超聲波處理對綠豆蛋白結構及功能特性的影響

楊　勇,畢　爽,王中江,李　楊,*,江連洲,*

(1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院,農產品加工黑龍江省普通高校重點實驗室,黑龍江齊齊哈爾 161006;2.東北農業大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030)

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超聲波處理對綠豆蛋白結構及功能特性的影響

楊勇1,2,畢爽2,王中江2,李楊2,*,江連洲2,*

(1.齊齊哈爾大學食品與生物工程學院,農產品加工黑龍江省普通高校重點實驗室,黑龍江齊齊哈爾 161006;2.東北農業大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030)

本實驗研究了超聲波作用對綠豆蛋白結構及功能性質的影響,結果表明:超聲波處理后綠豆蛋白β-折疊結構含量降低,而β-轉角結構含量顯著增加,α-螺旋和無規卷曲的結構組成有小幅增加。隨著超聲功率的增強及處理時間的增長,綠豆蛋白β-折疊結構含量進一步降低,而β-轉角結構含量逐漸增加。超聲波處理下綠豆蛋白溶解性并未發生顯著變化,但有效地增強了綠豆蛋白的表面疏水性、乳化性能、起泡性及泡沫穩定性。低強度超聲功率下(200 W),四者均隨時間的延長而增大,高強度超聲功率下(400 W),綠豆蛋白的四種功能性質則隨時間的增長而逐漸降低。

超聲波處理,綠豆蛋白,結構,功能特性

綠豆是豆科植物的綠色種子,主要產于中國、日本等地區。在我國綠豆的栽培歷史可追溯到兩千多年前,綠豆產量和出口量也居于世界前列。綠豆中還有還含有許多活性成分,具有降血糖、降血脂等功能,降低人體中甘油三酯濃度,阻止動脈硬化的發生[1-2]。

綠豆營養豐富而均衡,不僅含有碳水化合物和磷、鎂、鈣等微量元素,還具有豐富的蛋白質含量。綠豆中的蛋白質含量高于25%[3],甚至高于一般肉類中的蛋白質含量。其氨基酸組成類似于其他糧食作物,但谷氨酸、賴氨酸含量遠高于其他糧食作物[4]。近年來,隨著人們對功能性食品的不斷認識與青睞,以營養豐富、安全保健為特征的優質綠豆蛋白材料必將具有廣闊的開發市場。加強對綠豆及其副產品的開發與利用,推動綠豆的產業發展,具有廣闊的市場前景。

有研究表明,綠豆分離蛋白具有較好的起泡性和泡沫穩定性,可形成穩定凝膠[5]。但也有研究指出綠豆蛋白的功能性受提取方式的影響[6]。綠豆分離蛋白的制備主要采用堿溶酸沉法,利用綠豆蛋白在堿性條件下具有良好的溶解性,在酸性接近等電點條件下沉降的原理制備。但該方法制備的蛋白具有一定的弊端,在制備過程中,強酸、強堿導致綠豆蛋白的構象發生變化,形成聚集,造成了綠豆蛋白功能較差,進而限制了其在食品加工中的應用。因此,在加工中通常采用超聲波改性技術對綠豆蛋白改性處理[7]。

超聲波是一種彈性機械波,低頻高強度超聲波可用于改變食品的物理或化學屬性。朱建華等[8]指出超聲波處理可提高大豆分離蛋白的溶解性,起泡性和乳化性等功能性質。王小英[9]等研究發現超聲處理可增加大豆蛋白的溶解性。盡管如此,超聲波處理在綠豆蛋白方面的研究仍較少,不同超聲波條件對綠豆分離蛋白的影響規律尚未探明。本文選用不同超聲功率(200、400 W)與超聲時間(15、30 min),對綠豆蛋白進行超聲處理,通過紅外光譜、溶解度、表面疏水性、乳化性及起泡性等方法對綠豆蛋白結構及功能等性質變化進行分析,為綠豆的精深加工提供理論基礎和實踐指導。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

綠豆分離蛋白,自制;其它化學試劑均為國產分析純。

MAGNA-IR560傅里葉變換紅外光譜系統美國PE公司;CR22G高速冷凍離心機日本日立公司;pHS-3D pH計上海雷磁公司;超聲波細胞破碎儀(JY99-IIDN)寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1綠豆分離蛋白的提取首先將原料綠豆除雜、去皮、破碎后過60目篩,得到綠豆粉。將綠豆粉以1∶4(w/v)的比例加入正己烷,40 ℃條件下連續攪拌1.5 h后10000×g離心20 min,所得沉淀室溫下干燥12 h,得到脫脂綠豆粉。

將脫脂綠豆粉按1∶10(w/v)的質量比與去離子水混合,用2 mol/L的NaOH調pH至9.0,室溫下攪拌2 h后,將懸浮液在4 ℃條件下10000×g離心15 min。取上清液用2 mol/L的HCl調pH至4.5。靜置后在4 ℃條件下6000×g離心20 min取蛋白溶液水洗2次。沉淀用2 mol/L的NaOH調pH至7.0后冷凍干燥[10]。干燥后即為綠豆分離蛋白,置于-24 ℃保存。所得綠豆分離蛋白的蛋白質含量達90.21%±0.63%。

1.2.2綠豆分離蛋白的超聲波處理將綠豆分離蛋白與蒸餾水以1∶50的比例溶解于燒杯中并置于超聲波細胞破碎儀中,水浴控制樣品溶液的溫度為20 ℃,在20 kHz下輸出功率為(200,400 W)下處理15、30 min,超聲時間3 s,間隔時間3 s。

1.2.3紅外光譜分析稱取綠豆分離蛋白樣品2 mg,加入一定量的溴化鉀至200 mg,用研缽研磨混勻,壓片后再用紅外光譜儀做全波段掃描(400～4000 cm-1),掃描次數64次[11]。

1.2.4溶解度的測定在100 mL燒杯中倒入30 mL去離子水,取0.5 g綠豆分離蛋白,在500 r/min下攪拌1 h,10000×g離心20 min后取上清液,采用微量凱氏定氮法測定上清液中蛋白質含量。溶解度表示為上清液中蛋白質含量占總蛋白質量濃度的百分比計算濃度[12]。

1.2.5綠豆分離蛋白表面疏水性測定綠豆分離蛋白的表面疏水性采用ANS熒光探針法測定,參考Kato和Nakai[13]的方法。具體過程為:將不同超聲波處理的綠豆分離蛋白溶解于0.1 mol/L、pH為7.0的磷酸鹽緩沖液中。在室溫條件下攪拌1 h后以10000×g離心20 min,取上清液測定蛋白濃度,并用緩沖液將不同樣品分別稀釋保證濃度在0.05～0.40 mg/mL之間,然后取稀釋樣品4 mL,加入20 μL ANS溶液(8 μmol/L),熒光操作參數為:激發波長390 nm、發射波長468 nm、掃描速度10 nm/s、狹縫5 nm為參數,測定其熒光值。

1.2.6綠豆分離蛋白乳化性(EAI)和乳化穩定性(ESI)的測定參考Molin[14]等人的方法,采用磷酸鈉緩沖液配制質量分數為0.5%(w/v)的綠豆分離蛋白溶液20 mL,加入8 mL葵花籽油進行兩步均質(13500×g,60 s),形成均一的乳化液。均質后,將乳化液分別倒入小燒杯中,用微量注射器立即從底部吸取乳化液50 μL a(0 min)與b(10 min),用0.1%(w/v)SDS稀釋100倍。在500 nm下進行吸光值測定。ESI和EAI采用如下公式進行計算:

其中:T=2.303,A0為均質后乳化液在500 nm處測定的吸光值,N:稀釋倍數100,C:蛋白質水溶液中蛋白質濃度(g/mL),U:乳化液中的油相體積分數(0.25);A0和A10分別是乳化液在0 min和10 min的吸光值,t為時間(本實驗中為10 min)。

1.2.7綠豆分離蛋白起泡性和泡沫穩定性的測定參照Alicia等[15]方法并稍作修改。取10 mL(V1,mL)1%綠豆分離蛋白溶液(用0.1 mol/L pH6.8的Tris-HCl緩沖液配制),持續快速攪拌30 s,迅速測定泡沫的體積(V2,mL),靜置30 min后再次測量泡沫的體積(V3,mL)。按下述公式分別計算蛋白樣品的起泡性和泡沫穩定性:

1.2.8數據處理結果為三次測定的平均值,計算標準偏差。利用新復極差檢驗(Duncan’s multiple-range test)評價樣品平均值間的顯著性差異(p<0.05)。

表1　綠豆分離蛋白二級結構含量變化Table 1　Secondary structural content of mung bean isolate

注：不同字母表示差異顯著(p<0.05)，圖3～圖7同。

2　結果與分析

2.1紅外光譜分析結果

圖1為不同超聲波處理條件下綠豆分離蛋白的紅外光譜。蛋白質是具有特定結構的生物大分子,它由氨基酸組成并通過肽鍵連接而成[16]。蛋白質的二級結構主要有α-螺旋、β-折疊、β-轉角及無規卷曲,其中氫鍵是穩定二級結構的主要作用力。

圖1　不同超聲波處理條件下的FT-IR光譜Fig.1　FT-IR spectra of mung bean protein dispersion of different ultrasonic treatment

本論文主要采用Peakfit軟件對蛋白質酰胺I帶進行解析,首先對所得紅外光譜的酰胺I帶進行傅里葉去卷積光譜擬合分析[17],使半峰寬(FWHM)為5 cm-1,增強因子(Enhancement factor)為1.0。各峰位的歸屬指認依據:1615～1637、1682～1700 cm-1為β-折疊結構;1646～1664 cm-1為α-螺旋結構;1637～1645 cm-1為無規則卷曲結構;1664～1681 cm-1為β-轉角結構[18]。

如表1可知,綠豆分離蛋白的主要組成為β-折疊結構。經過超聲波處理后綠豆分離蛋白的β-折疊結構含量有所降低,而β-轉角結構含量顯著增加,而α-螺旋和無規卷曲結構組成亦有小幅增加。二級結構組成的有序單元(α-螺旋結構和β-折疊結構)總量的降低表明超聲波處理破壞了蛋白質內部結構,無規卷曲結構含量的增大表明超聲波處理增加了綠豆分離蛋白無序結構的形成(即蛋白質聚集體)。同作為β-結構,β-折疊結構易優先轉變為β-轉角結構,因而超聲波處理下β-轉角結構含量增加明顯,亦證明超聲波處理使蛋白質結構更加松散[19]。另有研究指出,蛋白質發生聚集會導致β-折疊結構含量減少[20]。

進一步比較可知,無論在低超聲功率(200 W)或高超聲功率(400 W)下,隨著超聲波處理時間的增長,綠豆分離蛋白的β-折疊結構含量均有所降低,而β-轉角結構含量逐漸增加,表明更多的β-折疊結構轉變為β-轉角結構是超聲波處理下綠豆分離蛋白的典型變化。而在高超聲功率下(400 W),隨著處理時間的增長,綠豆分離蛋白α-螺旋結構含量的降低及無規則卷曲結構的增加考慮可能與過于嚴重的蛋白質聚集現象有關。

2.2超聲波處理對綠豆分離蛋白溶解性的影響

蛋白質的溶解度可以用來度量蛋白質變性和聚集的程度,也可作為評價蛋白質功能性質的主要指標。蛋白質在植物蛋白飲料中的應用也與其溶解性有直接的關系。

超聲波處理對綠豆分離蛋白溶解性的影響見圖2。由圖2可知,綠豆分離蛋白溶解度為69.32%±1.02%,而超聲波處理下綠豆分離蛋白溶解性的并未發生顯著變化,總體分布于70%左右。綠豆蛋白在超聲波處理下溶解性的變化與其他植物蛋白并不相同。王小英等研究表明超聲波處理可以增強大豆蛋白的溶解性,并指出超聲波促使大豆蛋白聚集,從而增大了其平均相對分子質量[21];邵悅等指出超聲波處理增強了花生蛋白的溶解性,其認為超聲波作用超聲波的微泡和湍流打破蛋白顆粒,使其粒徑變小,表面積增大,次級鍵打開不能夠再維持綠豆分離蛋白原有的有序結構,從而提高了溶解性[22]。但對比于綠豆分離蛋白,溶解性顯示出并未增大的變化特點,可能的原因在于超聲波處理不僅誘導了蛋白質內部結構的松散解離,同時亦造成了綠豆分離蛋白的聚集現象的發生,與紅外光譜結果一致。

圖2　超聲波處理對綠豆分離蛋白溶解性的影響Fig.2　Water solubility(total soluble fraction)(%) for untreated(0)and ultrasonication treated mung isolate protein

2.3超聲波處理對綠豆分離蛋白表面疏水性的影響

表面疏水性是衡量蛋白分子表面疏水基團數目的指標。蛋白質經卷曲形成特有的空間結構,分子內部形成的疏水內核由非極性氨基酸側鏈分布所導致的,親水的外側分布有極性氨基酸。如果一些疏水基團出現在蛋白質表面,就會使蛋白質表面也具有一定的疏水性,在維持蛋白質的三級結構的穩定和四級結構的形成中占有突出的地位。分布在蛋白表面的氨基酸殘基決定了蛋白質的構象、穩定性和功能性,對蛋白質的生理功能起著非常重要的作用[23]。

由圖3可知,超聲波處理增強了綠豆分離蛋白的表面疏水性。200 W條件下,隨著超聲波時間的延長,綠豆分離蛋白的表面疏水性逐漸增大,這可能與超聲波的空化作用使蛋白質分子的結構變得疏松,埋藏在蛋白質球狀分子內部的側鏈解離,分子內部的非極性基團暴露于分子表面有關[21];而相比于低超聲功率(200 W),高超聲功率下(400 W)綠豆分離蛋白的表面疏水性有所降低,并隨時間的增長而逐漸降低,這種現象的發生與超聲波處理下蛋白質的聚集體形成有關。

圖3　超聲波處理對綠豆分離蛋白表面疏水性的影響Fig.3　Surface hydrophobicity of untreated and ultrasonication-treated mung isolate protein

2.4超聲波處理對綠豆分離蛋白乳化性及乳化穩定性的影響

由圖4可知,超聲波處理會顯著增強綠豆分離蛋白的乳化性。綠豆分離蛋白乳化性的變化趨勢相似于表面疏水性的變化趨勢。蛋白質作為乳化劑吸附至界面取決于疏水基團的暴露,表面疏水性的增強會提升蛋白質的乳化性[24]。當超聲功率增加到400 W后,綠豆分離蛋白乳化性降低,可能是由于高能量的機械振蕩改變了原來分散的蛋白空間結構,綠豆分離蛋白變性程度增大,重新形成較大分子聚集體,蛋白表面積縮小,綠豆分離蛋白的乳化性進而降低[25]。

圖4　超聲波處理對綠豆分離蛋白乳化性的影響Fig.4　Emulsion activity index(EAI)for untreated and ultrasonication-treated mung isolate protein

由圖5可知,超聲波處理有效地改善了綠豆分離蛋白的乳化穩定性,無論是超聲功率的增大還是超聲時間的增長,均對蛋白乳化穩定性有增強效應,表明超聲波處理是改良綠豆分離蛋白乳化性能的有效手段。

圖5　超聲波處理對綠豆分離蛋白乳化穩定性的影響Fig.5　Emulsion stability index(ESI)for untreated and ultrasonication-treated mung isolate protein

2.5超聲波處理對綠豆分離蛋白起泡性及泡沫穩定性的影響

當蛋白質在高速剪切作用下處理時,會有大量的氣體進入溶液,形成一定的水-空氣界面。溶液中的綠豆分離蛋白分子吸附在這些界面上,以達到降低界面張力的效果,促進界面形成而形成泡沫。起泡性的改變與蛋白結構解聚和物化性質的變化有關[26]。

由圖6可知,經超聲波處理后,綠豆分離蛋白的起泡性得以增強,在低超聲功率下綠豆分離蛋白的起泡性隨著超聲時間的延長呈增大趨勢,而在高超聲功率下這種增強趨勢并不顯著。超聲波作用有助于將綠豆分離蛋白解聚成小分子亞基,增加了氣水界面的蛋白分子數目,從而不同程度的提高了起泡能力[27]。但在高超聲功率條件下,綠豆分子結構進一步打開,更多的隱藏在分子內部的疏水基團和巰基暴露到分子表面,極化的蛋白分子重新形成更大的分子聚集體,分子之間通過非共價鍵連接,表現為界面膜的穩定性下降,起泡能力下降。

圖6　超聲波處理對綠豆分離蛋白起泡性的影響Fig.6　Foam capacity of samples for untreated and ultrasonication-treated mung isolate protein

結合圖7可知,超聲波處理在低超聲功率下有益于改善綠豆分離蛋白的泡沫穩定性,但在高超聲功率下隨著超聲時間的增長,泡沫穩定性有所降低,這主要是由于可溶性蛋白濃度降低,產生了不溶性聚集體,因此泡沫穩定性下降,更加容易破裂[28]。

圖7　超聲波處理對綠豆分離蛋白泡沫穩定性的影響Fig.7　Foam stability of samples for untreated and ultrasonication-treated mung isolate protein

3　結論

超聲波處理可顯著改變綠豆蛋白的結構及功能性質。超聲波處理后綠豆蛋白β-折疊結構含量降低,而β-轉角結構含量顯著增加,α-螺旋和無規卷曲的結構組成有小幅增加。隨著超聲功率的增強及處理時間的增長,綠豆蛋白β-折疊結構含量進一步降低,而β-轉角結構含量逐漸增加。超聲波處理下綠豆分離蛋白的溶解性并未發生顯著變化,說明超聲波處理不僅誘導了蛋白質內部結構的松散解離,同時亦造成了綠豆分離蛋白的聚集現象的發生。但超聲后綠豆分離蛋白的表面疏水性等功能性質發生變化。在低超聲功率下(200 W),綠豆分離蛋白表面疏水性、泡沫穩定性、乳化性隨時間的延長而逐漸增大,但高功率下又有所降低，而對于乳化穩定性，無論是超聲功率的增大還是超聲時間的增長都對其有增強效應。綠豆分離蛋白的起泡性,在低超聲功率下隨著超聲時間的延長呈增大趨勢,而在高超聲功率下趨勢并不顯著。總之,超聲波處理在低超聲功率下有益于改善綠豆分離蛋白的功能性質,但在高超聲功率下效果不明顯。

[1]Yao Y,Chen F,Wang M F,et al.Antidiabetic activity of mung bean extracts in diabetic KK-Ay mice[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2008,56:8869-8873.

[2]徐興軍,邵淑麗,呂建偉.芹菜、綠豆、苦瓜對小白鼠高脂血癥的影響[J].高師理科學刊,2001,21(4):47-49.

[3]朱志華,李為喜,張曉芳,等.食用豆類種質資源粗蛋白及粗淀粉含量的評價[J].植物遺傳資源學報,2005,6(4):427-430.

[4]鄧志匯,王娟.綠豆皮與綠豆仁的營養成分分析及對比[J].現代食品科技,2010,26(6):656-659.

[5]劉冬兒,呂天喜.綠豆分離蛋白的制備及其功能特性的研究[J].糧食與食品工業,2007,14(2):27-30.

[6]成珊,沈群.不同品種和不同產地綠豆蛋白功能特性的研究[J].食品科技,2009,34(9):148-152.

[7]劉詠,楊柳.綠豆蛋白質提取工藝的優化[J].食品科學,2008,29(8):272-274.

[8]朱建華,楊曉泉.超聲波處理對大豆蛋白分子結構的影響[J].糧油加工,2010(7):39-42.

[9]王小英,李娜.超聲波處理對大豆蛋白溶解性及蛋白組分的影響[J].中國油脂,2009,34(4):31-34.

[10]O’donnell C P,Tiwari B K,Bourke P,et al.Effect of ultrasonic processing on food enzymes of industrial importance[J].Trends in Food Science & Technology,2010,21(7):358-367.

[11]王維堅,潘艷.化學計量法優化均質-超聲聯合提取綠豆蛋白的工藝參數[J].安徽農業科學,2013,41(18):7950-7953.

[12]Jiang J,Chen J,Xiong Y L.Structural and emulsifying properties of soy protein isolate subjected to acid and alkaline pH-shifting processes[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2009,57(16):7576-7583.

[13]Kato A,Nakai S.Hydrophobicity determined by a fluorescence probe method and its correlation with surface properties of proteins[J].Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Protein Structure,1980,624(1):13-20.

[14]Molina E,Papadopoulou A,Ledward D. Emulsifying properties of high pressure treated soy protein isolate and 7S and 11S globulins[J].Food Hydrocolloids,2001,15(3):263-269.

[15]Alicia C M,Hugo J I,Luc D,et al.Emulsifying and foaming capacity and emulsion and foam stability of sesame protein concentrates[J].Food Research International,2011,44:684-692.

[16]楊頻,高飛.生物無機化學原理[M].北京:科學出版社,2002:22-352.

[17]Iconomidou VA,Chryssikos D G,Gionis V M A,et al.Secondary structure of chorion proteins of the teleostean fish Dentex dentex by ATR FT-IR and FT-Raman Spectroscopy[J].Journal of Structural Biology,2000,132:112-122.

[18]Venyaminov S Y,Kalnin N N.Quantitative IR spectrophotometry of peptide compounds in water(H2O)solutions.II Amide absorption bands of polypeptides and fibrous proteins inα-,β-,and random coil conformations[J]. Biopolymers,1990,30:1259-1271.

[19]Barth A.Infrared spectroscopy of proteins[J].Biochimica et Biophysica Acta(BBA)-Bioenergetics,2007,1767(9):1073-1101.

[20]Stathopulos P B,Scholz G A,Hwang Y M,et al.Sonication of proteins causes formation of aggregates that resemble amyloid[J]. Protein Science,2004,13(11):3017-3027.

[21]王小英,李娜.超聲處理對大豆蛋白溶解性及蛋白組分的影響[J].中國油脂,2009(4):23-26.

[22]邵悅,張琪,張程,等.超聲波對花生蛋白功能特性的影響[J].食品工業科技,2012,(12):130-133.

[23]周筠梅,周軍賢.蛋白質表面疏水性的研究[J].食品工業科技,1996,12(4):559-564.

[24]Dalgleish D.G.Adsorption of protein and the stability of emulsions[J].Trends in Food Science & Technology,1997,8(1):1-6.

[25]楊會麗,馬海樂.超聲波對大豆分離蛋白物理改性的研究[J].中國釀造,2009(5):24-27.

[26]酈偉章.測定蛋白質起泡性的新方法-導電性[J].上海食品科技,1984(2):57-58.

[27]孫冰玉,石彥國.超聲波對醇法大豆濃縮蛋白乳化性的影響[J].中國糧油學報,2006,21(4):60-63.

[28]李迎秋,陳正行.高壓脈沖電場對大豆分離蛋白功能性質的影響[J].農業工程學報,2006(8):194-198.

Effect of ultrasonic treatment on the structure and functional properties of mung bean protein

YANG Yong1,2,BI Shuang2,WANG Zhong-jiang2,LI Yang2,*,JIANG Lian-zhou2,*

(1.Key Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang Province,College of Food and Bioengineering,Qiqihar University,Qiqihar 161006,China;2.College of Food Science,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

This experiment studied the effect of ultrasonic on structure and function properties of mung bean protein.The research found that the content ofβ-sheet structure decreased after ultrasonic treatment,butβ-turn confirmation contents significantly increased,while the contents of the other two structures(α-helix and random coil)were also increased.With ultrasonic power increased and ultrasonic time prolonged,the content ofβ-sheet structure was decreased and the percentage ofβ-turn confirmation was gradually increased.Ultrasonic treatment did not change the solubility of mung bean protein,but increased its surface hydrophobicity,emulsibility,foamability and foaming stability effectively.In low intensity ultrasound(200 W),the four properties of mung bean protein isolate were all increased with treated time increase,while decreased with treated time increase under higher ultrasonic power(400 W).

Ultrasonic treatment;mung bean protein;structure;functional properties

2015-11-19

楊勇(1979-)，男，博士研究生，副教授，從事糧油加工研究，E-mail:yangyong7904@163.com。

李楊(1981-)，男，博士，副教授，研究方向：糧食、油脂與植物蛋白工程，E-mail:liyanghuangyu@163.com。

江連洲(1960-)，博士，教授，從事糧油加工研究，E-mail:jlzname@163.com。

國家科技支撐計劃課題(2014BAD22B00)；黑龍江省自然科學基金(ZD201302)；黑龍江省自然科學基金項目(C201331)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)09-0069-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.005