金屬硫蛋白表達在C57BL/6J小鼠肝細胞癌發生中的變化及意義

易　旭， 龍　黎， 程明亮

(1．貴陽中醫學院第二附屬醫院中心實驗室，貴州 貴陽　550002；2．貴州醫科大學附屬醫院感染科，貴州 貴陽　550004)

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金屬硫蛋白表達在C57BL/6J小鼠肝細胞癌發生中的變化及意義

易旭1， 龍黎2， 程明亮2

(1．貴陽中醫學院第二附屬醫院中心實驗室，貴州 貴陽550002；2．貴州醫科大學附屬醫院感染科，貴州 貴陽550004)

目的了解金屬硫蛋白(MTs)基因表達水平在小鼠肝細胞癌(HCC)發生過程中的動態變化及其規律，探討MTs在HCC發生中的重要意義。方法將125只5～8周齡雄性C57BL/6J小鼠隨機分為正常對照組和HCC模型組。模型組小鼠于第1、2周分別腹腔注射一次二乙基亞硝胺(100 mg/kg，50 mg/kg)，第3周起灌胃給予乙醇(53%，5 mL/kg，5 d/周)，直至35周；正常組始終給予等量滅菌自來水灌胃。分別于實驗1、3、9、13、24及35周末處死小鼠，收集肝組織樣本并計算肝臟指數。采用組織病理學HE、Masson及網狀纖維染色檢測肝組織損傷及HCC發生情況，采用酶聯免疫吸附法檢測肝組織勻漿丙二醛( MDA)的活性；采用實時熒光定量PCR分析MTs轉錄水平。結果模型組小鼠可見進行性的肝臟病變，35周末時，肝臟質地顯著變硬，表面可見大小不等結節形成，約50%小鼠可見肝細胞異常核分裂像和異常的肝板結構等HCC發生病理改變，具有顯著增加的肝臟指數；不同時段均表現出增加的MDA活性；實驗13周前各時段具有顯著增加的MTs mRNA水平，24周后可見III級纖維化形成，且MTs mRNA水平顯著下降，甚至低于正常水平。結論小鼠肝組織MTs mRNA水平從損傷初期的顯著增加直至顯著纖維化后的低表達變化，表明MTs表達下調與HCC發生有關。

肝細胞癌；金屬硫蛋白；基因表達；小鼠

金屬硫蛋白(metallothioneins, MTs)是一小分子量、富含半胱氨酸的重金屬結合蛋白，其抗氧化能力在動脈粥樣硬化、心肌保護、腦缺血再灌注損傷及肝毒性等多種生理及病理過程中具有重要意義[1-3]。研究認為，MTs在包括上皮及葉間來源的多種腫瘤中呈現上調表達，且與腫瘤的侵襲能力及較差的預后密切相關，但在胃腸道腫瘤和肝細胞癌(HCC)中的研究數據卻得出相反的結論，即具有下調的，甚至低于正常水平的MTs水平[4-6]。由于大量研究表明了氧化應激和HCC惡性轉化的相關性[7]，因此，為了進一步明確肝臟MTs這一重要抗氧化劑的表達水平與HCC發生的關系，本文參考文獻[8]，以遺傳毒物二乙基亞硝胺為引發劑，乙醇為促進劑制備C57BL/6J雄性小鼠HCC發生模型，在不同處理時段動態檢測肝組織MTs基因表達水平，探討其變化規律，以期為HCC的防治提供有意義的實驗室依據。現報告如下：

1　材料和方法

1.1實驗動物

選擇SPF級雄性C57BL/6J小鼠125只，5～8周，體重(21±2)g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供(動物質量許可證號：SCXK (京)2009-0004)。飼養于貴州醫科大學實驗動物中心帶有IVC系統的飼養房內，使用許可證號為SYXK(黔)2012-0001，SPF級小鼠用飼料喂養，自由飲用滅菌自來水，恒溫(20～23)℃。

1.2試劑

二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine，美國Sigma, N0756)；無水乙醇(20110714，國藥集團化學試劑有限公司，分析純AR)；丙二醛ELISA試劑盒(JK10167，美國BD)；離心柱型總RNA提取試劑盒(L1126，北京天根)；離心柱型RNA純化試劑盒(K0011，北京天根)；逆轉錄試劑盒(00135397，美國Thermo Scientific)；2× SYBR Green Mix (1210，美國Biomiga)；β-actin、MT-1及MT-2引物由上海基康生物技術有限公司合成；

1.3實驗動物分組及處理

健康雄性C57BL/6J小鼠125只，適應性喂養7 d后，將小鼠隨機分成正常對照組(60只)和模型組(65只)。模型組小鼠于實驗第1、2周分別腹腔注射一次二乙基亞硝胺(100 mg/kg，50 mg/kg)，第3周起灌胃給予乙醇(53%，5 mL/kg，5 d/周)，直至35周。正常對照組小鼠始終灌胃給予滅菌自來水。

1.4檢測指標和檢測方法

1.4.1標本采集與組織病理學檢測：小鼠經戊巴比妥鈉麻醉后，分別于實驗1、3、9、13、24及35周末觀察、收集肝組織樣本并計算肝臟指數(肝臟指數=肝臟濕重/體重 × 100%)；病理學檢測用肝組織置于4%中性甲醛內固定24～48 h后，常規石蠟包埋，制成4 μm切片，行HE、Masson及網狀纖維染色，鏡下觀察肝組織病理學變化(HCC發生組織學判斷以國際癌癥研究機構出版的嚙齒類動物腫瘤標準進行[9]，由貴州醫科大學病理學教研室協助完成)。1.4.2肝組織勻漿丙二醛的含量(nmol/mg)測定：分別制備各階段兩組小鼠肝組織混合樣本0.5～0.8 g，置于預冷的1 mL生理鹽水中，玻璃勻漿器手工勻漿，4 000 r/min，離心10～15 min，取上清液，稀釋100倍后參考試劑盒說明書以雙抗體夾心法檢測勻漿中丙二醛的活性。

1.4.3肝組織MT-1、MT-2基因mRNA水平：提取、純化各時段小鼠肝組織總RNA，運用變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外吸收測定法對RNA質量進行檢測；以1 μg總RNA于10 μL逆轉錄體系中進行逆轉錄；cDNA產物4倍稀釋后進行實時熒光定量PCR檢測，設置實時定量PCR程序：50℃ 2 min(1個循環)，95℃ 10 min(1個循環)，95℃ 15 s，60℃ 1 min(40個循環)。目的基因Ct值經同一樣本的內參基因校正后計算各組間每個基因的ΔΔCt，通過2-ΔΔCt計算組間對應基因的表達差異。β-actin、MT-1及MT-2基因引物序列如下：MT-1 F5′-AATGTGCCCAGGGCTGTGT-3′，R5′- GCTGGGTT GGTCCGATACTATT-3′；MT-2 F5′-TGTGCCTCC GATGGATCCT-3′，R5′-GCAGCCCTGGGAGCACTT-3′；β-actin F 5′-GGCCAACCGTGAAAAGATGA-3′，R5′- CAGCCTGGATGGCTACGTACA-3′。

1.5統計學方法

2　結果

2.1小鼠肝臟解剖與鏡下病理學觀察

35周后，正常組小鼠無肉眼可見的病理改變。模型組小鼠肝臟外觀呈黃褐色，腫脹、質地變硬且表面形成大小不等結節(最大直徑可達到0.5～1.0 cm)(圖1)。運用H&E、Masson和網狀纖維染色鏡檢發現，實驗1周后，肝細胞明顯水腫，3周后可見較多點灶狀壞死，炎性細胞浸潤(圖2 A，B)；9周后可見肝細胞氣球樣變、脂肪變性，部分肝組織可見輕度(I級)的纖維化形成(圖2 C)；13周后可見明顯的碎片狀壞死，II級纖維化形成(圖2 D)；24周時見顯著的橋接壞死、亞大塊壞死與密集的非典型增生，III級纖維化形成(圖2 E)；35周末可見異常核分裂像、異常的肝板結構(肝板數量增加≥3層)等肝細胞癌病理改變，伴有大量炎性細胞浸潤、纖維間隔及假小葉形成(圖2 F)。

2.2肝臟指數及肝組織勻漿MDA水平

處理35周后，與正常組比較，模型組小鼠肝臟顯示顯著增加的肝臟指數(P<0.01)；在觀察的6個時段，模型組均呈現比正常組顯著增加的肝組織MDA水平(P<0.01)(表1)。

注：與正常組比較，aP<0.01。

Note.aP<0.01, compared with the control group.

注：A：正常組；B：模型組圖1　35周末正常組與模型組小鼠肝臟大體觀(箭頭示腫瘤結節)Note. A: Control group; B: Model groupFig.1　Representative images of the mouse livers at 35-week (arrows indicate the tumor nodules)

注：A、B、C、D、E、F、分別為處理1、3、9、13、24及35周末時肝組織鏡下觀(箭頭示肝組織病理改變)。圖2　不同時段小鼠肝組織H&E、Masson及網狀纖維染色鏡下觀(標尺=100 μm/50 μm)Note. A-F: Light microscopy of mice liver at 1 ,3, 9, 13, 24 and 35 weeks, respectively (arrows indicate the pathological changes of liver).Fig.2　Pathological changes of the liver in mice. H&E, Masson and reticular fiber staining. (Bar=100 μm/50 μm)

2.3肝組織MT-1、MT-2 mRNA水平

正常組小鼠在不同時段間具有相似的肝組織MT-1或MT-2 mRNA表達水平；實驗1、3、9及13周末，模型組小鼠均顯示比正常組顯著增加的MT-1 mRNA表達水平(P<0.01)，且隨病程進展逐漸降低；實驗24及35周末，模型組小鼠肝組織MT-1的mRNA水平均顯著低于正常組小鼠(P<0.01)；MT-2 mRNA表達水平于實驗13周末時與正常組相似，24周后也顯著低于正常組小鼠(表2)。

表2　不同時段小鼠肝組織MT-1、MT-2 mRNA表達水平分析

注：與正常組比較，aP<0.01

Note.aP<0.01, compared with the control group.

3　討論

肝細胞癌(HCC)是世界范圍內第5位最常見和第3位引起癌癥相關死亡的惡性腫瘤，治療選擇非常局限[10]。許多研究證實了人類多種腫瘤中同時具有增加的MTs表達，如乳腺癌、腎癌、肺癌、鼻咽癌、卵巢癌、前列腺癌、唾液腺癌、睪丸癌和膀胱癌等[6]，但也發現MTs的表達并不常見于所有人類腫瘤，如HCC[3,4]。運用DEN誘導的C57BL/6J小鼠HCC模型，Jharna D等[5]發現MT的表達在HCC組織中顯著減少甚至缺乏，一致地，運用HCC臨床樣本，發現癌組織中MT表達亦顯著低于相應的鄰近正常肝組織。Park Y等[11]也發現，MT-1、MT-2人HCC癌組織細胞核和細胞質MT-1、MT-2表達的丟失比鄰近癌旁組織顯著，多元變量分析揭示MT-1、MT-2表達的減弱是無復發生存和總生存率的獨立預后不良因素。研究表明[12]，MTs敲除鼠(MTKO鼠)顯示了更高的超氧化物陰離子水平，MTs的缺失通過活化NF-κB靶基因促進DEN誘導的肝癌形成。上述研究結果均提示MTs下調可能與肝癌的發生密切相關，因此，有必要了解HCC發生過程中MTs表達水平的變化，進一步證實其與HCC發生的相關性。基于上述研究設想，本文通過制備HCC發生動態小鼠動物模型，了解了不同時段肝組織MTs基因的轉錄水平。

基于酒精相關性肝癌形成的機制及HCC化學誘導模型制備的原理，本文參考文獻方法[8]，采用化學誘導二步法制備小鼠HCC發生模型，以遺傳毒物二乙基亞硝胺(DEN)為引發劑，乙醇為促進劑。該誘導方法的優勢在于對肝臟的損傷-纖維化-惡性轉變周期同人類HCC的發生高度相似[13]。研究表明，HCC的發生除與誘導劑及濃度有關外，還與性別、年齡和鼠種類有關[5]。Brandon-Warner等研究了乙醇對HCC發生的影響，發現慢性乙醇喂養能協同DEN明顯增加雄性小鼠腫瘤的發生[14]。基于上述研究背景，本文選擇雄性C57BL/6J小鼠作為實驗用動物。結果發現，乙醇 + DEN處理35周，顯著誘導了小鼠肉眼可見的肝臟病變及鏡下進行性的肝臟損傷、癌前病變甚至典型的HCC發生等病理改變；同時，通過對不同時段肝組織脂質過氧化物的檢測也揭示了模型組小鼠始終增加的肝臟丙二醛含量。

基于氧化應激在DEN及酒精相關性肝細胞癌形成中的重要作用，以及過多自由基形成和MTs缺失或減弱促進肝癌形成的理論基礎[7,15,16]，從抗氧化應激角度探討MTs水平動態變化與HCC發生的相關性具有重要的毒理學與臨床意義。在哺乳動物中，MTs包括4種亞型(MT1-MT4)，其中MT-1和MT-2幾乎存在于所有類型軟組織，能夠被多種刺激，包括金屬離子、細胞因子、生長因子和氧化應激等活化，呈數倍增加，從而保護細胞抗細胞毒性、輻射和DNA損傷[17,18]。Klaassen等[19]認為，肝臟MTs的誘導是一影響對肝臟毒性結果發生發展的重要適應性機制。運用MTs過表達的轉染鼠或MTs裸鼠的研究也強有力地顯示了不同氧化應激條件下MTs的抗氧化損傷保護，如阿霉素心臟毒性、缺血-再灌注、糖尿病和酒精消費等[1]。本文對不同時段小鼠肝組織MT-1、MT-2基因轉錄水平的分析發現，在誘導早期，即出現肝細胞壞死、急性炎癥病理表現時，小鼠產生非常顯著的MTs轉錄水平，尤其MT-1。隨著誘導的進行，肝臟出現中重度纖維化，此時肝組織MTs表達水平亦顯著下降，甚至低于正常水平。結果顯示小鼠肝組織MTs基因表達水平呈現一定的變化與規律性，總的趨勢表現為與肝臟損傷程度呈負相關，即從損傷初期的顯著增加直至纖維化形成后的低表達。表明隨著肝臟損傷因素的持續，肝組織應激性增加MTs轉錄的能力逐漸減弱甚至喪失，從而失去了其對肝臟損傷的保護。因此，本文結果進一步提示MTs在不同病理時段的表達差異性表明了其在肝細胞惡性轉化中的潛在作用。由于大量的研究認為增加抗氧化劑的運用可降低癌癥的發生率[20]，故設想若早期刺激肝組織中MTs合成或外源補充MTs也許是阻止HCC發生發展的一個重要策略。綜合目前國內外的研究，尚未有關不同病因所致HCC過程中MT表達情況的報道，因此，本文也是首先初步探討了MT表達動態變化與酒精相關性肝癌發生的相關性，對于其他病因所致的HCC，尤其是乙型肝炎病毒/丙型肝炎病毒相關性HCC，其發生過程中MT表達的變化將是我們下一步努力探討的方向。

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Changes and significance of metallothionein expression during hepatocarcinogenesis in C57BL/6J mice

YI Xu1, LONG Li2, CHENG Ming-liang2

(1．Central Laboratory, Second Hospital Affiliated to Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002, China;2. Department of Infectious Diseases, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550004, China)

ObjectiveTo investigate the dynamic changes of metallothionein(MTs)gene expression and explore the important significance of MTs during hepatocarcinogenesis. Methods One hundred and twenty-five SPF 5-8-week old male C57BL/6J mice were randomly divided into control group and model group. Diethylnitrosamine (DEN) was given to the mice at a dose of 100 mg/kg, ip, and 50 mg/kg, ip, in the first and next week, respectively. The mice were given ethanol (53%, 5 mL/kg/day, 5 days/week) from the third week of experiment till 35 weeks. At 1, 3, 9, 13, 24 and 35 weeks of the experiment, liver samples were taken for histopathological examination of liver damages and incidence of HCC. The liver index and malondialdehyde (MDA) of liver homogenate were determined. All liver tissue samples were examined by histopathology using hematoxylin and eosin (HE), Masson and reticular fiber staining. Real-time RT-PCR was used to analyze the mRNA expression level of liver metallothionein-1/2 (MT-1/2) in different periods. ResultsProgressive liver damages in model group mice were identified in different periods. Hepatocytes abnormal tission and abnormal liver plate structure, architecture often characteristic of HCC could be seen in approximately 50% of mice at 35 weeks. In addition to these, a higher liver index also were seen at 35 weeks. Increased MDA levels in the mouse liver tissues were observed in each stage. Real-time RT-PCR analysis showed that significantly increased transcription of MT-1 and MT-2 at 1, 3 and 9 weeks, then gradually declined and even below the normal level. ConclusionsMTs gene expression levels in mouse liver tissues are changed from significantly increased in the early stage of injury to decreased expression combined with distinct fibrosis. Our findings further demonstrate that the down-regulation of MTs level is closely correlated with hepatocarcinogenesis.

Hepatocellular carcinoma; Carcinogenesis; Metallothionein; Gene expression; Mice

國家重點基礎研究發展計劃(973計劃前期專項)(2011CB512114)。

易旭(1976-)，女，研究方向：肝病的基礎研究。 E-mail: yixu2013@yeah.net。

程明亮(1956-)，男，研究方向：肝病的防治基礎與臨床研究，E-mail: mlcheng@yeah.net。

研究報告

R-33

A

1671-7856(2016) 08-0053-06

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.08.008

2016-03-28