響應面法優(yōu)化嗜熱鏈球菌產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵條件

陳　亞,梁　琪,*,楊　敏,2,張衛(wèi)兵,張　炎

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學理工學院,甘肅蘭州 730070)

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響應面法優(yōu)化嗜熱鏈球菌產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵條件

陳亞1,梁琪1,*,楊敏1,2,張衛(wèi)兵1,張炎1

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學理工學院,甘肅蘭州 730070)

本實驗采用響應面法(RSM)對影響嗜熱鏈球菌(Q4)產(chǎn)胞外多糖(EPS)的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。以EPS含量為指標,通過單因素實驗初步得到Q4產(chǎn)EPS的發(fā)酵條件;采用Placket-Burman(PB)設計法從以上單因素中篩選出顯著因素,對顯著因素進行Box-Behnken(BB)中心組合實驗設計優(yōu)化,建立EPS含量與各影響因素的回歸方程,獲得Q4產(chǎn)胞外多糖的最佳發(fā)酵條件為:初始pH6.8、發(fā)酵時間33 h、發(fā)酵溫度41 ℃。驗證實驗結果表明,在此條件下胞外多糖的產(chǎn)量可達268.42 mg/L,比優(yōu)化前的EPS含量(89.43 mg/L)提高了3倍。

響應面法，嗜熱鏈球菌，胞外多糖，培養(yǎng)條件

嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)是乳酸菌的一種,它能利用碳水化合物并產(chǎn)生大量乳酸,常被用來制作乳酸菌種,也可和保加利亞乳酸桿菌共生于脫脂乳中以生產(chǎn)酸乳及酸乳飲品。其產(chǎn)黏性對提高酸奶的組織狀態(tài)及研制高效的直投式酸奶發(fā)酵劑具有非常重要的指導意義。因此,它的開發(fā)利用一直得到國內(nèi)外乳品界的高度重視[1]。

近幾十年來,由于微生物胞外多糖在產(chǎn)品結構、性能及生產(chǎn)方面所具有的特別優(yōu)勢而得到大力研究和開發(fā),尤其是微生物胞外多糖的開發(fā)已成為工業(yè)微生物研究的熱點之一。乳酸菌是公認的安全的食品級微生物,其次級代謝產(chǎn)物胞外多糖與其他多糖比較,對人類的安全性更為可靠[2-3],其中嗜熱鏈球菌具有很好的產(chǎn)黏特性,是鏈球菌屬中唯一的益生菌,其產(chǎn)生的胞外多糖具有多種生理功能,能夠增強人體免疫,可用于食品工業(yè)和醫(yī)藥領域,具有潛在的開發(fā)價值,因而受到人們關注[4]。大量研究表明[5],乳酸菌胞外多糖不僅可以用做增稠劑、凝膠劑和穩(wěn)定劑,對人體健康也有促進作用,如:能降低膽固醇,抗癌,抗?jié)?改善腸道微生態(tài)環(huán)境,增強人體免疫力或作為益生元等。但是由于乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量低,菌株穩(wěn)定性差,并且培養(yǎng)過程中降解率高,這是限制其在工業(yè)領域中大規(guī)模生產(chǎn)的主導因素。為了解決這個問題,在發(fā)酵工業(yè)中,提高微生物代謝產(chǎn)量的方法有很多種,乳酸菌EPS生物合成除受遺傳因素即菌株自身因素的影響外,還受培養(yǎng)基的組成、pH、培養(yǎng)溫度和發(fā)酵時間等培養(yǎng)條件的影響[6-7]。因此,本實驗開發(fā)具有生產(chǎn)能力的嗜熱鏈球菌Q4菌株,并對其產(chǎn)胞外多糖的發(fā)酵條件進行系統(tǒng)地研究具有重要科學價值,特別是高產(chǎn)EPS發(fā)酵乳制品的開發(fā)以及新型發(fā)酵多糖的功能特性的研究等。本研究在影響Q4高產(chǎn)EPS單因素實驗的基礎上,采用響應面分析法進一步優(yōu)化Q4產(chǎn)EPS的發(fā)酵條件。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

嗜熱鏈球菌Q4,從甘肅部分藏區(qū)自然發(fā)酵牦牛乳中分離篩選所得(實驗室冰箱-80 ℃保存),三氯乙酸、95%乙醇、濃硫酸、苯酚等均為分析純;改良M17培養(yǎng)基,按文獻進行配制[8]。

TGL-20高速臺式冷凍離心機長沙湘儀離心機儀器有限公司;SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺蘇州凈化設備有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱上海-恒科儀器有限公司;PHS-3CpH計上海儀電科學儀器股份有限公司;54PG型紫外可見光分光光度計上海儀譜儀器有限公司;旋轉蒸發(fā)器RE-52AA上海亞榮生化儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1菌種的活化與傳代用10%(w/v)脫脂乳作為培養(yǎng)基在115 ℃條件下滅菌15 min。在滅菌完的超凈工作臺中,按接種量5%吸取菌液,接種到脫脂乳中,震蕩均勻后放于37 ℃生化培養(yǎng)箱,培養(yǎng)12 h。然后將發(fā)酵脫脂乳傳代培養(yǎng)于新的脫脂乳中,培養(yǎng)12 h。如此傳代培養(yǎng)2～3代,使菌株活力恢復。獲得足夠量的脫脂乳培養(yǎng)物進行下一步實驗。

1.2.2母發(fā)酵液的制備按4%(V/V)的接種量,將活化后的脫脂乳接于30 mL的M17液體培養(yǎng)基中,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后,得發(fā)酵母液。

1.2.3發(fā)酵液的制備將母發(fā)酵液按4%(V/V)的量,接入裝有100 mL M17液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,轉速為180 r/min,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后,得發(fā)酵液。

1.2.4EPS的提取參照李全陽[9]的方法將發(fā)酵液在沸水浴中加熱10 min,冷卻后離心(4 ℃,10000 r/min)15 min,收集上清液,菌體沉淀用PBS洗滌三次,合并上清液;將上清液濃縮至原來體積的1/5,并加入15%的TCA溶液,室溫下攪拌2 h后,離心(4 ℃,10000 r/min)30 min以除去蛋白沉淀;取上清液加入3倍體積的95%乙醇,4 ℃冷藏過夜,多糖呈絮狀沉淀析出,離心(4 ℃,10000 r/min)10 min后,收集沉淀,用蒸餾水溶解(重復以上操作3～4次),并移入透析袋中用蒸餾水透析2 d,每8 h換一次水,將透析液稱量、稀釋、定容。

1.2.5ESP的測定采用苯酚硫酸法測定透析后的EPS含量,參照薩如拉[10]的方法。

1.2.5.1葡萄糖標準曲線的繪制準確稱取經(jīng)105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖25 mg,用蒸餾水溶解并定容于250 mL容量瓶中,制成濃度為0.1 mg/L的葡萄糖標準溶液。分別吸取標準液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8和2.0 mL置于9支干燥具塞的試管中,并加蒸餾水至2 mL,然后向各試管分別加6%苯酚溶液(新制)1 mL,搖勻,然后迅速加入濃硫酸5.0 mL,立即搖勻,室溫下靜置30 min,于490 nm波長處測定各溶液的吸光度,蒸餾水為空白對照組,以葡萄糖稀釋液的濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制葡萄糖標準曲線。

圖1　葡萄糖標準曲線Fig.1　Standard curve of glucose cocentration

1.2.5.2EPS的含量測定準確吸取1 mL上述EPS溶液,加入6%苯酚溶液(新制)1 mL和5 mL濃硫酸,靜置10 min并搖勻,室溫放置30 min后,于490 nm波長處測定各溶液的吸光度,蒸餾水為空白對照組,在標準曲線上查找對應的EPS含量,即得嗜熱鏈球菌Q4的胞外多糖產(chǎn)量。

1.2.6單因素實驗

1.2.6.1初始pH對EPS含量的影響將含Q4的M17一次發(fā)酵液按4%的接種量接種至起始pH分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的M17液體培養(yǎng)基中,于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后,測定其EPS含量,設3次重復。

1.2.6.2發(fā)酵時間對EPS含量的影響將含Q4的M17一次發(fā)酵液按4%的接種量接種至起始pH7.0液體培養(yǎng)基中,于37 ℃下分別培養(yǎng)8、16、24、32、40 h后,測定其EPS含量,設3次重復。

1.2.6.3發(fā)酵溫度對EPS含量的影響將含Q4的M17一次發(fā)酵液按4%的接種量接種至起始pH7.0的M17液體培養(yǎng)基中,分別在37、39、41、43、45 ℃下培養(yǎng)24 h后,測定其EPS含量,設3次重復。

1.2.6.4接種量對EPS含量的影響取接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%的含Q4的M17一次發(fā)酵液接種至起始pH7.0的M17液體培養(yǎng)基中,于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后,測定其胞外多糖含量,設3次重復。

1.2.6.5搖床轉速對EPS含量的影響將含Q4的M17一次發(fā)酵液按4%種量接種起始pH7.0的M17液體培養(yǎng)基中,選擇轉速分別為0、80、160、240、320 r/min,于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后,測定其胞外多糖含量,設3次重復。

1.2.7響應面法優(yōu)化Q4發(fā)酵產(chǎn)EPS的培養(yǎng)條件

1.2.7.1Placket-Burman(PB)實驗設計優(yōu)化在單因素實驗的基礎上,根據(jù)Plackett-Burman(PB)實驗設計原理,對初始pH(A)、發(fā)酵時間(B)、發(fā)酵溫度(C)、接種量(D)、旋轉速度(E)5個因素,以EPS含量為響應值進行二級水平實驗,篩選出對EPS含量有顯著性影響的因素,其水平編碼表見表1。

表1　Plackett-Burman(PB)實驗設計因素及水平表Table 1　Factors and levels of Plackett-Burman(PB)design

1.2.7.2Box-Behnken(BB)實驗設計根據(jù)BB實驗設計原理,以PB實驗篩選出的三個顯著因素,即初始pH、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間為實驗因素,EPS含量為實驗指標,每個因素選三個水平,設計三因素三水平包括5個中心點共17個實驗點的響應面分析水平表見表2。

表2　響應面因素水平表Table 2　Actors and levels of Box-Behnken(BB)design

1.2.8數(shù)據(jù)分析實驗結果采用三次重復并取平均值±標準差表示;采用Origin8.0軟件作圖,Design Expert 8.0.6統(tǒng)計分析軟件進行響應面設計與分析。

2　結果與分析

2.1單因素實驗結果

2.1.1初始pH對EPS含量的影響在液體發(fā)酵過程中,發(fā)酵液的初始pH與微生物的生命活動有著密切聯(lián)系,微生物的生長及代謝產(chǎn)物的形成必須通過各種的酶催化反應來完成,pH的變化會影響酶的活性,進而影響菌體的生長和代謝產(chǎn)物的合成。不同初始pH下Q4產(chǎn)生EPS的情況如圖2所示。

圖2　初始pH對EPS含量的影響Fig.2　Effects of intial pH on the content of EPS

由圖2可知,EPS含量隨初始pH的增大呈先上升后下降的趨勢,當pH為6.5時EPS的含量達到最高,為268.41 mg/L,之后隨pH的增大而緩慢下降,因此確定嗜熱鏈球菌Q4產(chǎn)胞外多糖的最適pH為6.5。這和大多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)微生物產(chǎn)EPS的最適pH在中性偏酸的結果相一致[11];而初始pH較小時,EPS含量也較低,其原因可能是由于低pH抑制了菌體的生長進而影響EPS的分泌[12-13]。該結果說明發(fā)酵液的初始pH對EPS的含量影響較大,故選擇pH6.5。

2.1.2發(fā)酵時間對EPS含量的影響不同種乳酸菌產(chǎn)EPS的時間差異很大,即使同一種乳酸菌同一品系間產(chǎn)EPS的時間差異也會很大。有些菌體在對數(shù)期產(chǎn)生EPS,而有一些在對數(shù)期并不產(chǎn)生卻在穩(wěn)定期才產(chǎn)生EPS[14]。因此時間也是影響EPS產(chǎn)量的重要因素之一。該菌株在不同發(fā)酵時間對Q4產(chǎn)EPS的影響如圖3所示。

圖3　發(fā)酵時間對EPS含量的影響Fig.3　Effects of fermentation time on the content of EPS

由圖3可知,EPS含量隨著發(fā)酵時間的延長先逐漸增大后緩慢減小,當發(fā)酵時間達32 h時,EPS含量達到最大268.04 mg/L,此時剛好處于菌體生長穩(wěn)定期的后期,因為一般EPS在菌體的對數(shù)生長末期和穩(wěn)定期產(chǎn)生,因此延長發(fā)酵時間有助于EPS的積累,這與賈建波等人的研究結果一致[15];進一步延長發(fā)酵時間,EPS含量呈逐漸下降趨勢,可能是因為培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分減少,無法繼續(xù)提供菌體細胞生長及EPS的分泌,也可能是發(fā)酵后期細菌產(chǎn)生降解多糖的酶所致[16]。因此選擇發(fā)酵時間32 h。

2.1.3發(fā)酵溫度對EPS含量的影響發(fā)酵溫度也是影響細胞生長繁殖和EPS合成的重要因素。發(fā)酵溫度不同,菌株的生長速度及其合成EPS的產(chǎn)量也有明顯的區(qū)別。不同發(fā)酵溫度對EPS產(chǎn)量的影響如圖4所示。

圖4　發(fā)酵溫度對EPS含量的影響Fig.4　Effects of fermentation temperature on the content of EPS

由圖4可知,EPS含量隨著發(fā)酵溫度的升高先增大后減小,當發(fā)酵溫度為41 ℃時EPS含量達到最高,為267.98 mg/L,這可能是由于嗜熱鏈球菌的最適發(fā)酵溫度在40 ℃左右,其菌體生長最旺盛;發(fā)酵溫度過低或過高都不利于Q4菌株合成EPS,其原因可能是是發(fā)酵溫度過低,菌體生長緩慢,菌體濃度不高,使類異戊二烯脂質(zhì)載體發(fā)生鈍化現(xiàn)象,EPS的產(chǎn)量則較低[17];發(fā)酵溫度過高,會使穩(wěn)定期提前到來,菌體在發(fā)酵后期容易衰老而自溶,菌體濃度也不高,同時會使類異戊二烯脂質(zhì)載體失活,多糖的產(chǎn)量也會明顯的降低[18-19]。因此,選擇41 ℃作為發(fā)酵溫度。

2.1.4接種量對EPS含量的影響接種量可以通過影響發(fā)酵液中的最初活菌數(shù),進而影響菌體在生長代謝過程中代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。因此,本實驗尋找最適的接種量對于提高Q4菌株在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的EPS含量具有重要意義。接種量對EPS產(chǎn)量的影響如圖5所示。

圖5　接種量對EPS含量的影響Fig.5　Effects of inoculum dosage on the content of EPS

由圖5可知,隨著接種量的增大,起初EPS含量也隨之增大,當接種量達到3%時,EPS含量達最大262.47 mg/L,進一步增大接種量時,EPS產(chǎn)量反而降低,研究表明[20],這可能是由于接種量過大,發(fā)酵前期會使菌體生長過快、菌體濃度過高,中后期會因營養(yǎng)物質(zhì)消耗殆盡而導致合成胞外多糖的前體物質(zhì)減少,從而降低EPS的含量;而接種量過小,菌體生長緩慢,生長延滯期則過長,營養(yǎng)物質(zhì)無法得到有效利用,會向周圍環(huán)境發(fā)生過多的擴散而導致嚴重損失而降低細胞活性,不利于EPS的代謝。因此,選擇接種量為3%。

2.1.5搖床轉速對EPS產(chǎn)量和菌體生長的影響不同菌株、不同氧需求量對微生物代謝產(chǎn)物的合成產(chǎn)量有較大的影響,嗜熱鏈球菌是一種兼性厭氧型細菌,因此菌體的生長發(fā)育需要一定的氧氣供給,而氧的供給又是調(diào)節(jié)搖床轉速和通氣量來實現(xiàn)的。因此本實驗選用5種不同的搖床轉速對Q4耐氧性能進行了考察,其不同攪拌速度下EPS的合成量如圖6所示。

圖6　旋轉速度對EPS含量的影響Fig.6　Effects of rotational speed on the content of EPS

由圖6可知,隨著搖床轉速的提高,發(fā)酵液中EPS含量逐漸增大當轉速為160 r/min時,EPS含量達到最大值253.85 mg/L,之后隨之逐漸減小,可見轉速過低時,由于溶氧量不均勻,通氣不好,導致菌體生長不良,產(chǎn)生EPS含量較低;當提高搖床轉速,雖然有利于菌體生長,但營養(yǎng)成分消耗也較大,造成營養(yǎng)成分不足,且轉速過高,對菌體產(chǎn)生機械性損傷,引起菌體自溶,從而抑制EPS的合成[21]。因此,選擇旋轉速度160 r/min。

2.2PB實驗設計及結果

根據(jù)乳酸菌生長及其代謝產(chǎn)物EPS含量的一般規(guī)律,選用n=11的PB設計表,其中5個為影響因素(變量),預留6個空項作為誤差分析,利用Design-Expert 8.0.6 Trial軟件設計出15組實驗,響應值R1為EPS含量(mg/L),結果見表3。

表3　PB實驗設計及結果Table 3　Results of Plackett-Burman(PB)design

表4　PB實驗設計回歸方程方差分析Table 4　Analysis results of regression and variance of PB design

注:p<0.05表示顯著,用*表示;p<0.01表示極顯著,用**表示。

PB實驗設計的回歸方程方差分析結果見表4,擬合出的二項式模型的適合度由回歸系數(shù)R2來表示,R2=0.9424,結果顯示該模型與實際數(shù)據(jù)的擬合程度較高,且與實際預測值(0.9775)間的誤差較小;統(tǒng)計的顯著性由F檢驗來決定,模型的p值遠遠小于0.01,說明該模型高度顯著;失擬項(0.2264)>0.05,不顯著,說明該模型可用。而且由相關系數(shù)分析可得:離散系數(shù)C.V.=0.52%,表示數(shù)據(jù)離散度正常,信噪比Adeq Precision等于42.95,遠大于4,說明該模型選擇正確,能夠合適地反映實驗結果。同時可根據(jù)F值得大小確定影響EPS含量的因素的次序依次是:A>C>B>D>E,即初始pH>發(fā)酵溫度>發(fā)酵時間>旋轉速度>接種量,其中初始pH、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間對EPS含量有極顯著的影響,接種量對EPS含量有顯著的影響。因此確定通過BB中心組合實驗對以上三個因素進行響應面優(yōu)化。

2.3響應面分析

2.3.1Box-Behnken設計和響應面分析結果根據(jù)BB實驗設計的原理,利用Design-Expert 8.0.6軟件設計了3個因素3水平包括5個中心點共17個實驗點的響應面分析實驗(中心實驗用來估計實驗誤差,其余為析因?qū)嶒烖c)對其結果進行回歸分析,計算EPS含量的回歸方程,并進行方差分析,見表5。

通過Design-Expert軟件對表5的數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合,得到EPS含量對初始pH、發(fā)酵時間及發(fā)酵溫度的二次多項式回歸方程為:

Y=267.21+8.21A+1.92B+3.12C+0.64AB+1.18AC-3.72BC-7.86A2-11.96B2-9.23C2

式中,Y為預測響應值,A、B、C分別為初始pH、發(fā)酵時間及發(fā)酵溫度的編碼值。方程中各項系數(shù)絕對值大小直接反映各因素對響應值的影響程度,系數(shù)的正、負影響其方向。由方程的二次項系數(shù)為負值,推斷方程代表的拋物面開口向下,具有極大值點,可以進行優(yōu)化分析。對該模型進行方差分析,結果見表6。

表5　響應面設計實驗結果Table 5　Rresults of Box-Benhnken design

方程一次項中A和C因素均極顯著(p<0.01),B因素顯著(0.010.05)。因此,這三因素之間并不是簡單的線性關系,存在交互作用。各因素按影響大小依次排序為初始pH>發(fā)酵溫度>發(fā)酵時間。

表6　BB實驗設計的回歸方程的方差分析Table 6　Analysis results of regression and variance of BB design

2.3.2各因素交互作用對EPS含量的響應面分析三維響應面圖是回歸方程的直觀描述,通過它可以直觀、高效地找到最佳參數(shù)、各參數(shù)之間的相互作用和最大響應值。曲面用于反映單因素對結果的影響情況。曲面越陡斜表明該因素對EPS產(chǎn)量的影響越顯著;曲面平緩則相反。等高線表示在同一橢圓型的區(qū)域內(nèi),EPS含量是相同的。在橢圓形區(qū)域中心,EPS含量最高,由中心向邊緣EPS含量逐漸減少。圖中橢圓排列越密集,說明因素變化對EPS含量影響越大。同時等高線的形狀可反映交互效應的強弱。橢圓形表示兩因素交互作用顯著,而圓形則相反[22],表示兩因素交互作用可忽略。根據(jù)回歸方程繪出初始pH、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對EPS含量影響的響應面圖,分別見圖7、圖8、圖9。

圖7　初始pH和發(fā)酵時間對EPS含量的交互影響 Fig.7　Correlative effects of intial pH and fermentatime on the content of EPS

圖8　初始pH和發(fā)酵溫度對EPS含量的交互影響Fig.8　Correlative effects of intial pH and fermentation temperature on the content of EPS

圖9　發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度對EPS含量的交互影響Fig.9　Correlative effects of fermentation time and fermentation temperature on the content of EPS

圖7為因素C取0水平時,A和B的交互作用對響應值EPS含量的影響,從響應曲面看,二者曲面均表現(xiàn)較陡斜,A曲面略大于B曲面,表明該二因素對EPS含量的影響均顯著且A略顯著于B。從等高線看,該形狀明顯趨于圓,表明AB之間的交互作用較弱。圖8為因素B取0水平時,A和C的交互作用對響應值EPS含量的影響。二者曲面均較為陡斜,其中A曲面的陡斜程度大于C曲面,表明初始pH對EPS含量的影響比發(fā)酵溫度更為顯著。而等高線形狀也趨于圓,但AC的交互作用強AB的交互作用。圖8為因素A取0水平時,B和C的交互作用對響應值EPS含量的影響,對比二者的響應曲面發(fā)現(xiàn):C曲面大于B曲面,表明發(fā)酵溫度對EPS含量的影響最為顯著。等高線較扁平,明顯趨于橢圓,表明B和C之間的交互作用較強,即發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度之間存在明顯的交互作用,說明這兩個因素協(xié)同作用對EPS含量的影響較大。當發(fā)酵時間一定時,EPS含量隨著發(fā)酵溫度的升高先增大后減小;當發(fā)酵溫度一定時,EPS含量隨著發(fā)酵時間的延長而增加,達到一定時間時增加的幅度趨于平緩,并逐漸減小,最后EPS含量達到最大值268.68 mg/L。綜上所述,3個因素對EPS產(chǎn)量的影響顯著性順序為:初始pH>發(fā)酵溫度>發(fā)酵時間,與方差分析的結果保持一致。

2.4驗證實驗

通過響應面軟件分析,優(yōu)化后得到的最佳發(fā)酵條件為:初始pH為6.77、發(fā)酵時間為32.52 h、發(fā)酵溫度為41.38 ℃,在此條件下,EPS含量可達269.78 mg/L。但為檢驗該法的可靠性,考慮到實驗操作的局限性,將優(yōu)化后的最佳發(fā)酵條件修正為:初始pH為6.8、發(fā)酵時間為33 h、發(fā)酵溫度為41 ℃,在此條件下進行驗證實驗。經(jīng)3次平行實驗,實際EPS含量的平均值為268.42 mg/L,相對誤差為1.36%。可見,實驗結果與模型相符,說明該模型能較好地模擬和預測嗜熱鏈球菌產(chǎn)EPS的發(fā)酵條件,且具有一定意義的實踐指導意義。

3　結論

本實驗先通過對M17發(fā)酵液的初始pH、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量及旋轉速度的單因素實驗得出最佳發(fā)酵條件:初始pH6.5、發(fā)酵時間32 h、發(fā)酵溫度41 ℃、接種量3%、旋轉速度160 r/min;然后再通過Placket-Burman(PB)設計法從以上單因素中篩選出影響最顯著的3個因素為:初始pH、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度;最后在此基礎上的通過響應面法建立了顯著影響胞外多糖產(chǎn)量的二次多項數(shù)學模型,并利用統(tǒng)計學方法對該模型進行了顯著性檢驗,探討了各因素間的交互作用,最終得出嗜熱鏈球菌Q4產(chǎn)EPS含量的最佳發(fā)酵條件為:初始pH為6.8、發(fā)酵時間為33 h、發(fā)酵溫度為41 ℃,在此條件下通過模型預測的最大EPS含量為269.78 mg/L,與此條件下的驗證實驗結果的EPS含量(268.42 mg/L)間的相對誤差僅為1.36%,說明該模型能較好地預測實際EPS含量。因此,利用響應面分析法得到的最優(yōu)嗜熱鏈球菌Q4產(chǎn)EPS含量的發(fā)酵條件真實可靠,具有實際意義。

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Optimization of fermentation conditions for extracellular polysaccharide production bystreptococcusthermophiluswith response surface methodology

CHEN Ya1,LIANG Qi1,*,YANG Min1,2,ZHANG Wei-bing1,ZHANG Yan1

(1.Functional Dairy Engineering Laboratory in Gansu Province,College of Food science and engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070 China;2.College of Science,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070 China)

The quantitative effects of fermentation conditions on the yield ofStreptococcusthermophilus(Q4)extracellular polysaccharide were optimized using response surface methodology(RSM).The EPS content as an index,fermentation conditions of EPS produced by Q4 was preliminary obtained by single factor experiment.Then significant factors were screened from the above the single factors according to the Placket-Burman(PB)design method and were optimized using Box-Behnken design.And the EPS content as the response values,obtaining the response surface figure,the optimal fermentation conditions on the yield of(Q4)extracellular polysaccharide were determined:initial pH6.8,fermentation time 33 h and fermentation temperature 41 ℃.Under the optimal conditions the corresponding response value for extracellular polysaccharide production was 268.42 mg/L,compared with the previous EPS content(89.43 mg/L),which was increased 3 times.

response surface methodology;streptococcusthermophilus;extracellular polysaccharide(EPS);fermentation conditions

2015-10-12

陳亞(1987-)，女，碩士研究生，研究方向:乳品微生物,E-mail:chenya1224@126.com。

梁琪(1969-)，女，博士，教授，研究方向：食品品質(zhì)、乳品科學，E-mail:liangqi@gsau.edu.cn。

蘭州市研政產(chǎn)合作項目(2012-2-87);蘭州市科技創(chuàng)新人才團隊培育計劃項目(2011-1-144)。

TS201.3

A

1002-0306(2016)09-0195-07

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.030