西瓜不同類型樣品的DNA提取研究

王吉明，尚建立，李 娜，馬雙武，徐永陽

（中國農業科學院鄭州果樹研究所 鄭州 450009）

DNA是遺傳物質的重要信息載體，DNA提取的數量及質量與PCR擴增、限制性酶切、Southern雜交、測序等分子生物學研究密切相關[1]。在西瓜研究中通常從真葉中提取DNA[2-4]，以滿足SSR、SRAP等分子標記的需求。西瓜種子是最常見和易獲得的樣品材料之一，但很少直接用于DNA提取，僅國外有從西瓜種子中提取DNA的報道[5]。在實際研究和工作中為了提高效率，可能需要對現有的特定類型西瓜樣品進行DNA提取，如進行種子純度分子標記檢測時，若能從種子樣品中提取DNA，而不必播種育苗后從真葉提取DNA，可以縮短鑒定時間1周以上，對于快速實現種子純度檢測具有重要意義。為此筆者以西瓜種子、下胚軸、子葉、種芽（下胚軸+子葉）、新鮮真葉和干燥真葉6種不同類型樣品為試驗材料，比較不同類型樣品的DNA提取數量和質量，并對提取的DNA進行dCAPS擴增和酶切，判斷不同類型西瓜樣品中提取的DNA在分子生物學研究中的應用價值，為合理利用西瓜樣品材料提供研究依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2016年3—7月在中國農業科學院鄭州果樹研究所進行，以來自國家西瓜甜瓜中期庫的西瓜種質資源父本‘14CB11’（感枯萎病）、母本‘Sugarlee’（抗枯萎病）及雜交F1為研究材料，種子經過25℃清水浸種24 h后用棉布包裹，于32℃條件下恒溫催芽48 h，然后播種于營養缽中育苗，取催芽前備份的單粒種子，以及催芽或育苗后的下胚軸、種芽（下胚軸+子葉）、子葉、新鮮真葉各0.05 g為材料，另取0.05 g新鮮真葉置于國家西瓜甜瓜中期庫種質保存冷庫中（5℃，40%相對濕度）放置72 h后脫水為干燥真葉，一起用于DNA提取研究。

1.2 DNA提取

采用天根DNA提取試劑盒［由天根生化科技（北京）有限公司生產］進行提取，提取方法參照天根DNA提取試劑盒操作說明書的操作步驟并略加改進，改進地方為將操作步驟第4步的GP2替換為預冷的0.7倍體積異丙醇，以增加DNA析出產量。

1.3 DNA檢測

采用 Nano Drop 1000（Thermo Scientific）微量紫外分光光度計對提取的DNA進行檢測，對提取DNA的含量、OD260/280值和OD260/230值進行測量和計算，同一類型樣品提取DNA的檢測結果計算平均值。

1.4 dCAPS擴增

采用2×Taq Master Mix（北京百泰客生物技術有限公司生產）進行PCR反應，反應體系為25μL，包括 2×Taq Master Mix 12.5μL，模板 DNA 2.0μL，10 μmol·μL-1上、下游混合引物 2.0 μL，ddH2O 8.5μL；擴增反應程序為94℃預變性5 min；94℃20 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s，34個循環；72℃延伸5 min；4℃保存。

dCAPS引物為國內公開發表的抗枯萎病生理小種1緊密連鎖的dCAPS標記502124_fon[6]，該標記引物信息如下：

上游引物序列為5′-AACACCACCCACTTTG?GAGCTTCG-3′，下游引物序列為 5′-TTTTAGGGT?GAAAATGGGTATTGTA-3′，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 dCAPS酶切

dCAPS產物采用內切酶Taq I進行酶切，酶切識別位點為 T’CGA，酶切體系為：10×Buffer 1.5 μL，限制內切酶1.0μL；dCAPS擴增產物5.0μL，ddH2O 7.5μL，總體系為15.0μL。酶切程序為：65℃條件下酶切16 h，80℃條件變性20 min，4℃保存，Taq I來自Fermentas公司。

1.6 電泳

擴增/酶切產物采用8.0%非變性聚丙烯酰胺電泳，280 V恒定電壓下電泳50 min，銀染染色，拍照分析，以判斷不同類型樣品中提取的DNA的dCAPS擴增和酶切效果。

dCAPS產物酶切后電泳出116 bp條帶判定為感病純合基因型，出現單條帶94 bp為抗病純合基因型，同時出現116 bp和94 bp 2條帶為抗病雜合基因型。

2 結果與分析

2.1 不同類型樣品DNA提取結果

采用改進的試劑盒提取方法均可以不同類型的西瓜樣品中提取出DNA，其中新鮮真葉和干燥真葉提取的DNA質量濃度最大，分別為 1 130.18、1 039.74 ng·μL-1，二者比較接近，表明西瓜真葉經過低溫干燥后對DNA的提取量影響不大；子葉、下胚抽、種芽稍低，質量濃度分別為434.33、406.21、428.98 ng·μL-1，而種子中提取的DNA 質量濃度最低，為 55.08 ng·μL-1。

表1 不同類型西瓜樣品提取DNA的檢測結果

2.2 不同類型樣品提取DNA的dCAPS擴增及酶切

全部樣品中提取的DNA均可擴增出條帶，電泳背景干凈，條帶清晰，大小在116 bp附近，與該引物開發的信息相符，表明采用改進的DNA試劑盒提取方法從西瓜種子、子葉、下胚軸、種芽、新鮮真葉和干燥真葉提取的DNA可以滿足dCAPS擴增的需求，提取的DNA樣品中殘留的RNA和鹽分對dCAPS擴增沒有明顯的影響（圖1）。

酶切結果表明，感病母本的dCAPS擴增產物被酶切成94 bp，抗病父本的dCAPS擴增產物未被酶切，而雜交1代擴增產物出現了94 bp和116 bp的共顯性條帶，各類型樣品提取的DNA擴增產物酶切正常，酶切片段大小一致，表明不同類型樣品中提取的DNA可以滿足dCAPS酶切的需求。

圖1 西瓜不同類型樣品中提取DNA的d Caps擴增與酶切結果

3 討論與結論

筆者采用改進的DNA試劑盒提取法對西瓜種子、下胚軸、子葉、種芽、新鮮真葉和干燥真葉共6種樣品進行了DNA提取，結果表明從各樣品中均可有效提取DNA，但提取的DNA質量濃度相差比較大，如從真葉提取的DNA質量濃度在1 130 ng·μL-1左右，而從種子中提取的DNA質量濃度僅為55 ng·μL-1左右，2者相差20倍左右，出現這種情況是否與樣品中DNA含量差異或提取效率有關，有待于進一步研究。

利用種子提取 DNA 已經在棉花[7-10]、大豆[1，11-13]、玉米[14-17]、水稻[18-19]和小麥[20-21]等作物上實現，在同為葫蘆科園藝作物的甜瓜上也有從種子中提取DNA的報道[22]。西瓜種子富含氨基酸和脂肪酸[23]，可能會對DNA提取有不利影響，筆者曾采用常規的CTAB法和SDS法進行過多次提取，均無法有效提取DNA，而本研究采用改進的DNA試劑盒提取法成功地從西瓜種子中提取出DNA，表明從西瓜種子中提取DNA有較大的改進和提高的空間。

dCAPS擴增涉及錯配堿基的擴增，對DNA質量要求較高，筆者在dCAPS操作中曾發現，提取的DNA在4℃冰箱中保存一段時間后雖然能夠擴增出條帶，但擴增產物卻無法被酶切出目的條帶，筆者用改進的DNA試劑盒提取法使用了吸附柱，能夠通過吸附作用進一步去除雜質，提高DNA的質量，所提取的DNA可以滿足dCAPS擴增及酶切的需求，根據本研究結果，按照研究目的和具體的試材條件，可以選擇從種子到種芽、育苗和瓜苗生長過程中的任一樣品提取DNA用于西瓜分子生物學的研究。