁致有序[7]、納米纖維素共混法[4]來制備有序膠原纖維。Saeidi等[8]采用分子擁擠法制備了膠原纖維陣列，這種方法是將高濃度的膠原蛋白溶液放置于分子擁擠的環境中，進而成膠制備出有序膠原蛋白纖維陣列。這些方法在制備有序膠原蛋白纖維陣列以及揭示膠原蛋白自組裝機理方面起到了巨大的指導作用。

ZnO作為一種性能優異的半導體材料，在近十年來得到了充分的研究，并在催化、壓電等領域有著廣泛的應用[9-11]。而一維ZnO以其較高的比表面積成為了一個研究熱點，其制備方法包括氣相沉積法[12]、溶膠凝膠法、模板法[13-14]等。在模板法制備ZnO納米線中，科研人員利用動物皮毛等生物組織為模板來制備ZnO納米線，為制備ZnO納米線提供了一種簡單高效、成本低廉的方法。

膠原分子呈棒狀，直徑為1.5 nm，長度為300 nm，是由3條左手螺旋多肽鏈相互纏繞形成的右手3股螺旋結構[15]，原膠原再首尾相接形成高比表面積的膠原微纖維[16]，膠原微纖維進而聚集成束形成膠原纖維。膠原分子中含有豐富的活性基團，如—OH、—COOH、—NH2等，這些活性基團能與Cr(Ⅲ)、Zr(Ⅳ)、Ti(Ⅳ)等配位結合[17]。王學川等[18]研究了Al(Ⅲ)改性膠原蛋白的結構，其原理則是利用了Al(Ⅲ)能夠與膠原蛋白分子結合。金屬離子與膠原纖維結合后，通過適當的方法除去膠原纖維，可得到保留膠原纖維結構的金屬氧化物[19-20]。研究表明，Zn的醋酸鹽與膠原蛋白可形成配合物[21]，因此以膠原蛋白為模板，可制備得到ZnO纖維。

本文在膠原蛋白溶液上施加均布載荷，制得了確定方向的同向有序膠原纖維。在制備得到膠原纖維的基礎上，嘗試以膠原纖維為模版，負載Zn2+，煅燒去除膠原模版后制得ZnO纖維，討論了均布載荷、膠原蛋白溶液濃度對膠原纖維定向性的影響以及膠原蛋白溶液濃度、Zn2+濃度對ZnO形貌的影響。

1　實　驗

1.1實驗材料

Ⅰ型膠原蛋白海綿，成都市科樂生物技術有限公司；氨水；乙醇；醋酸鋅(北京藍弋化工產品有限公司)，以上所用藥品均為分析純，實驗均使用去離子水。

1.2定向有序膠原纖維的制備

(1) 分別取1，1.5和2 g膠原海綿，加入10 mL去離子水中，持續攪拌使其完全溶解(在此濃度下，膠原蛋白溶液已不具有流動性)，制得100，150和200 mg/mL的膠原蛋白溶液。取部分膠原蛋白溶液，放置于由3塊玻璃板構成的狹長空間中，另取一塊玻璃板覆蓋在膠原蛋白溶液上，向下按壓玻璃板使膠原蛋白受力變形，待膠原蛋白溶液變形穩定后，4 ℃下保存4 h。之后將樣品放置于密封袋中，在密封袋中滴加10 mL氨水(避免氨水與膠原蛋白接觸)，密封，室溫下成膠4 h，制備過程如圖1所示。之后將膠原蛋白膠體取出，梯度乙醇脫水，臨界點干燥，制得膠原海綿，為了更好的觀察形貌，將樣品表層剝離。

(2)取部分膠原蛋白溶液，填充至圓筒形鋁片中，減小圓筒直徑，使膠原蛋白溶液受徑向均布載荷而軸向拉伸，穩定后4 ℃下保存4 h,制備流程如圖1所示。之后在密封袋中成膠4 h，將膠體取出后，梯度乙醇脫水，臨界點干燥，得到柱形膠原海綿。

圖1　定向有序膠原纖維制備示意圖

Fig 1 Schematic diagram of preparation of oriented collagen fiber

1.3非定向有序膠原纖維的制備

取2 g膠原海綿，加入10 mL去離子水中，持續攪拌使其完全溶解，制得200 mg/mL的膠原蛋白溶液。取部分膠原蛋白溶液，揉捏使其呈條狀，然后放置于氨氣氣氛中，室溫下成膠4 h。之后將膠原蛋白膠體取出，梯度乙醇脫水，臨界點干燥，制得非定向膠原海綿。

1.4ZnO纖維的制備

取0.5，2 g膠原海綿，分別加入10 mL 0.1，1 mol/L醋酸鋅溶液中持續攪拌，使其完全溶解，制得不同膠原蛋白濃度和Zn2+濃度的溶液。4 ℃下保存12 h得到負載Zn2+的膠原蛋白溶液。之后按照定向有序膠原纖維的制備方法制得負載Zn2+中間體的膠原海綿，500 ℃下煅燒2 h去除膠原蛋白，收集產物。

1.5測試與表征

SEM分析采用XL30 S-FEG 掃描電子顯微鏡(SEM)下觀察，加速電壓為20 kV。

XRD測試采用D/max2550HB+/PC X射線衍射儀，CuKα靶，掃速為2θ=10(°)/min，掃描范圍20～80°。膠原纖維拉伸強度采用TMS-Pro 物性分析儀測試，測試樣品為200 mg/mL膠原蛋白溶液制得的定向和非定向膠原纖維。膠原纖維樣品長度為10 mm，直徑為2 mm。測試樣品數分別為3，測試速度為1 mm/min。

2　結果與討論

2.1均布載荷對膠原纖維定向性的影響

圖2(a)為未施加均布載荷條件下制備的膠原纖維，在此條件下生成的膠原纖維取向不一，雜亂排列，多呈扭曲狀態。圖2(b)為玻璃板之間形成的膠原纖維，圖2(c)為鋁筒中形成的膠原纖維，兩幅圖中均可觀察到膠原纖維呈定向有序排列，膠原纖維大致呈直線狀態。由于所采用的膠原蛋白溶液為高濃度膠原蛋白，將其放在模具中，膠原分子會處于分子擁擠環境中。膠原分子為三維螺旋結構，其長度約為300 nm，而直徑只有1.5 nm[15]，具有很高的長徑比，比表面積很高。分子擁擠環境下，高比表面積的原膠原會自發地沿其長軸聚集排列，一旦原膠原分子沿某一方向排列，原膠原分子獲得的平移熵遠大于其轉動熵，導致沿此方向的整齊排列狀態為穩定狀態[8, 22]。而要想得到確定取向的膠原纖維，需要施加一個誘導條件，本文所采用的誘導條件為確定方向的均布載荷，使膠原蛋白溶液只能沿特定方向伸長從而實現定向膠原纖維的制備。

圖2(b)與2(c)雖在不同的模具中形成，但施加在其上的條件是相同，即均布載荷的作用。玻璃板中形成的膠原纖維呈長方體，玻璃板的限制作用使膠原蛋白溶液受到四面均布載荷的作用，鋁筒中形成的膠原纖維呈圓筒狀，同理，鋁筒的限制使膠原蛋白溶液受到均布徑向力的作用。高濃度膠原蛋白溶液在兩種模具中處于分子擁擠環境中，膠原分子傾向于沿某一方向排列。兩種模具使膠原蛋白溶液承受均布載荷，在均布載荷的作用下，膠原蛋白溶液只能沿垂直于均布載荷的方向伸長，分子間作用力使得膠原蛋白分子難以產生扭曲，從而形成定向膠原纖維，如圖2(d)所示。

2.2膠原蛋白溶液濃度對膠原纖維定向性的影響

圖3(a)-(c)分別對應100，150和200 mg/mL膠原蛋白溶液在施加均布載荷條件下所生成的膠原纖維。可以很明顯地觀察到膠原纖維排列隨著膠原蛋白溶液濃度的增加而變得更加致密，有序程度更高。圖3(a)中的膠原纖維之間具有較大的間隙，且纖維之間取向存在一定的角度，并非嚴格的定向排列。圖3(c)中在同樣的放大倍數下已看不到明顯的間隙，說明高濃度的膠原蛋白溶液所生成的膠原纖維更加致密，定向性更好。 膠原分子含有豐富的官能團[15]，膠原分子之間作用復雜。因此膠原分子的排列會大致同向，但并不是嚴格的致密排列。濃度越低，膠原分子之間間隙越大，填充在其中的水分子越多，臨界點干燥后，存在較大的間隙。濃度越高，膠原分子間間隙越小，填充在其中的水分子越少，故而可以形成較為致密的纖維排列。

圖2(a)未施加均布載荷條件下制備的膠原纖維SEM圖，(b)玻璃板間形成的膠原纖維SEM圖，(c)鋁筒間形成的膠原纖維SEM圖，(d)均布載荷作用下膠原分子重排示意圖

Fig 2 (a) SEM image of collagen fibers produced without applying uniform load, (b) SEM image of collagen fibers produced between glass sheets, (c) SEM image of collagen fibers produced in aluminum tube, (d) schematic representation of realignment of collagen molecules under uniform load

圖3(a)100 mg/mL膠原蛋白溶液生成的纖維SEM圖，(b)150 mg/mL膠原蛋白溶液生成的纖維SEM圖，(c)200 mg/mL膠原蛋白溶液生成的纖維SEM圖

Fig 3 (a) SEM image of collagen fibers with a concentration of 100 mg/mL, (b) SEM image of collagen fibers with a concentration of 150 mg/mL, (c) SEM image of collagen fibers with a concentration of 200 mg/mL

2.3膠原纖維拉伸強度

圖4中黑色曲線為定向膠原纖維的拉伸曲線，黑色虛線為非定向膠原纖維的拉伸曲線。計算得到定向膠原纖維能夠承受的最大拉伸應力比非定向膠原纖維的最大拉伸應力增加了約56%。膠原蛋白所構成的纖維常常作為承力組織，承受拉伸應力。而取向一致的膠原纖維能夠增強其拉伸強度。非定向膠原纖維中，當承受某一個方向的拉伸應力時，由于膠原纖維雜亂排列，取向不一，部分纖維無法作為承力纖維，導致整體能夠承受的最大拉伸應力大大減少。而定向膠原纖維中所有纖維均作為承力纖維，如此便大大提高了膠原海綿的拉伸強度。

圖4　定向與非定向膠原纖維的拉伸應力-應變曲線

Fig 4 Tensile stress-strain curves for oriented collagen fiber and non-oriented collagen fiber

2.4ZnO纖維的表征

圖5為ZnO、負載Zn2+膠原纖維煅燒后的XRD圖譜。從圖中可以看出，煅燒產物的XRD圖與ZnO標準卡片相吻合，說明煅燒后產物為ZnO。

圖5負載Zn2+膠原纖維煅燒后XRD圖譜及ZnO XRD圖譜

Fig 5 XRD patterns of ZnO after calcination treatment of collagen fiber

不同濃度膠原蛋白/Zn2+溶液成膠煅燒后得到的ZnO形貌如圖6所示。圖6(a)為以含50 mg/mL膠原蛋白、0.1 mol/L醋酸鋅溶液制備而成的ZnO纖維，可以清晰地看到ZnO呈現纖維狀，且良好地保留了膠原纖維的形貌，主纖維之間存在間距，纖維之外并未看到ZnO顆粒的形成。圖6(b)為以含50 mg/mL膠原蛋白、1 mol/L醋酸鋅溶液制備而成的ZnO纖維，同樣可以看到呈纖維狀的ZnO，但同時也存在連成片狀的ZnO，但并未見到大塊的ZnO顆粒。圖6(c)為含200 mg/mL膠原蛋白、0.1 mol/L醋酸鋅溶液制備而成的ZnO，圖中并未觀察到纖維狀的ZnO，而是呈現較粗的緊密接觸的條狀結構，可以清晰地看到嵌在結構中的ZnO顆粒，同時可以看到少量的ZnO顆粒已經露出。圖6(d)為含200 mg/mL膠原蛋白、1 mol/L醋酸鋅溶液制備而成的ZnO，圖中依稀可以觀察到保留了膠原纖維的條紋結構，但是整體呈塊狀，表面呈現多孔網狀結構。同時表面散布著較多的ZnO顆粒。

圖6　不同濃度膠原蛋白/醋酸鋅溶液所制備的ZnO SEM圖

單根膠原纖維的直徑范圍為50～500 nm，Zn2+負載在膠原纖維上。煅燒過程既除去膠原纖維，也生成ZnO附著在膠原纖維上的Zn2+可以反應生成附著在膠原纖維上的ZnO，在煅燒過程中，ZnO存在一個生長過程，附著在膠原纖維上的ZnO纖維直徑變大，沒有附著在膠原纖維上的Zn2+反應生成非纖維狀的ZnO。因此想要得到纖維狀的ZnO纖維，就需要膠原纖維上有足夠的附著位點和膠原纖維間有足夠的生長空間。而膠原纖維之間的間隙大小和附著位點多少是與膠原蛋白溶液濃度有關系的，高濃度的膠原蛋白溶液生成的膠原纖維間隙較小，而且由于纖維之間緊密接觸，附著位點較少。因此膠原蛋白溶液濃度可以影響ZnO纖維的生成。而Zn2+在膠原蛋白溶液中的濃度同樣是影響ZnO最終形貌的因素， Zn2+濃度過高，使得Zn2+無法完全附著在膠原纖維上，也會由于ZnO纖維生長的尺度超過膠原纖維之間的空間而形成片狀或塊狀ZnO。50 mg/mL膠原蛋白溶液形成的膠原纖維之間間隙是微米級別的，足夠ZnO纖維的生長。含50 mg/mL膠原蛋白、0.1 mol/L的Zn2+溶液成膠煅燒后可形成ZnO纖維，而含1 mol/L的Zn2+溶液由于較高的Zn2+濃度，成膠煅燒后使得ZnO在較大的膠原纖維間隙中生長形成片狀。200 mg/mL膠原蛋白溶液形成的膠原纖維之間間隙只有幾十納米，而且許多膠原纖維之間也是互相緊密接觸。較少的附著位點使得膠原纖維只能吸附較少的Zn2+，較小的間隙使得ZnO在高濃度膠原纖維之間的生長大大受限。從圖6(c)可以看出，在高濃度膠原蛋白、低濃度Zn2+條件下，ZnO覆蓋在膠原纖維表面，但整體連在一起，而且可以看到嵌在其中的ZnO顆粒，表明ZnO在其內部是無法沿徑向生長，而只能形成晶體逸出表面。在高濃度膠原蛋白，高濃度Zn2+條件下，這種狀況更加明顯，雖然在表面仍能看到膠原纖維結構的痕跡，但是ZnO已經明顯不呈纖維狀，而且有較多的ZnO顆粒散布在塊體之外。

綜上所述，膠原蛋白溶液濃度和Zn2+濃度對最終形成的ZnO形貌均有影響，即膠原纖維上的附著位點多少和膠原纖維之間間隙大小是否能夠滿足ZnO纖維的生長。

3　結　論

(1)在均布載荷的誘導作用下，制備出了定向有序膠原纖維。未施加均布載荷條件下生成的膠原纖維呈雜亂分布，說明均布載荷對定向膠原纖維的取向具有誘導作用。膠原蛋白溶液的濃度對膠原纖維的定向性存在影響，高濃度的膠原纖維排列更加致密，定向性較好。

(2)定向膠原纖維的拉伸強度要高出非定向膠原纖維的拉伸強度約56%，能夠承受較高的拉伸應力。

(3)膠原分子可以吸附，負載Zn2+的膠原纖維經煅燒處理后可得到ZnO纖維。低濃度的膠原蛋白可以提供較多的附著位點和足夠的纖維間間隙供ZnO生長，低濃度的Zn2+同樣可以保證足夠的生長空間。因此低濃度膠原蛋白/Zn2+溶液可生成保留了膠原纖維形貌的ZnO纖維，而高濃度膠原蛋白/Zn2+溶液則易生成多孔的ZnO結構。

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Induction effect of uniform load on the orientation of collagen fiber and ZnO fiber growth on collagen fiber template

LIU Haoran, YU Mei, LIU Jianhua, LI Songmei

(School of Material Science and Engineering, Beihang University, Beijing 100191，China)

Unidirectionally oriented collagen fiber was produced using type Ⅰ collagen through applying uniform load on the collagen solution. ZnO fiber was fabricated by calcining collagen fiber loaded with Zn2+. Collagen fiber and ZnO fiber were characterized by scanning electron microscopy (SEM), X-ray diffraction (XRD) and texture analyzer. The effects of uniform load and concentrations of collagen on the orientation of collagen fiber, the effects of concentrations of collagen and Zn2+on the morphology of ZnO were investigated. It was concluded that the uniform load applied on the collagen solution had an induction effect on the orientation of collagen fiber. Tensile test revealed that the tensile strength of oriented collagen fiber was 56% higher than that of non-oriented collagen fiber. The ZnO fiber fabricated through low concentration collagen/Zn2+solution retained the morphology and structure of collagen fiber.

collagen fiber; orientation; induction effect; ZnO fiber; template method

1001-9731(2016)08-08211-06

國家自然科學基金資助項目(21371019)

2015-09-21

2015-12-08 通訊作者：于美，E-mail: yumei@buaa.edu.cn

柳浩然(1991-)，男，石家莊人，在讀碩士，師承于美副教授，從事仿生材料及新能源材料研究。

Q816；TQ139.2

A

10.3969/j.issn.1001-9731.2016.08.038