壇紫菜木瓜蛋白酶水解肽的抗腫瘤活性研究

白　露,范曉丹,張學武

(華南理工大學食品科學與工程學院,廣東廣州 510640)

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壇紫菜木瓜蛋白酶水解肽的抗腫瘤活性研究

白露,范曉丹,張學武*

(華南理工大學食品科學與工程學院,廣東廣州 510640)

壇紫菜是一種重要的經濟海藻,營養價值極高。為了探究壇紫菜中的抗腫瘤活性多肽,本研究以壇紫菜粉末為原料,采用反復凍融法和超聲波破碎法相結合提取蛋白,使用木瓜蛋白酶對粗蛋白進行酶解。初酶解物在MTT細胞增殖檢測結果的指引下,結合超濾、葡聚糖凝膠Sephadex G-15的分離純化和MALDI-TOF質譜分析,最終篩選出具有較強抗腫瘤活性的多肽。結果顯示經木瓜蛋白酶酶解物(設為P,分子量0～3 ku)分離純化得到的多肽組份P2,包含5個多肽,對乳腺癌MCF-7和肝癌細胞HepG-2的IC50值分別是63.64 μg/mL和59.09 μg/mL,其抗腫瘤活性均顯著高于陽性對照5-氟尿嘧啶(對MCF-7和HepG-2的IC50值分別是195.45 μg/mL和122.72 μg/mL),組份P3包含11個多肽,對肝癌細胞HepG-2的IC50值是209.09 μg/mL,也具有一定的選擇性抑制作用。

壇紫菜,酶解,肽,抗腫瘤,活性

生物活性肽(Bioactivity peptides)又稱功能肽(Functional peptides),是一類具有一定生理活性功能的肽,能抑制腫瘤細胞生長,破壞、殺傷腫瘤細胞或者抗菌、抗病毒、降血壓、降血糖等重要作用[1-4]。由于其分子量小、易于吸收,可以廣泛的應用于保健品和藥物的開發,因此,生物活性肽已成為蛋白質研究的熱點之一。

由于近幾年來惡性腫瘤的發病率不斷提高,而傳統化療藥物不僅毒副作用大而且治療效果并不理想,因此,生物活性肽憑借其活性高、副作用小、針對性強的優勢得到了國內外科研工作者的研究和關注。目前已經從多種生物中提取得到了抗腫瘤活性肽,其中海洋生物來源的活性肽展現了廣闊的前景。Golakoti T等從念珠藻(Nostocsp.)中提取得到的Cryptophycins多肽,對裸鼠異種移植的克隆癌、胰腺癌、乳癌和卵巢癌均具有很強的抑制作用。其中的Cryptophycins1和半合成的Cryptophycins8有較好的水溶性,并且對多種移植瘤包括多藥物抗性細胞系均有較好的治療效果,目前已進入臨床實驗階段[5-6]。易楊華等從棕色扁海綿(PhakelliafuscaThiele)中分離到一個具有抗有絲分裂活性和抗腫瘤活性的環7肽化合物[7]。從海蛤蝓Elysia rufescens及其所食的海藻Bryopsissp.中分離出來的Kahalalide F是由13個氨基酸殘基組成的環狀縮酚酸肽,它對前列腺癌、乳腺癌、胸腺癌和非小細胞肺癌等都有較強的抗腫瘤活性,且對正常細胞的敏感度降低,目前已處于實體瘤治療的Ⅱ期臨床實驗階段[8]。

壇紫菜(Porphyrahaitanesis)富含豐富的蛋白質、多糖、維生素、脂質和礦物質等多種成分,其中蛋白質含量達30%[9-11],根據《本草綱目》記載,壇紫菜還具有清熱解毒降血壓、抗癌等功效。利用酶解手段將壇紫菜蛋白進行非變性水解,不僅能提高壇紫菜蛋白的溶解率和體內吸收利用率,還能獲取具有特殊生理功能的生物活性肽。目前,已有報道從壇紫菜蛋白酶解物中成功提取出了ACE抑制肽、抗氧化肽、抑菌肽等[12-13],但抗腫瘤肽卻處于初級階段。本文對壇紫菜蛋白進行酶解、超濾、凝膠色譜分離和MALDI-TOF-TOF質譜分析等技術,并以MTT實驗為活性指標,篩選具有抗腫瘤活性的多肽組份,為制備壇紫菜抗癌藥物提供理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

壇紫菜廣東汕頭市南澳縣金山農業發展有限公司;乳腺癌細胞MCF-7和肝癌細胞HepG-2中山大學動物細胞實驗室;MTT美國Sigma公司;木瓜蛋白酶廣州齊云生物科技有限公司;Sephadex G-15美國GE公司;高糖DMEM完全培養基,胎牛血清,青霉素,鏈霉素,PBS美國Gibco公司;胰蛋白酶-EDTA消化酶,DMSO美國Bio Basic Unit公司;5-氟尿嘧啶上海漢博生物科技有限公司;其他試劑均為國產分析純。

Allegra X-22R高速冷凍離心機美國Beckman Coulter公司;UV2300紫外分光光度計上海天美科學儀器有限公司;Savant Modulyod冷凍干燥器美國Thermo公司;SW-TJ 水平流凈化工作臺蘇州市凈化設備總廠;自動部分收集器上海嘉鵬科技有限公司;HL-2B 恒流泵上海精科實業有限公司;酶聯免疫檢測儀Sunrise 公司;MCO-17AC CO2培養箱，MDF-382E 超低溫冰箱日本Sanyo公司;CK41倒置顯微鏡Olympus公司;超濾杯MS300、超濾膜上海摩速科學器材有限公司;LDZX-40BI 自動高壓滅菌鍋上海申安醫療器械廠;DHG-9075A電熱恒溫鼓風干燥箱上海益恒實驗儀器有限公司;UItraFleXtreme基質輔助激光解吸電離串聯飛行時間質譜儀德國BRUKER公司。

1.2實驗方法

1.2.1壇紫菜蛋白的提取反復凍融法提蛋白:準確稱取20 g壇紫菜粉末,用PBS(pH 7.2～7.8)浸泡過夜,料液比1∶20(g/mL),在-20 ℃和室溫下反復凍融6次。將獲得的溶液于溫度4 ℃,轉速為8000 r/min下離心30 min,去除沉淀獲得蛋白上清液,并迅速真空冷凍干燥。取一部分凍干的蛋白粉末采用Bio-Rad Protein Assay法測定蛋白質含量,其余放置-20 ℃冰箱中保存備用。整個實驗過程要進行避光保護。

反復凍融結合超聲波破碎法提蛋白:準確稱取20 g壇紫菜粉末,用PBS(pH7.2～7.8)浸泡過夜,料液比1∶20(g/mL),在-20 ℃和室溫下反復凍融6次,在此條件下,然后采用超聲破碎法,在450 W的超聲功率下每超聲6 s間隔9 s,共超聲100次將壇紫菜細胞壁破碎,使得蛋白質游離出來。為了防止超聲過程中產生的熱量使蛋白質變性,將樣品置于冰浴中。最后,將獲得的溶液于溫度4 ℃,轉速為8000 r/min下離心30 min,去除沉淀獲得蛋白上清液,并迅速真空冷凍干燥。取一部分凍干的蛋白粉末采用Bio-Rad Protein Assay法測定蛋白質含量,其余放置-20 ℃冰箱中保存備用。整個實驗過程要進行避光保護。

蛋白質含量和蛋白質提取率計算公式:

蛋白質含量(%)=標準曲線上查得的濃度×初始蛋白溶液體積/樣品重×100

式(1)

蛋白質提取率(%)=提取液中蛋白質含量/被提取壇紫菜中蛋白質含量×100

式(2)

1.2.2壇紫菜酶解物的制備稱取6 g的粗蛋白,配制濃度為2%的壇紫菜蛋白溶液,調節酶解溫度55 ℃、pH6.5、酶底比([E/S])4%[14-15]后,加入木瓜蛋白酶進行水解,實驗過程中以0.1 mol/L NaOH和HCl隨時控制體系pH,水解過程中pH控制在pH±0.05之內。水解8 h后,95 ℃水浴滅酶10 min,室溫冷卻后將水解液在8000 r/min下離心30 min,取部分上清液,采用甲醛滴定法[16]法測定水解度,其他部分迅速超濾。

1.2.3多肽的分離純化

1.2.3.1超濾將得到的酶解液,分別用10、5、3 ku的超濾組件進行超濾,超濾壓強小于0.25 MPa,進而得到10 ku以上,5～10,3～5 ku和3 ku以下四個分子量的組份,分別收集并迅速冷凍干燥[17]。

1.2.3.2凝膠層析層析柱填料是Sephadex G-15凝膠[18],柱體積180 mL,上樣量150 mg,上樣濃度50 mg/mL,流速0.35 mL/min,流動相為超純水,使用自動分布收集器,每7 min收集一管。用紫外分光光度計分別在215 nm和280 nm下測定吸光度值,收集各組份冷凍干燥后備用。

1.2.4體外抗腫瘤實驗使用MTT比色法[19]測定分離純化后的多肽組份對人乳腺癌細胞(MCF-7)和人肝癌細胞(HepG-2)的抑制作用。選擇活力較好的對數期細胞,加入胰酶消化,加入3 mL培養基制成細胞懸液。用血球計數板計數,調整細胞懸液濃度為5×104個/mL,接種于96孔板中,每孔加入100 μL細胞懸液,放置于37 ℃恒溫培養箱中,培養24 h,待細胞貼壁,吸出細胞培養液,加入200 μL含有不同多肽濃度的DMEM培養液,陰性對照是DMEM,陽性對照是5-氟尿嘧啶,平行3次。放入37 ℃恒溫培養基中,培養48 h,取出孔板,吸出藥液,使用PBS洗板兩次,每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL和DMEM培養液180 μL,放入培養箱繼續培養4 h,吸出MTT溶液,每孔加入150 μL DMSO震蕩15 min,在490 nm下測定OD值。

癌細胞生長抑制率(%)=(OD對照-OD空白)-(OD給藥-OD空白)/(OD對照-OD空白)×100

1.2.5MALDI-TOF質譜數據的分析用超純水溶解多肽樣品,使其濃度為1 mg/mL用于分析。取多肽液點AnchorChip靶,晾干,取基質點在晾干的樣品上,再對應點上標準品后,使用MALDI-TOF質譜儀進行分析。質譜儀分析參數為:Smartbeam固體激光器,頻率為1000 Hz,波長為355 nm;flexControl軟件采集數據:反射模式,離子源加速電壓1為25 kv,加速電壓2為22.55 kv,離子延遲提取80 ns,并用標準品作為外標校正質譜峰,正離子譜測定,測定范圍控制在700～3500,獲得樣品的肽質量指紋圖譜,胰酶自降解峰和污染物質的峰自動剔除。接著利用LIFT軟件將選擇的峰進行串級質譜分析。

1.2.6壇紫菜總氮含量的測定將壇紫菜餅打成粉末,過40目篩,取一定量的壇紫菜粉末,根據國標GB/T5009.5-2003,用凱氏定氮法測定壇紫菜粉末中的總氮含量。

1.2.7統計分析采用 SPSS 19.0軟件進行分析統計,數據采用平均數±標準差(x±s)表示,進行t檢驗。IC50值采用Origin8.0軟件中非線性擬合得出。

2　結果與討論

2.1蛋白質提取率

通過凱氏定氮法測得壇紫菜蛋白質含量是29.37%,Bio-Rad Protein Assay方法測定提取的壇紫菜蛋白質含量的標準曲線如圖1所示。

圖1　蛋白質標準曲線Fig.1　The standard curve of Bio-Rad Protein Assay

測得蛋白質標準曲線為:Y=0.4302X+0.0177,R2=0.9946

經(1)、(2)公式計算,反復凍融法所得蛋白質提取率是25.58%,蛋白質含量是40.75%,反復凍融與超聲破碎法所得蛋白質提取率是40.39%,蛋白質含量是48.66%。由此可見,反復凍融與超聲波破碎相結合的方法蛋白提取率和蛋白質含量均大于單獨使用反復凍融法,說明反復凍融結合超聲波破碎法能使壇紫菜細胞破碎得更加徹底,釋放出更多的蛋白質。

2.2超濾后所得各分子量酶解肽的抗腫瘤活性測定

木瓜蛋白酶酶解后的產物依次使用10,5，3 ku的超濾膜進行超濾,分別得到大于10,5～10，0～3 ku三個分子量范圍的酶解物(由于酶解程度和樣品的緣故,酶解物超濾后沒有得到3～5 ku的組份),并迅速低溫冷凍干燥。通過MTT法分析1 mg/mL的各分子量的水解產物對乳腺癌(MCF-7)和肝癌細胞(HepG-2)的抑制作用。

從圖2和圖3中可以看出木瓜蛋白酶不同分子量的酶解物對兩種癌細胞均有顯著的抑制作用,抑制率普遍在80%以上。其中,10 ku以上組份對HepG-2的抑制作用最強,抑制率高達96.35%,0～3 ku的多肽組分對MCF-7的抑制作用最強,抑制率高達90.6%。此外,相同濃度下同種組份對不同的癌細胞的抑制作用也不相同,如10 ku以上組分對MCF-7的抑制率是79.5%,明顯低于其對HepG-2的抑制率96.35%,說明組分對癌細胞的增殖有一定的選擇抑制作用。考慮到多肽的分子量范圍和對兩種癌細胞的抑制程度,選擇0～3 ku的組份(設為組份P)進行下一步的分離純化及抗腫瘤活性的檢測。

圖2　不同分子量酶解液對人乳腺癌細胞 (MCF-7)體外生長抑制作用Fig.2　Growth inhibition to MCF-7 in vitro of different hydrolyzates

圖3　不同分子量酶解液對人肝癌細胞 (HepG-2)體外生長抑制作用Fig.3　Growth inhibition to HepG-2 in vitro of different hydrolyzates

2.3Sephadex G-15色譜柱層析及抗腫瘤活性的測定

由圖4可以看出組份P分離純化時,在280 nm檢測波長下分離效果較好,故按280 nm檢測結果收集分離產物為3部分,設為P1、P2和P3,將這三個組份冷凍干燥后,得到P1 20.6 mg,P2 12.8 mg和P3 6.7 mg,分別鑒定三個組份(500 μg/mL)對腫瘤細胞MCF-7和HepG-2以及人體正常肝細胞LO2的體外抑制作用,5-氟尿嘧啶為陽性對照,結果見圖5。

表1　P2、P3和5-氟尿嘧啶(陽性對照)對兩種癌細胞的抑制效果Table 1　In vitro anti-proliferation effects of P2,P3 and 5-Fluorouracil in two kinds of cell ±s,n=3)(%)

注:樣品組的組間比較采用字母標示法,其中不同字母表示差異性顯著(p<0.05),相同字母表示差異性不顯著,具有統計學意義。

圖4　木瓜蛋白酶酶解物0～3 ku超濾組分的洗脫曲線Fig.4　The elution curve of hydrolysates 0～3 ku of Papain

圖5　木瓜蛋白酶酶解物不同組分對MCF-7、 HepG-2和LO2的體外生長抑制作用Fig.5　Growth inhibition to MCF-7,HepG-2 and LO2 in vitro of different Papain hydrolyzates

從圖5中可以看出,P2對人乳腺癌(MCF-7)和人肝癌細胞(HepG-2)的抑制率較高,分別是83.63%和87.89%,P3對人肝癌細胞(HepG-2)的抑制作用較高,抑制率達79.12%,并且P2、P3對正常肝細胞LO2的抑制率分別是29.70%和16.77%,顯著低于陽性對照的78.33%,說明P2、P3的安全性較好。將P2、P3和陽性對照5-氟尿嘧啶分別配成500、400、300、200、100、50 μg/mL,對兩種細胞做濃度梯度實驗(見表2～表4),求得各組的IC50值(見表5)。

從表2到5中可以看出P2組份對MCF-7和HepG-2均有較強的抑制作用,其抑制作用在50～500 μg/mL的梯度濃度內有一定劑量關系,即隨樣品濃度的增大,抑制作用增強,其相應的IC50值均顯著低于陽性對照的IC50值,細胞毒性小,抗腫瘤活性顯著。P3組份對HepG-2的IC50值是209.09 μg/mL,雖然其抗腫瘤活性低于陽性對照(IC50值122.72 μg/mL),但由圖5可知,P3在500 μg/mL下對正常肝細胞LO2的抑制作用是16.77%,約是同濃度下P2細胞毒性的二分之一,顯著低于陽性對照的78.33%,說明其安全性可靠,在50～500 μg/mL的梯度濃度內也呈劑量依賴關系,也可表現出一定的選擇性抑制作用。

表2　各組份IC50值Table 2　The IC50 Value(μg/mL)of different components

2.4MALDI-TOF質譜數據的分析結果

根據2.3的實驗結果,選擇抗腫瘤活性較好的組份P2和P3進行一級質譜的鑒定。P2的一級質譜圖如圖6所示。P2中包含質荷比為957.478,1070.553,1092.538,1745.866和1846.855的五個信號響應值,其具體信息見表3。由表可知,在P2中主要含有5個多肽,其峰面積大小依次1092.538>1745.866>957.478>1846.855>1070.553。

圖6　P2的一級質譜Fig.6　The MS data of P2

表3　5個多肽的質譜數據Table 3　The MS data of peptides from P2

表4　11個多肽的質譜數據Table 4　The MS data of peptides from P3

P3的一級質譜圖如圖7所示。在P3中主要含有11個多肽,其具體信息見表4。由表可知,P3中的成分較為復雜,其中質荷比為820.393、1046.555和1153.605的三個多肽的峰面積占總峰面積的百分比依次是20.58%、21.5%和12.28%,共占54.36%,其余多肽峰面積百分比較小,信號值較弱。

圖7　P3的一級質譜Fig.7　The MS data of P3

3　結論

本研究以壇紫菜為原料,采用反復凍融和超聲波破碎結合的方法提蛋白,使用木瓜蛋白酶進行酶解。酶解物超濾后共得到3個組份,結合癌細胞的體外抑制實驗(MTT)對這3個組份進行篩選,篩選得到木瓜蛋白酶酶解物0～3 ku的組份(設為P)的抗腫瘤活性最優,當其濃度在1 mg/mL時,對MCF-7和HepG-2的抑制率分別是90.6%和90.05%。組份P經過葡聚糖凝膠柱Sephadex G-15分離純化得到的組份P2,經MALDI-TOF-MS鑒定包含5個多肽,對MCF-7和HepG-2的IC50值分別是63.64 μg/mL和59.09 μg/mL,均低于陽性對照,抗腫瘤活性顯著,組份P3,經MALDI-TOF-MS鑒定包含11個多肽,對HepG-2的IC50值是209.09 μg/mL,細胞毒性小,安全性高,對HepG-2有一定的選擇性抑制作用。本研究對壇紫菜抗癌藥物的開發提供了一定的理論基礎,但是對多肽結構的鑒定和機理的研究還不夠深入,有待于進一步分析,以充分開發其藥用價值。

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Study on the anti-tumor activity of papain hydrolysis peptides derived fromPorphyrahaitanesis

BAI Lu,FAN Xiao-dan,ZHANG Xue-wu*

(College of Food Science and Technology,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

Porphyrahaitanesisis an important economic algae with abundant nutrition.To explore the anti-tumor peptides fromPorphyrahaitanesis,the protein extracted with coalition of repeated freeing and melting and ultrasonic-extraction were hydrolyzed by papain.The obtained proteolytic peptides were separated and purified by ultrafiltration,Sephadex G-15 and MALDI-TOF-MS,the whole process was guided by MTT method.Results showed that the component P2 which contained 5 peptides purified from papain hydrolysates(called P,molecular weight 0～3 ku)had a strong anti-proliferation effect on both MCF-7 and HepG-2 cells,the IC50were 63.64 μg/mL and 59.09 μg/mL,respectively,both which were superior to the positive control 5-fluorouracil(IC50of MCF-7 and HepG-2 were 195.45 μg/mL and 122.72 μg/mL,respectively).While the component P3 which contained 11 peptides also had a certain selective anti-proliferation effect on HepG-2 cells with an IC50of 209.09 μg/mL.

Porphyrahaitanesis;enzymatic hydrolysis;peptide;anti-tumor;activity

2015-11-16

白露(1990-)，女，碩士，主要從事抗腫瘤功能食品的研究，E-mail:bailuhr1990@126.com。

張學武(1963-)，男，博士，教授，主要從事抗腫瘤功能食品的研究，E-mail:snow_dance@sina.com。

廣東省省級科技計劃項目(2014A020208017)；廣東省海洋漁業科技推廣專項科技攻關與研發項目(A201301B04)。

TS254.1

A

1002-0306(2016)09-0352-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.09.061