靈芝菌絲體破碎處理方法的比較

秦可欣,石彥國,孫冰沁,陳　浩,何國慶,*

(1.哈爾濱商業大學食品工程學院,黑龍江哈爾濱 150076;2.浙江大學生物系統工程與食品科學學院,浙江杭州 310058)

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靈芝菌絲體破碎處理方法的比較

秦可欣1,石彥國1,孫冰沁2,陳浩2,何國慶2,*

(1.哈爾濱商業大學食品工程學院,黑龍江哈爾濱 150076;2.浙江大學生物系統工程與食品科學學院,浙江杭州 310058)

靈芝是一種珍貴的藥用真菌,含有多種生物活性物質,如靈芝多糖、三萜類化合物,同時具有較高的產β-葡萄糖苷酶活性。為了提高靈芝菌絲體中β-葡萄糖苷酶的利用效率,需要對菌絲進行破碎處理而使酶釋放出來。本文研究了通過打漿處理、升溫自溶、反復凍融和超聲破碎的方式來提取靈芝菌絲體中的β-葡萄糖苷酶,并比較了不同方法的提取效果。結果表明,以勻漿和超聲破碎結合的組合方法最佳,先在冰浴中勻漿處理1 min,在200 W下再以每超聲1 min間歇1 min的方式超聲破碎5次,β-葡萄糖苷酶的總活力可以達到3.116 U/mL,比直接提取提高了112.26%。顯微鏡觀察到勻漿后菌絲球可全部分散開,同時菌絲被不同程度的切斷,再經超聲破碎處理,菌絲幾乎全部破碎。

靈芝菌絲體,β-葡萄糖苷酶,提取,勻漿,超聲破碎

靈芝(Ganodermalucidum(Leyss.ex Fr.)Karst)是一種珍貴的藥用真菌,含有多種生物活性物質,如靈芝多糖、靈芝三萜以及各種酶類,具有多種生理功能和寶貴的藥用價值[1-2]。液體培養的菌絲體可以發揮與子實體相同的生物活性,通過液體深層發酵培養可加速菌絲生成,縮短生長周期[3]。研究表明靈芝、香菇等擔子菌具有較好的產β-葡萄糖苷酶活性[4]。大豆異黃酮(Soybeanisoflavone)是大豆中多酚化合物的總稱,分為游離型苷元和結合型糖苷兩類,具有與雌激素相同的生物活性[5]。其中苷元占總量的2%～3%,結合型糖苷占總量的97%～98%。研究發現,糖苷形式的大豆異黃酮在體內不能直接被小腸壁吸收,必須將其轉化為游離型的苷元才能被吸收,因而發揮生物活性的是游離型的苷元。β-葡萄糖苷酶是一種纖維素酶類,其特性是可水解結合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵,同時釋放出β-葡萄糖和相應的配基,因此可用于大豆異黃酮糖苷的生物轉化[6]。利用含有β-葡萄糖苷酶的菌絲體進行異黃酮的生物轉化,形成黃酮苷元,大幅提高異黃酮的生物活性及其生物利用度,是開發多因子保健功能食品的新途徑。目前在日本、美國等國家已有研究者利用靈芝、灰樹花等食用菌發酵轉化大豆異黃酮糖苷,并與食用菌多糖相結合制成了一種有效的抗腫瘤藥物,在日本和美國被廣泛的用于腫瘤的預防和治療,取得了很好的療效[7]。浙江大學的崔美林博士對靈芝發酵轉化大豆異黃酮的條件進行了優化,最終大豆苷和燃料木苷的轉化率均可達到98%以上,經過體外抗氧化性實驗可以看出轉化后產品具有較好的體外抗氧化作用[8]。

為了提高靈芝菌絲體中β-葡萄糖苷酶的利用效率,需要對靈芝菌絲體進行破壁處理,使酶釋放出來,提高其酶活力。目前的研究中一般只是通過離心直接提取粗酶液或對菌絲體簡單的勻漿處理[9]。細胞破碎的方式有很多,例如高壓勻漿、研磨、反復凍融、超聲破碎、滲透壓沖擊、酶溶、化學滲透等[10-12],實際操作過程要根據所需胞內物質的性質而選擇相適應的破碎方法。本實驗采用勻漿處理、升溫自溶、反復凍融和超聲破碎的方式來對菌絲進行破壁處理,并通過多種方法組合處理的方式來增加β-葡萄糖苷酶的釋放。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

赤芝(G.lucidum·karst)河南省科學院食用菌工程技術中心;磷酸二氫鉀,無水硫酸鎂,維生素B1,瓊脂,檸檬酸,十二水磷酸氫二鈉,碳酸鈉,乳酸,分析純國藥集團化學試劑有限公司;對硝基苯酚(pNP)、對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(pNPG)阿拉丁試劑(上海)有限公司;斜面培養基:PDA 4.5%、瓊脂 1.7%、KH2PO40.3%、MgSO40.15%、VB10.005%;種子培養基:PDB 3.5%、蛋白胨 0.5%、酵母浸粉 0.3%、KH2PO40.3%、MgSO40.15%、VB10.005%、pH6.0;發酵培養基:麥芽汁(20o)30%、豆粕粉 6%、KH2PO40.3%、MgSO40.15%、VB10.005%、pH6.0。

MULTISKAN GO新一代全波長酶標儀Thermo,USA;JY96-IIN超聲波細胞粉碎機寧波新芝生物科技股份有限公司;ZKU-L362-40 ℃超低溫冷凍貯存箱中科生命科技股份有限公司;MDF-U53V-80 ℃超低溫冰箱Sanyo,Jpan;V-5000多可必食品加工器青島埠元電子有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1菌種培養方法斜面菌種活化:將靈芝菌種接種至斜面培養基上,放置28 ℃生化培養箱中培養(6～8 d)至斜面長滿菌絲為止。

種子制備:250 mL三角瓶中裝100 mL液體種子培養基,用接種鏟刮取法接入經活化的斜面靈芝兩試管,置28 ℃搖床中,搖床轉速180 r/min,培養7 d,供實驗作種子用。

菌種發酵:250 mL三角瓶中裝100 mL發酵培養基,接種量為10%,搖床轉速180 r/min,培養溫度28 ℃,培養時間8 d。

1.2.2菌絲體分離將發酵結束后的發酵液進行抽濾,分離菌絲體和發酵液;其中,發酵液用比色法測定胞外β-葡萄糖苷酶酶活,菌絲體經無菌水多次洗滌后,進行β-葡萄糖苷酶的提取。

1.2.3菌絲體破碎處理方法

1.2.3.1勻漿處理向菌絲體中加入蒸餾水,在冰水浴中用“多可必”食品加工器以轉速22000 r/min進行勻漿處理,為了防止持續長時間處理導致液體升溫較高而引起酶活的損失,此方法采用每勻漿1 min間歇1 min的方式,勻漿次數設置為1、3、5、7次,得到粗酶液。

1.2.3.2升溫自溶及與勻漿組合處理升溫自溶:該方法不進行菌絲體與發酵液的分離,當菌種發酵結束時,將培養溫度分別調到28、34、40、46 ℃繼續培養2 d,發酵上清液即為粗酶液。

升溫自溶+勻漿處理:上述升溫自溶發酵結束樣品,將菌絲和發酵液分離,發酵液直接測定胞外酶活,菌絲體用水稀釋后,在冰水浴中用“多可必”食品加工器以轉速22000 r/min勻漿處理5次。

1.2.3.3反復凍融及與勻漿組合處理反復凍融:向菌絲體中加入蒸餾水,分別置于-20、-40、-80 ℃下冷凍8 h,然后常溫解凍1 h,反復三次,得粗酶液。

勻漿處理+反復凍融:向菌絲體中加入蒸餾水,在冰水浴中以轉速22000 r/min進行勻漿處理1 min,再放置-20、-40和-80 ℃反復凍融三次處理。

1.2.3.4超聲破碎及與勻漿組合處理超聲破碎:向菌絲體中加入蒸餾水,在冰水浴中進行超聲破碎,超聲功率200 W,為了防止持續長時間超聲導致液體升溫較高而引起酶活的損失,采用每勻漿1 min間歇1 min的方式破碎,超聲次數為1、5、10、15、20次,得粗酶液。

勻漿處理+超聲破碎:向菌絲體中加入蒸餾水,在冰水浴中以轉速22000 r/min進行勻漿處理1 min,再進行超聲破碎處理,超聲次數分別設置為1、5、8、10次,得粗酶液。

1.2.4酶活測定方法本實驗采用比色法,以對硝基苯基-β-D-葡萄糖苷(pNPG)為底物進行酶解,底物水解后釋放出來的對硝基苯酚在400～420 nm可見光范圍內有特征吸收峰,可直接在400～420 nm之間比色測定[13]。

酶活定義:β-葡萄糖苷酶酶活力單位(U)定義為,在pH5.0、50 ℃反應條件下,一分鐘時間內底物被水解釋放出1 μmol的pNP所需要的酶量。

表1　勻漿處理對酶活的影響Table 1　The effect of homogenate on enzyme activity

注:同一行,上標字母不同表示在p<0.05水平時差異顯著。

2　結果與討論

2.1勻漿處理對β-葡萄糖苷酶提取的影響

表1列出了菌絲體經勻漿處理后β-葡萄糖苷酶總活力的變化情況。由表1可以看出,勻漿處理可以有效提取菌絲中的β-葡萄糖苷酶,隨著勻漿次數的增多,酶活不斷增加,當勻漿次數增加到5次時提取效果達到最佳,比直接提取增加了57.36%。

2.2升溫自溶與勻漿組合處理對β-葡萄糖苷酶提取的影響

在靈芝發酵過程中,適當的升高發酵溫度會使靈芝菌絲體發生自溶,導致胞內的某些產物釋放。圖1為采用升溫的方式來促進胞內酶的釋放以及升溫后結合勻漿處理的提取結果對比。結果顯示,單一靠升溫來增加菌絲中β-葡萄糖苷酶的釋放效果并不理想,當溫度升為34 ℃發酵時,酶活僅比初始的1.468 U/mL增加了6.40%,溫度控制在40 ℃以上時,酶活會明顯的降低;發酵過程中溫度升高的越多,生物量減少越明顯,溫度升高到46 ℃時生物量由28 ℃時的20.18 g/L降低到10.02 g/L,減少了50.35%。說明發酵過程升高溫度,菌體會發生自溶,但胞內酶的釋放并不顯著,較高的溫度不利于菌絲的生成,因此酶的形成也受到很大的阻礙。當升溫發酵后與勻漿處理組合處理則表現出較顯著的效果,靈芝在28 ℃發酵結束后將溫度升至34 ℃再繼續發酵2 d,結合勻漿處理酶活可達2.427 U/mL,比直接提取提高了65.33%,比上述單一勻漿處理的方法提高了5.06%。

圖1　升溫自溶及與勻漿組合處理結果對比Fig.1　Comparison of heating autolysis extraction and the combination with homogenate processing

2.3反復凍融與勻漿組合處理對β-葡萄糖苷酶提取的影響

采用反復凍融以及與勻漿組合處理的提取結果如圖2所示,反復凍融可以有效提取菌絲體中β-葡萄糖苷酶,且勻漿和反復凍融組合處理的提取效果更加顯著。當冷凍溫度選擇在-40 ℃時對酶的提取最有效,與勻漿組合提取后酶活可達3.003 U/mL,比直接提取提高了104.56%。

圖2　反復凍融及與勻漿組合處理結果對比Fig.2　Comparison of repeated freezing-thawing and the combination with homogenate processing

2.4超聲破碎與勻漿組合處理對β-葡萄糖苷酶提取的影響

超聲破碎處理較其他幾種方法都表現出更好的效果,當超聲次數增加到10次時,酶活達到最高為3.094 U/mL,比直接提取提高了110.76%,超聲次數繼續增加,由于酶的敏感性,會有更多的酶活損失。對菌絲先勻漿處理1 min再進行超聲破碎,與單獨進行超聲破碎處理的結果進行比較,結果見圖3。當勻漿處理與超聲破碎組合處理時,酶活明顯高于單獨進行超聲破碎處理,且當勻漿與超聲組合時,僅需超聲5次就具有顯著的效果,雖然與單獨超聲10次的酶活無顯著差異,但節省了一半的處理時間。

由此得出靈芝菌絲體中β-葡萄糖苷酶的最佳提取方法是勻漿處理與超聲破碎的組合,即先對菌絲以22000 r/min勻漿處理1 min,再進行超聲破碎,超聲功率200 W,每超聲1 min間歇1 min,超聲次數為5次,此時可得β-葡萄糖苷酶的總活力為3.116 U/mL,比直接提取提高了112.26%。

圖3　超聲破碎及與勻漿組合處理結果對比Fig.3　Comparison of ultrasonic crushing and the combination with homogenate processing

2.5不同方式處理后菌絲形態變化

對不同方式處理后菌絲的形態進行觀察、比較,可以看出菌絲最初是成團分布的,大大小小的菌絲互相纏繞形成或大或小的菌絲球,如圖4-a。勻漿處理可使菌絲團均勻分散并斷裂;升溫自溶實驗菌絲的狀態與處理前并無明顯的區別,只是通過生物量的測定可以判斷菌絲明顯減少;經凍融處理后,肉眼所見菌絲狀態已完全改變,呈蜂窩狀,冷凍過程中由于水分由液態迅速變為冰晶形式而使菌體破裂,因此有利于酶的釋放;超聲處理可以更進一步破碎菌絲。

圖4中b、c為菌絲在勻漿和超聲破碎組合提取后通過普通光學顯微鏡觀察到的形態。我們可以看到,勻漿處理可以將菌絲球全部打散,并將菌絲切割成段,而使菌絲分散開來,但菌絲并沒有完全的破碎。因此本實驗選擇先通過簡單的勻漿處理,分散并切割菌絲,再進行超聲破碎,使菌絲斷裂的更徹底,更進一步的破碎菌絲,提高酶的提取效果。不過考慮酶活的損失問題,不能無限量的增加超聲破碎時間,因此依然還會有極少量的菌絲不能被徹底破碎掉。

圖4　采用勻漿和超聲破碎組合處理時菌絲的顯微形態變化Fig.4　Microscopic morphological changes of mycelium in the combination of homogenate and ultrasonic crushing

3　結論

通過以上幾種靈芝菌絲體破碎處理方法來提取β-葡萄糖苷酶的對比,得到最佳處理方法是先對菌絲勻漿1 min,然后進行超聲破碎,超聲功率200 W,以每超聲1 min間歇1 min的方式超聲5次,此時可得β-葡萄糖苷酶的總活力為3.116 U/mL。這種方法操作簡單,酶活損失少。通過顯微形態觀察可知先對菌絲打漿處理,可將菌球打散、菌絲打斷,再進行超聲破碎,進一步的破碎菌絲,提高酶的釋放。通過這種方法來提高酶的提取效率,不僅有助于食品工業上β-葡萄糖苷酶的分離純化,提高其產量,更為靈芝發酵轉化大豆異黃酮糖苷開發多因子保健食品提供了有利基礎。由于酶的不穩定性,我們無法通過不斷的增加超聲時間和次數來達到所有菌絲完全徹底破碎的效果,因此,在以后的研究中有必要探尋出一種破碎效果更好,對酶活影響極小,而對酶的提取更加有效的方法。

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Comparison crushing methods ofGanodermalucidumMycelium

QIN Ke-xin1,SHI Yan-guo1,SUN Bing-qin2,CHEN Hao2,HE Guo-qing2,*

(1.Food Science and Engineering College,Harbin University of Commerce,Harbin 150076,China;2.College of Biosystems Engineering and Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

Ganodermalucidumis a precious medicinal fungi,which contains a variety of biological active substances,such asganodermalucidumpolysaccharide,triterpene compounds and has highβ-glucosidase activity.In order to improve the utilization efficiency of theβ-glucosidase,it is necessary to break theganodermalucidummycelium and release the enzyme to the full extent.Therefore,four methods of homogenate processing,heating autolysis extraction,repeated freezing-thawing,and ultrasonic crushing were used to extract theβ-glucosidase from theganodermalucidummycelia,and the extraction effect of different methods was compared.The results exhibited the best extraction method forβ-glucosidase extraction was the combination of homogenate processing and ultrasonic crushing.The mycelia form the fermented liquids needed to be treated by homogenate processing for 1 min in the ice bath,and then be treated 1 min intermittent 1 min for 5 times by ultrasonic crushing in 200 W.In this case,the total enzyme activity of theβ-glucosidase reached 3.116 U/mL,which increased by 112.26% than that of non-broken treatment.Through microscope it can be observed that the mycelium ball was dispersed completely,the hyphae were cut off in varying degrees by homogenate and almost all were broken by ultrasonication.

Ganodermalucidummycelia;β-glucosidase;extraction;homogenate;ultrasonic crushing

2015-10-16

秦可欣(1988-)，女，碩士，研究方向：大豆加工技術,E-mail:460040223@qq.com。

何國慶(1957-)，男，博士，教授，研究方向：食品生物技術及發酵工程，E-mail:gqhe@zju.edu.cn。

國家自然科學基金資助項目(31271816)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)09-0146-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.020