蓮子多酚氧化酶的分離與純化

賀玉珊,劉小如,鄧澤元,黃伊寧,楊小院,胡蔣寧

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,南昌大學食品學院,江西南昌 330047)

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蓮子多酚氧化酶的分離與純化

賀玉珊,劉小如*,鄧澤元,黃伊寧,楊小院,胡蔣寧

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,南昌大學食品學院,江西南昌 330047)

由多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)導致的酶促褐變嚴重影響蓮子的外觀。本研究旨在探討蓮子PPO的提取純化方法,為研究其蛋白結構、進一步探究蓮子褐變機理提供理論依據。以酶活力和酶比活力為指標,對比了提取PPO的四種方法,發現勻漿吸附后丙酮沉淀法提取蓮子PPO可獲得較高的酶比活力,達289.04 U/mg;采用單因素實驗對該提取方法進行優化,得最佳提取參數為:料液比1∶5、提取時間2 h、pH=7、含2% PVPP和0.8% TritonX-100提取溶液,優化后PPO粗酶液酶比活力為294.40 U/mg;采用DEAE Sepharose Fast FLow陰離子交換層析、Sephadex G-75凝膠柱層析對粗酶液進行純化,得到分子量大約為58 ku蓮子PPO,酶比活力為7926.68 U/mg,純化倍數為26.92,回收率為38.48%。

蓮子,多酚氧化酶,分離純化

蓮子,睡蓮科蓮屬(NelumbonucifereGaertn)植物的成熟種子經剝殼去芯后的果實,已列入衛生部藥食兩用物品名單[1]。新鮮蓮子,口感清甜,最大限度的保存了蓮子的營養成分,具有較高的營養和經濟價值。然而,新鮮蓮子采收和儲運過程中較易褐變,外觀與風味隨之劣變,嚴重影響了蓮子的營養及經濟價值,并制約蓮產品的多元性開發。多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)是導致植物褐變的關鍵酶。有氧條件下,PPO與植物內源性酚類物質形成鄰醌,鄰醌通過自氧化途徑形成聚合色素分子,產生褐變[2]。張有林等[3]研究表明多酚氧化酶為蓮藕褐變的主要因素,而在富集PPO和酚類物質較多的蓮子尖端褐變尤其明顯[4]。因此提取純化獲得蓮子PPO是探究蓮子褐變機理的基礎。目前,關于各種植物PPO分離純化的研究不少,如采用勻漿或者丙酮提取,陰離子柱和凝膠柱進行純化,得到的純化倍數為17～259,相對分子質量為39～112 ku的PPO[5-7],但關于蓮子PPO的分離純化仍未有報道。本文研究對比了幾種常見的PPO提取方法,確定了蓮子PPO的最適提取方法并優化了提取工藝,繼而對粗提酶液進行純化,得到高純度的蓮子PPO,為研究其蛋白結構、探究蓮子褐變機理提供實驗基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

鮮蓮子江西廣昌-80 ℃凍藏;交聯聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、TritonX-100、丙酮、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、醋酸、醋酸鈉、鄰苯二酚、考馬斯亮藍G-250、牛血清蛋白、乙醇、磷酸等,均為分析純。

超聲細胞粉碎儀無錫市上佳生物科技有限公司;722G型可見分光光度計上海精科儀器有限公司;Neofuge 15R型臺式高速冷凍離心機力康發展有限公司;穩壓穩流電泳儀、電泳槽Bio-Rad公司;恒流泵保定蘭格儀器有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1提取PPO的四種方法對比

1.2.1.1提取PPO的四種方法勻漿浸提法:取蓮子尖端5.0 g,加入pH=7的 20 mmol/L預冷過含2% PVPP(m/v)的PBS緩沖溶液中,料液比為1∶4,冰浴研磨勻漿,4 ℃下浸提1.5 h,四層紗布過濾。于4 ℃、8500 r/min離心20 min,取上清液為粗酶液;勻漿后丙酮沉淀法:如勻漿浸提法中,冰浴研磨成勻漿4 ℃下浸提1.5 h后,置于4 ℃下 8500 r/min離心20 min。取上清液,加入2.5倍體積的冷凍丙酮(-20 ℃),同條件再次離心。取沉淀溶于4 ℃預冷的pH=7 Tris-HCl(含2%的PVPP)緩沖溶液,攪拌30 min,靜置,重復數次。上清液即為粗酶液;丙酮沉淀后吸附法:如勻漿浸提法中冰浴研磨成勻漿,4 ℃下8500 r/min 離心20 min,取上清液加入2.5倍體積的冷凍丙酮(-20 ℃),4 ℃下 8500 r/min離心20 min,將沉淀物在4 ℃溶于pH=7的Tris-HCl緩沖溶液(含2%的PVPP),攪拌30 min,靜置,反復數次。在4 ℃下 8000 r/min離心10 min,上清液為粗酶液;超聲吸附法:如勻漿浸提法中,冰浴研磨成勻漿,在冰浴下超聲(功率300 W,超聲3 s,間隔15 s,超聲10次)。四層紗布過濾,4 ℃ 8500 r/min離心20 min,取上清液為粗酶液。

1.2.1.2殘存活力對比將四種不同方法提取的粗酶液置于溫度為32 ℃,分別于2、4、6、8、9、10 d后檢測酶活力。

1.2.1.3酶活力測定取1 mL pH=6.5的磷酸緩沖溶液和0.4 mL 0.2 mol/L鄰苯二酚配成反應底物體系,加入0.1 mL的酶液后立即測定OD420值的變化,每10 s記錄吸光度數值,以吸光度對時間曲線最初直線段的斜率表示為PPO活力,一個酶活力單位定義為在測定條件下,每分鐘引起吸光度改變0.001所需的酶量。PPO的活力計算公式如下:

式中:ΔA420為420 nm處吸光度變化值;V為酶液的體積(mL);t為酶促反應時間(min)。

1.2.1.4酶比活力測定酶比活力是酶純度的量度,即:單位重量的蛋白質中所具有酶的活力單位數,一般用U/mg表示,活力比越大,PPO的純度越高。計算公式如下:

式中:酶活力單位為U/mL;蛋白質含量為mg/mL。

1.2.1.5蛋白質含量測定采用Bradford考馬斯亮藍法測定蛋白質含量,以牛血清蛋白制作蛋白標準曲線,標準曲線方程為y=0.0035X+0.005,R2=0.9993(式中:y為吸光度,X為蛋白質含量μg),根據方程計算出蛋白質含量。

1.2.2勻漿后丙酮提取法條件優化

1.2.2.1料液比固定提取溶液組分pH=7 PBS(含2% PVPP)、浸提1.5 h,于同等條件研究不同料液比(w/v):1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7對蓮子PPO粗提液酶活力及酶活力比的影響。

1.2.2.2提取液pH固定提取溶液組分2% PVPP、料液比為1∶4、浸提1.5 h,于同等條件下研究不同pH(4.5、5.0、5.5乙酸-乙酸鈉緩沖溶液;6.0、6.5、7.0、7.5磷酸鹽緩沖溶液)對蓮子PPO粗提液酶活力及酶活力比的影響。

1.2.2.3浸提時間固定提取溶液組分pH=7 PBS(含2% PVPP)、料液比為1∶4,于同等條件研究不同浸提時間(0、1、2、3、4、5、6 h)對蓮子PPO粗提液酶活力及酶活力比的影響。

1.2.2.4提取液的不同組成成分固定料液比為1∶4,pH=7,浸提1.5 h,于同等條件下研究不同組分的提取液(設置如表1)對蓮子PPO粗提取液酶活力及酶活力比的影響。

1.2.3蓮子多酚氧化酶的純化

1.2.3.1DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析粗酶液經10 ku超濾管去除丙酮并濃縮,取3 mL濃縮液加于20 mmol/L Tris-HCl(pH=7)平衡的DEAE Sepharose Fast Flow 陰離子交換層析柱(1.0×20 cm),依次用含0.1、0.2、0.3 mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液(pH=7)各120 mL分階段洗脫。洗脫速度為0.8 mL/min,每管8 mL,280 nm處監測波長。檢測各管PPO活性,收集PPO活性峰,用10 ku超濾管濃縮備用。

1.2.3.2Sephadex G-75凝膠柱層析取經1.2.3.1步驟純化的酶3.5 mL,加于經20 mmol/L Tris-HCl(pH=7)緩沖液平衡的Sephadex G-75凝膠柱(1.6×60 cm),以20 mmol/L Tris-HCl(pH=7)緩沖液進行洗脫,流速為0.5 mL/min,每管5 mL,280 nm處檢測波長。檢測各管PPO活性,收集酶活力高的溶液經10 ku超濾管濃縮后,置于-80 ℃備用。

1.2.3.3SDS-PGAE電泳采用4%濃縮膠和10%分離膠,上樣量均為20 μL,電壓分別為80 V和120 V,電泳完畢,經染色,脫色至電泳帶清晰,背景干凈后,用凝膠成像系統成像并采集數據。

1.2.3.4Native-PAGE電泳參照劉芳[8]方法略加改進,采用4%濃縮膠和10%分離膠(電壓分別為80 V和120 V),樣品緩沖液(1.5 mL pH=6.8 1 mol/L Tris-HCl,3 mL甘油,0.4 mL 0.5%溴酚藍,用蒸餾水定容至10 mL)與酶提取液15 μL等體積混合。Native-PAGE染色:參照Conde-Petit[9]的方法,以0.06%鄰苯二胺(0.01 mol/L草酸溶解)、1.0%鄰苯二酚(20 mmol/L pH=6.5 PBS溶解)、20 mmol/L pH=6.5 PBS三種溶液按體積1∶2∶1混合制成染色液。電泳完畢后染色至酶帶顯現,取出漂洗后,成像并采集數據。

2　結果與分析

2.1提取PPO的四種方法對比

由圖1可知,四種提取方法所得PPO粗提液均有較高的酶活力,表明四種方法均可用于提取蓮子PPO。勻漿浸提有利于PPO的溶出,所得粗酶液酶活較高,但雜蛋白較多,酶比活力相對較低。丙酮的加入可助于分離沉淀蛋白質,減少雜質,提高酶的純度,因而丙酮沉淀后吸附法所得粗酶液酶比活力較高,但丙酮會使部分酶蛋白變性沉淀或失活,酶活力較低。超聲吸附法所得PPO粗提液酶活力最高(2934 U/mL),但其酶比活力相對較低。因超聲輔助可加速蓮子組織細胞破碎,有助于細胞內PPO溶出,表現為較高的酶活力,但超聲也促使雜蛋白的溶出,導致酶純度不高,即酶比活力并非最高。勻漿后丙酮沉淀法結合了勻漿浸提法和丙酮沉淀后吸附法的優點,先使用勻漿浸提增加PPO的溶出,浸提后加入丙酮沉淀,避免了丙酮先期加入所導致的酶蛋白變性失活。該方法所得PPO粗提液酶比活力最大,達289.04 U/mg,明顯優于其他三種方法。

圖1　四種提取PPO的方法對酶活力和酶比活力的影響Fig.1　Effect of four extracting methods on the PPO activity and specific activity

對比設置溫度為32 ℃下,放置2、4、6、8、9、10 d后,四種方法所得粗酶液的酶活力下降情況,結果見圖2。超聲吸附法所得粗酶液因超聲空化作用所產生的沖擊波和熱效應可能改變酶的構象,使酶蛋白穩定性較差,因而PPO活力下降較為明顯,10 d后,酶活力僅為初提時的4.3%。勻漿浸提法所得粗酶液PPO活力亦有顯著的下降。丙酮的加入可助于分離沉淀蛋白質,可提高酶純度,有利于酶的保存。因而,丙酮沉淀吸附法和勻漿后丙酮吸附法所得粗酶液PPO活力下降較為緩慢,室溫靜置10 d后依然有較強的PPO活力。綜合比較上述四種方法的優劣,本文采用勻漿后丙酮沉淀法作為蓮子PPO的提取方法[10]。

圖2　四種提取PPO的方法酶活力變化Fig.2　Comparison between the four methods of extraction PPO by PPO activity

2.2勻漿后丙酮提取法優化分析

影響勻漿后丙酮沉淀法提取蓮子PPO的因素較多,但尤以料液比、提取液pH、浸提時間、提取液成分影響顯著。選擇上述4種因素,以蓮子PPO酶比活力和酶活力為指標,分析各單因素對勻漿后丙酮沉淀法提取蓮子PPO效率及純度的影響,優化提取工藝參數。

2.2.1料液比由圖3可知,在料液比為1∶5時,酶粗提液的酶活力和酶比活力達到峰值,因提取溶液過少,溶解PPO的量有限,無法高效地提取PPO。但過量的提取溶液反而會降低蓮子PPO濃度,不利于PPO的提取[11]。

圖3　料液比對蓮子酶活力和酶比活力的影響Fig.3　Effect of the ratio of solid-to-solvent on the PPO activity and specific activity

2.2.2提取溶液pH由圖4可知,隨著提取液pH的增加,勻漿后丙酮沉淀所得酶粗提液的酶活力和酶比活力均有顯著的增加,在pH=7.0時達到峰值。這是由于PPO為酸性蛋白[12],較低的pH條件下PPO易集聚沉淀,影響提取效果,而中性提取溶液則有助于蓮子中酶和蛋白的溶出。弱堿性條件下(pH=7.5),所得酶粗提液的酶活力和酶比活力有較大幅度的降低,是PPO為含銅金屬酶[12]。堿性的條件下,活性中心的Cu2+發生解離氧化甚至轉化成Cu(OH)2沉淀,使得酶活力大大降低[12]。

圖4　提取液pH對蓮子酶活力和酶比活力的影響Fig.4　Effect of the buffer pH on the PPO activity and specific activity of lotus seed extracts

2.2.3提取時間由圖5可知,隨著提取時間的增加,粗提液的酶活力和酶比活力均有顯著的增加,提取2 h時,提取效率最高。繼續延長提取時間,粗提液的酶活力和酶比活力有一定幅度降低。表明適度延長提取時間,有助于PPO的提取,而時間過長,多酚物質并不是能全部被PVPP吸附,所以,未被PVPP吸附的多酚物質,一定時間后會與PPO反應,使得酶活力與酶比活力下降[13-14]。

圖5　提取時間對蓮子酶活力和酶比活力的影響Fig.5　Effect of extraction time on the PPO activity and specific activity of lotus seed extracts

2.2.4不同提取液組分TritonX-100、PEG為表面活性劑,有助于細胞內物質的溶出。PVPP是多酚吸附劑,不溶于水,可通過離心去除,不構成影響。從表1中可以看出,提取溶液中加入1%的PEG,對提取效率影響不大。分別加入2%的PVPP、0.8%的TritonX-100均可有效提高提取率,由于兩種成分的協同作用含0.8% TritonX-100及2% PVPP的提取溶液所提酶液酶比活力最高,達到257.01 U/mg。為減少提取液組分構成,便于操作,本文選擇0.8% TritonX-100及2% PVPP溶液為最優緩沖液組合。

表1　不同緩沖液對酶活力和酶比活力的影響Table 1　Effect of buffer solution type on the PPO activity and PPO specific activity of lotus seed extracts

2.3蓮子PPO的純化

2.3.1DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換層析及Sephadex G-75凝膠柱層析優化提取后的PPO粗提液經DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析純化,結果見圖6,收集酶活性最高的25～27號管,合并脫鹽濃縮后經Sephadex G-75凝膠柱層析純化,結果見圖7,取酶活最高的29號管,收集濃縮后置于-80 ℃冰箱保存備用。

圖6　DEAE Sepharose Fast Flow層析的不同NaCl洗脫曲線Fig.6　Chromatographic elution profile of lotus seed PPO with gradients of NaCl

圖7　蓮子PPO的Sephadex G-75凝膠過濾層析圖 Fig.7　Sephadex G-75 gel filtration chromatography of lotus seed PPO

2.3.2SDS-PAGE及Native-PAGE電泳SDS-PAGE譜圖顯示為單一蛋白條帶,表明純化后的PPO達到電泳純,根據譜圖測定蓮子PPO分子量大約為58 ku。文獻報導絲瓜PPO為67.8 ku[15],金銀花PPO為43 ku[16],蘋果PPO為67 ku[17],蓮藕PPO為66 ku[18],PPO分子量不同是由植物間種屬差異決定,提取純化方法差異亦會對蛋白有一定影響,比如造成酶蛋白的分解等。經Native-PAGE譜圖(圖8)驗證,蓮子PPO分子量為58 ku,與SDS-PAGE譜圖所測結果一致。

2.3.3蓮子PPO的分離純化結果如表2,經DEAE Sepharose Fast Flow層析純化后,純化倍數為14.78,回收率為64.66%,得到一定純化,但純化結果并不特別理想,但經Sephadex G-75純化后,純化后的PPO總酶比活力為7926.68 U/mg,是粗酶液的26.92倍,表明PPO得到有效純化,且回收率為38.48%,表明酶得到較好的富集。

表2　蓮子PPO提取過程酶比活力及純化倍數的變化Table 2　Purification of PPO from lotus seed

圖8　蓮子PPO的SDS-PAGE圖Fig.8　SDS-PAGE of PPO from lotus seed注:1.勻漿吸附丙酮沉淀法提取的PPO; 2.經DEAE-Sepharose Fast Flow純化后的PPO; 3.經SephadeX G-75純化后的PPO，圖9同。

圖9　蓮子PPO的Native-PAGE圖Fig.9　Native-PAGE of PPO from lotus seed

3　結論

本研究以酶活力及酶比活力為指標,對比了目前常用的四種多酚氧化酶提取方法,發現勻漿吸附后丙酮沉淀法較適合蓮子PPO提取,其優化后的提取工藝參數為:料液比1∶5、提取時間2 h、pH=7(含2% PVPP和0.8%的TritonX-100)條件下所提粗酶液酶比活力最高,為294.40 U/mg。再經DEAE Sepharose Fast FLow陰離子交換層析及Sephadex G-75凝膠柱層析純化后,酶比活力達7926.68 U/mg,提純倍數為26.92,回收率為38.48%,分子量約為58 ku。

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Purification and isolation of polyphenol oxidase from lotus seed

HE Yu-shan,LIU Xiao-ru*,DENG Ze-yuan,HUAN Yi-ning,YANG Xiao-yuan,HU Jiang-ning

(State Key Laboratory of Food Science and Technology,College of Food Sciences,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

The enzyme browning induced by polyphenol oxidase(PPO)affects nutrition,flavor and economic value of lotus seed. Insight into the mechanism of the enzyme browning is based on the structure and characteristic of PPO.Therefore,to obtain a fairly pure PPO is the purpose of this study.The comparation between four methods of extracting lotus seed PPO was made,homogenization post-acetone extraction method was better in PPO specific activity and maintaining the total activity.The results of optimizing homogenization post-acetone extraction were as follows:the ratio of solid-to-solvent 1∶5,extract time 2 h,phosphate buffer containing 0.8% TritonX-100 and 2% PVPP at pH7,and the specific activity was 294.40 U/mg. The rude extraction was purified by DEAE Sepharose Fast Flow ion exchange column chromatography and Sephadex G-75 gel filtration chromatography.The specific activity of purified PPO was 7926.68 U/mg,a purification factor of 26.92,yield was 38.48%.The molecular weight of this enzyme was about 58 ku.

lotus seed;polyphenol oxidase;isolation and purification

2015-10-16

賀玉珊(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：蓮子天然物質研究，E-mail:H231991@163.com。

劉小如(1986-)，女，博士，助理研究員，研究方向：天然產物的開發研究，E-mail:xiaoruliu@outlook.com。

國家自然科學基金(31301578)；江西省自然科學基金(20132BAB214002)；江西省教育廳青年科學基金(GJJ13024)；江西省自然青年科學基金(20142BAB214003)。

TS255.1

A

1002-0306(2016)09-0064-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.004