蝦醬罐頭在不同的貯藏溫度和時間下菌落總數和揮發性物質的變化

戴　娟,馬　莉,李　曄

(寧波大學海洋學院 浙江寧波 315211)

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蝦醬罐頭在不同的貯藏溫度和時間下菌落總數和揮發性物質的變化

戴娟,馬莉,李曄*

(寧波大學海洋學院 浙江寧波 315211)

目的:研究貯藏溫度與時間對蝦醬罐頭菌落總數和揮發性物質的影響。方法:3M試紙檢測蝦醬罐頭在不同溫度下(4、16、30 ℃)貯藏一定時間后菌落總數的變化;電子鼻結合頂空固相微萃取(HS-SPME)和氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用技術,分析不同貯藏條件下蝦醬揮發性成分。結果:在4、16、30 ℃下貯藏,實驗周期內菌落總數分別達到103、105、107數量級。隨著菌落數的增加,電子鼻對揮發性物質的檢測信號也發生顯著變化。由GC-MS分析結果可知,蝦醬中主要有醛類、醇類、酮類等揮發性成分,不同貯藏條件下這些揮發性物質的種類和相對含量具有較大的差異。結論:結果表明貯藏溫度對蝦醬中菌落總數和揮發性物質的影響較大。貯藏溫度與時間的不同直接導致了菌落總數的變化,從而影響了微生物的代謝作用,進一步改變了蝦醬揮發性物質種類和相對含量。

蝦醬罐頭,微生物,電子鼻,菌落,揮發性物質

隨著中國社會經濟的不斷發展,人們生活水平的逐漸提高,方便、健康、營養、安全的罐頭食品正越來越受到消費者的認可。然而微生物作用引起的腐敗問題作為罐頭食品食用安全性的主要問題也開始層出不窮,其主要是由于殺菌不足或在殺菌后罐頭密封不良而遭受外界污染所造成的[1]。目前,國內外對罐頭食品中微生物的檢測主要是運用傳統的微生物學檢測方法,而傳統的方法實驗步驟繁瑣、周期長。因此,找出一種能夠準確、快速檢測罐頭食品微生物的方法具有重要意義。

電子鼻檢測過程簡單、快速,結果更為客觀、準確、穩定,因此電子鼻在食品分析等領域得到廣泛的應用[2]。電子鼻作為一種新型技術手段,已被廣泛用于食品中的微生物檢測。Cincina等[3]用電子鼻系統能夠正確檢測番茄是否腐敗。Falasconi 等[4]利用真菌的頂空揮發性化合物作為其毒素的標記物,用電子鼻嗅覺系統檢測玉米中產毒素的鐮刀菌株。Horvath 等[5]利用電子鼻系統評估了豬肉排骨的細菌腐敗情況。Keshri 等[6]利用電子鼻對從谷物糧食中分離的不同菌株揮發性氣味進行分析,建立了五種真菌的電子鼻鑒別模型。

氣-質聯用儀(GC-MS)主要用于混合樣品的分離及定性、定量分析,現已廣泛應用于生命科學、環保、材料、食品、藥物開發等領域。在早期研究中,已有學者們利用頂空技術結合氣相色譜和質譜儀(GC-MS)對微生物的揮發性代謝產物進行了一定的分析[7-10]。

本文以罐裝蝦醬為實驗材料,用3M試紙檢測不同貯藏條件下菌落總數的變化情況,通過電子鼻檢測確定蝦醬中揮發性物質的指紋圖譜,并利用GC-MS進一步驗證揮發性物質的具體變化,從而建立菌落總數與揮發性物質變化的關聯性,探討利用電子鼻準確、快速檢測罐頭食品中微生物的可行性。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

蝦醬罐頭(陸龍兄弟)保質期前期,寧波鎮海莊市樂購超市。

PEN3便攜式電子鼻德國Airsense公司;65 μm聚二甲基硅氧烷萃取頭美國Supelco公司;7890/M7-80EI氣質聯用儀美國Agilent公司、北京普析通用儀器有限責任公司;DB-5毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×2.5 μm)美國Agilent公司。

1.2樣品處理

將蝦醬罐頭分成3組,分別放在3臺恒溫培養箱中,溫度各設定為4、16、30 ℃,在2、4、8、10、12、24 d取樣。在無菌環境下對各組罐頭進行取樣,分別用于微生物檢測、電子鼻檢測和GC-MS測定。

1.3微生物檢測

根據SN/T 1897-2007[11],采用菌落總數Petrifilm TM測試片法。以無菌操作取25 g樣品,加入225 mL無菌水中,于8000 r/min均質2 min,制成1∶10的樣品勻液。用滅菌吸管準確吸取1∶10的樣品液10 mL,放入裝有90 mL無菌水的稀釋瓶中,迅速振搖混勻樣品,制成1∶100的樣品稀釋液。分別用滅菌吸管按上述方法將樣品液依次10倍遞增稀釋,釋至10-10倍。吸取10-1～10-10梯度的稀釋液1 mL分別均涂于3M試紙并標記,置于恒溫箱中過夜培養,進行菌落計數。

1.4電子鼻測定

準確稱取1.0 g樣品于15 mL螺紋口樣品瓶中,用電子鼻進行檢測。檢測條件:測試時間300 s,傳感器清洗時間200 s,數據采集時間為第250 s。

1.5GC-MS測定

取4、16、30 ℃溫度下貯藏24 d的蝦醬1.0 g于15 mL螺紋口樣品瓶。

固相微萃取條件:將萃取頭在氣相色譜的進樣口進行老化,250 ℃老化45 min。將老化后的萃取頭插入樣品瓶中,于50 ℃浴吸附30 min后取下,將其插入氣質聯用儀,進樣口220 ℃解吸2 min,啟動氣質聯用儀采集數據。

色譜條件:載氣He,流速1 mL/min;不分流模式進樣,進樣口溫度和傳輸線溫度均為220 ℃。程序升溫:起始柱溫50 ℃,以5 ℃/min升至200 ℃,保留5 min,再以10 ℃/min升至250 ℃,保持2 min。

質譜條件:離子源為電子轟擊源(EI),電離電壓70 eV,離子源溫度230 ℃,掃描范圍45～400 u。

1.6數據分析

利用PEN3內部WinMuster 軟件對電子鼻測得數據進行主成分分析(Principal Components Analysis,PCA),總貢獻率超過70%即可[12]。

利用GC-MS對不同溫度下貯藏24 d的蝦醬進行具體揮發成分分析,檢測結果通過計算機檢索,利用NIST和WILEY譜庫相互匹配進行定性分析。本文對譜庫中化合物相似度低于80(最大值為100)的組分標為未鑒定出,各組分相對百分含量按照峰面積歸一化法計算。

2　結果與分析

2.1蝦醬在不同貯藏條件下微生物的變化

從圖1可以看出,蝦醬菌落總數隨著貯藏時間的延長而增加;貯藏溫度越高,菌落總數增加越快。在4、16、30 ℃條件下,貯藏24 d的蝦醬的菌落總數由原來的2.48×102cfu/g,分別增加至7.48×103、6.25×105、8.52×107cfu/g。在實驗周期內,0～6 d菌落數增加比較明顯,6 d 以后增加速度比較緩慢。30 ℃的蝦醬在2～4 d,菌落總數從3.51×103cfu/g急劇增加到7.51×106cfu/g。蝦醬在16 ℃貯藏4～6 d菌落總數增加較快。在4 ℃下,24 d的實驗周期內,菌落總數變化不大,僅增加了一個數量級。結果表明貯藏溫度對蝦醬內菌落總數的影響較大,不同溫度下貯藏相同時間的蝦醬菌落總數差異較大。

圖1　蝦醬在不同貯藏條件下菌落總數的變化Fig.1　Changes of total bacterial count in shrimp sauceunder different conditions

2.2蝦醬揮發性物質的電子鼻檢測

圖2是不同貯藏條件蝦醬電子鼻PCA分析結果,圖中每個橢圓代表不同貯藏溫度和時間蝦醬的數據采集點。對蝦醬揮發性成分做PCA分析,結果PC1貢獻率為76.87%,PC1、PC2的總貢獻率為95.30%,可見PCA分析可用于區分不同貯藏條件下蝦醬的風味。貯藏溫度和時間的改變導致了菌落總數的變化,從而影響了蝦醬內部揮發性成分的改變。運用電子鼻可以區分不同貯藏條件下蝦醬揮發性成分的差異,且體現出一定的變化趨勢。因此,電子鼻結果在一定程度上體現了產品被微生物污染程度。

圖2　蝦醬不同貯藏條件的 PCA分析圖Fig.2　The PCA of shrimp paste storged at different conditions注:“16～24 d”表示16 ℃貯藏24 d,以此類推。

由圖可以看出,經過不同貯藏溫度和時間蝦醬的氣味發生了變化,在PCA 分析圖中呈現一定的聚類特性。如圖中所圈示1,在2～10 d,不同貯藏溫度(4、16、30 ℃)蝦醬的指紋圖譜呈現一定的聚類,分布的區域相對比較集中,且有部分重疊。而4 ℃貯藏2 d的蝦醬氣味指紋和新鮮蝦醬的指紋則分開,且距離較近。由圖中所示(2、3)可見,在12 d和24 d時,不同溫度下的蝦醬分布在不同的位置,揮發性氣味基本沒有重疊得到了較好的區分,且16 ℃和30 ℃氣味指紋距離較近,4 ℃與16、30 ℃較遠。說明貯藏較長時間(12、24 d)不同溫度下蝦醬內揮發性氣味物質發生了較大的變化。結合菌落總數變化的研究,實驗運用GC-MS對不同溫度下貯藏24 d的蝦醬揮發性物質做進一步分析和鑒定。

2.3蝦醬主要揮發性成分的GC-MS分析

經GC-MS 分析鑒定,蝦醬在4、16、30 ℃下貯藏24 d分別鑒定出30、22和15 種揮發性化合物,包括烴類、醇類、醛類、酮類、酯類、等其他類化合物,各組分結果見表2。

由表1可以看出,4 ℃蝦醬的主要揮發性物質是醛類,相對含量達31.86%,共計8 種。其中相對含量較多的有(E,E)-2,4-庚二烯醛(14.93%)、苯乙醛(6.19%)、庚醛(3.24%)等都是腥味物質[13-14],這幾種醛也是導致蝦醬腥味的主要物質。(E,E)-2,4-庚二烯醛具有青香、蘑菇似香氣,苯乙醛具有類似風信子的香氣,賦予水果甜香氣,庚醛具有強烈的油脂氣味和魚腥味[15]。(E,E)-2,4-庚二烯醛相對含量很高,推測其跟蝦醬的風味有關。醛類的閾值一般較低,醛類物質可能是蝦醬中的多不飽和脂肪酸在酶和微生物的作用下發生氧化降解而生成[16],它們產生青香或類黃瓜的氣味[17]。醛具有清香和似植物的氣味,在各種水產品中都有大量報道,如沙丁魚、對蝦、小龍蝦、海蟹和魷魚[18]。檢測出烴類6 種,相對含量為25.57%,僅次于醛類。酮類共檢測出7 種,含量達23.94%,相對含量較多的是3,5-辛二烯-2-酮(9.07%)、1-苯基-1,2-丙二酮(6.11%)、2-壬酮(2.99%)等。此外還含相對含量較多的2-乙基呋喃(1.04%)。

16 ℃貯藏的蝦醬主要揮發性物質為烴類,相對含量很高達53.00%。醛類的相對含量降低到12.96%,其中庚醛(4.49%)、苯乙醛(4.62%)相對含量較多。與4 ℃貯藏的蝦醬相比,炔烴和烯烴的含量明顯增加,其中炔烴含量最多。新檢出了糠醇、3-乙基苯甲醛、5-己烯-3-酮、6-辛烯-2-酮、2-乙基環丁酮、丁脒等物質。酮類的閾值比醛類高,酮類物質多由不飽和脂肪酸自動氧化、受熱分解、氨基酸降解或微生物作用產生。酮類對食品常常貢獻甜的花香和果香風味[19]。烯酮類檢出較多,其中3,5-辛二烯-2-酮在4 ℃和16 ℃貯藏的蝦醬中均被檢出,其為多不飽和脂肪酸自動氧化的產物,30 ℃溫度較高,微生物的作用發生了改變。甲基酮類具有獨特的青香和果香,并且隨著碳鏈的延長貢獻更強花香特征[20]。烯酮類是在加熱期間通過脂質氧化生成的產物,具有似玫瑰葉香。

30 ℃貯藏的蝦醬主要揮發性物質為烴類和醇類,其中醇類含量上升至22.79%,異戊醇(16.47%)是醇類中含量最多的。醇類由于其較高的閾值,對風味的貢獻較小。醇類主要由微生物發酵產生,由于貯藏溫度的變化,醇類物質發生了一定改變。30 ℃主要揮發性物質的種類相對較少,其中烴類、醇類、醛類、酮類的種類均有所減少。新增揮發性物質有亞硝酸環己酯、3-己烯-1-醇、3-戊酮、1-氯環己烯。酯類賦予食品甜的果香味,水產品中很少存在小分子脂肪酸酯。發酵肉制品時,酵母菌分解代謝糖類產生的醇與乳酸菌發酵產生的酸反應生成酯類,賦予產品特殊的酯香味,能顯著提高產品的香氣指數[21]。目前酯類在許多發酵水產品中檢出[22]。實驗中檢測的酯類物質種類較少,主要為己酸乙酯,主要賦予蝦醬果香味。

表1　不同貯藏溫度下蝦醬揮發性物質GC-MS分析Table 1　Volatile substances of shrimp paste GC-MS analysis at different temperatures

續表

注:“-”表示未檢出。

通過GC-MS分析發現,隨著貯藏溫度的升高揮發性物質種類和含量變化較大。醛類物質的種類和相對含量均減少。實驗過程中共檢測出9 種醛類物質,其中4 ℃貯藏條件下的蝦醬中檢測出8種,且隨著貯藏溫度的升高,相對含量明顯減少,從31.86%分別減少至12.96%,11.74%。與4 ℃相比,經16、30 ℃貯藏的蝦醬,烴類物質的相對含量大幅度增加,從25.57%增加至53.00%,30 ℃有所下降至33.20%。4 ℃和16 ℃貯藏的蝦醬醇類物質種類較30 ℃多,但相對含量卻隨著貯藏溫度的升高逐漸增加,從12.87%逐漸增加至15.23%、22.79%。酮類物質相對含量先減少后增加,從23.94%減少至12.99%,30 ℃有所增加至17.62%。酯類物質相對含量變化趨勢與酮類物質相同,從4.75%減少至3.68%,后增加至10.95%。其他類物質相對含量有所增加。實驗結果表明貯藏溫度的改變影響了微生物的代謝作用,從而導致了蝦醬揮發性風味物質種類及含量的變化。由以上分析可知,蝦醬在不同貯藏溫度下揮發成分發生了變化,其中醇類物質、酮類物質、醛類物質變化較大,因此這三類物質可以作為檢測微生物變化的參考指標。

3　結論

本研究利用電子鼻對不同貯藏溫度和時間的蝦醬進行檢測,分析電子鼻數據得出,蝦醬內部揮發性氣味發生了改變。用GC-MS對不同溫度(4、16、30 ℃)下貯藏24 d的蝦醬揮發性成分進行分析發現,不同貯藏溫度揮發性物質的種類和相對含量均發生了較明顯的變化。實驗結果表明貯藏溫度和時間對蝦醬罐頭中菌落總數的影響較大。貯藏溫度和時間的不同直接導致了菌落總數的改變,影響了微生物的代謝作用,從而導致了蝦醬揮發性物質種類和相對含量的變化。同一貯藏溫度下隨著貯藏時間的增加,蝦醬在微生物和酶等因素的作用下,蛋白質發生催化降解,導致揮發性物質發生了顯著變化。通過菌落總數結果結合電子鼻和GC-MS 分析結果發現,電子鼻和GC-MS能反映出蝦醬不同貯藏溫度同一時間點的微生物情況。因此,電子鼻和GC-MS可以作為一種蝦醬類罐裝食品的微生物檢驗評價方法,從而達到快速、準確的效果。

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Changes of the bacterial colonies and volatile substances in shrimp paste at different temperature and time

DAI Juan,MA li,LI ye*

(Shool of marine sciences,Ningbo University,Ningbo 315211,China)

Objective:Study the effects of temperature and time on the bacterial colonies and volatile substances in shrimp paste.Methods:Using 3M Petrifilm plate to detect microorganism of shrimp paste in different temperature(4,16,30 ℃)at a certain time.The electronic nose(E-nose)and headspace solid phase micro extraction(HS-SPME)combined with gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)were used to analyze the volatile compounds in shrimp paste at different conditions.Correlation between the changes of volatile compounds and the total numbers of colony was established in shrimp paste.Results:The total numbers of colony was respectively 103,105,107in the experimental period under the storage temperature of 4,16,30 ℃.The detection signal of volatile substances of E-nose dates changed significantly with the increase of the bacterial colonies.The results of GC-MS showed that the shrimp paste mainly contained aldehydes,alcohols,ketones and other volatile compounds.These compounds had a significant difference in variety and relative content in different conditions.Conclusion:The results showed that the temperature had a great influence on total numbers of colony and volatile compounds in the shrimp paste.Temperature and time led to the changes of the total number of colonies,thus affecting the microbial metabolism and changing the varieties and relative contents of the volatile substances in shrimp paste.

shrimp paste canned food;microbe;electronic nose;colony;volatile substances

2015-11-05

戴娟(1990-),女,碩士研究生,研究方向：食品科學,E-mail:13484278003@163.com。

李曄(1980-),女,博士,講師，研究方向：食品質量與安全,E-mail:liye@nbu.edu.cn。

國家自然科學基金(F01424145100)。

TS295.4

A

1002-0306(2016)09-0335-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.057