一種利用堿裂解法快速篩選重組子的方法

呂　新，陳麗華，李玥仁

(福建省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所；精密儀器農業測試重點公共實驗室　350003)

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一種利用堿裂解法快速篩選重組子的方法

呂新，陳麗華，李玥仁

(福建省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所；精密儀器農業測試重點公共實驗室350003)

根據堿裂解法提取質粒DNA的原理，利用堿裂解法快速篩選到重組子，該方法快迅、準確，可應用于基因克隆中的重組菌落快迅檢測。

堿裂解法；重組子；快速；篩選

基因克隆是現代分子生物學中一種重要的技術手段。在基因克隆中，目的基因和載體在體外連接形成重組DNA質粒后，將重組DNA質粒和感受態大腸桿菌細胞相混合，使重組DNA質粒進入大腸桿菌中，實現重組DNA質粒的轉化，并在含有抗生素的LB瓊脂平板培養基上形成重組子菌落。目前，篩選重組子主要采用遺傳表型檢測法、限制性酶切法和菌落PCR法，但在實際操作中均存在不盡人意的地方。在遺傳表型檢測過程中，α互補檢測中必須加入的呈色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷(x-gal)和誘導劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)價格昂貴，大量篩選勢必增加實驗成本；限制性酶切法需對數10個菌落進行培養后提取質粒進行酶切檢測，非常費力，甚至使用限制性酶切法常找不到適合用2種或2種以上限制性內切酶的緩沖液，必須分步進行酶切反應；菌落PCR法反應易受環境污染造成假陽性，反應條件不合適易造成假陰性，且若沒有可以利用的引物，還需合成引物。鑒于上述問題，筆者在堿裂解法提取質粒DNA方法的基礎上[1]，研究出一種操作簡便、方法快速、結果可靠的重組子快速篩選方法。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株與載體pBluescriptSK(+)質粒(3.0 kb，Amp抗性)，DH5α。外源插入片段0.7 kb和1.0 kb，由福建省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所克隆完成。

1.1.2試劑與儀器試劑：Tris、EDTA、RNaseA、SDS、NaOH、溴酚藍、蔗糖。儀器：電泳儀及電源(北京六一儀器廠)。LB固體培養基、液體均按常規方法配制。

1.2方法

插入片段的連接、轉化按薩姆布魯克等[8]的方法進行，37℃倒置培養過夜，待菌落在LB平板上生長至2～3 mm時，按如下步驟操作：取8 μL懸浮液(50 mmol/L Tris pH 8.0、10 mmol/LEDTA、0.1 mg/mL RNaseA、0.1%溴酚藍)加入到1.5 mL離心管中，再在超凈臺內用10 μL槍頭隨機挑取LB平板上10個待檢測菌落，在懸浮液中用移液槍反復吹打混勻，然后加入8 μL裂解液(200 mmol/L NaOH、0.5%SDS、20%蔗糖)，輕柔吹打混勻，避免產生過多氣泡(容易變得黏稠)，室溫放置3 min，最后取10 μL裂解產物，在1%瓊脂糖凝膠上、110 V電壓下電泳30 min后，使用凝膠成像儀對瓊脂糖凝膠拍照，根據質粒DNA在瓊脂糖凝膠電泳時遷移距離的差異，判斷是否為重組子菌落。

2　結果與分析

2.1快速檢測結果分析

待檢測重組子菌落質粒DNA在瓊脂糖電泳后顯色，可觀察到4條不同電泳位置的DNA條帶，其中第2個條帶在重組菌落與非重組菌落間存在明顯的位置差異，其他3個條帶不存在位置差異。由于重組菌落帶有700 bp或1000 bp的插入片段，其質粒DNA與非重組質粒DNA片段相比較大，在相同時間的瓊脂糖電泳時遷移的速率較慢，導致2種不同質粒DNA間的位置差異(圖1、圖2)。

2.2優缺點分析

目前對于重組子菌落的篩選主要采用遺傳表型檢測法、限制性酶切法和菌落PCR法。本方法與上述3種方法比較，具有如下優點：①檢測方法迅速，只要簡單3步，可以在1 h內完成并獲得結果；②結果可靠，根據重組質粒DNA與非重組質粒DNA片段大小差異來區分，有效避免PCR法檢測出現假陽性和假陰性的問題[2]；③操作簡單，不要求特殊儀器設備，只需1個瓊脂糖電泳儀即可，一般的分子生物學研究室均具備；④成本低廉，不需要昂貴的X-gal和IPTG試劑[3-7]，可大幅減少檢測成本。

但本方法也具有一定的局限性，如插入片段必須大于200 bp，才能在1%瓊脂糖電泳時觀察到重組子質粒DNA與非重組質粒DNA之間明顯的滯后現象；無法直接判斷插入片段方向。

3　小結

本方法根據堿裂解法提取質粒DNA的原理，將待檢測重組子菌落懸浮在懸浮液，在裂解液提供的堿性環境下快速裂解待檢測菌落，并釋放質粒DNA。由于重組質粒DNA片段較大，在瓊脂糖凝膠電泳時遷移速度較慢，而非重組質粒DNA片段較小，在瓊脂糖凝膠電泳時遷移速度較快，因此可根據質粒DNA在瓊脂糖凝膠電泳時遷移距離的差異，判斷是否為重組子菌落。

懸浮液中Tris為質粒DNA釋放時提供穩定的pH緩沖環境；EDTA可以螯合重金屬離子，并抑制DNA酶活性；RNaseA可去除質粒DNA中的RNA污染；溴酚藍在電泳檢測時起條帶指示作用。裂解液中NaOH為質粒DNA釋放時提供堿性環境，同時NaOH和SDS能裂解菌體細胞壁、在細胞膜上穿孔，釋放細胞內的質粒DNA；蔗糖可增加比重，濃縮質粒DNA，使點樣后的質粒DNA能夠沉于點樣孔中。

此技術操作簡便、方法快速，能在1 h內完成待檢測菌落的檢測和判斷，且檢測過程中不需要x-gal和IPTG等昂貴試劑，結果的準確性高于PCR法，檢測時間比常規限制性酶切法大幅減少?？蓱糜诨蚩寺≈兄亟M菌落快速檢測，特別是在大量篩選重組菌落時將大幅減少篩選的時間和檢測成本。

[1]BIRNBOIM H C,DOLY J.A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA[J].Nucleic Acids Res,1979,7(6):1513-1523.

[2]田麗春，黃光瑞，陳亮，等.一種快捷可靠的大腸桿菌重組質粒篩選方法[J]. 湖北大學學報：自然科學版,2008(2):202-204.

[3]ITOH M,CARNINCI P,NAGAOKA：S,et al.Simple and rapid preparation of plasmid template by a filtration method using microtiter filter plates[J].Nucleic Acids Res，1997,25(6):1315-1316.

[4]張桂敏，劉振，李春華，等.一種簡便快速篩選重組子的方法[J].湖北大學學報：自然科學版,2005(3):280-281.

[5]崔錦，李林珂，馬向東.一種簡便快速篩選重組子的方法[J].生物技術,2005(6):46-47.

[6]羅文永，陳建偉，劉彥卓，等.快速鑒定陽性重組質粒方法的改進試驗[J].廣東農業科學,2004(2):9-10.

[7]CHOWDHURY E H,AKAIKE T.Rapid isolation of high quality， multimeric plasmid DNA using zwitterionic detergent[J].Journal of biotechnology,2005,119(4):343-347.

[8]薩姆布魯克，魯塞爾，培堂.分子克隆實驗指南[M].北京：科學出版社,2002.

(責任編輯：林蕓菁)

A rapid screening method of recombinant methods by using alkaline lysis

LV Xin, CHEN Li-hua, LI Yue-ren

(InstituteofAgriculturalQualityStandardsandTestingTechnologyofFujianAcademyofAgriculturalSciences;PrecisionInstrumentKeyPublicLaboratoryforAgricultureTest,FujianProvince350003)

According to the principle of alkaline lysis method for extracting plasmid DNA, the recombinants were rapidly screened by using the alkaline lysis method, which is quick and accurate and can be applied in rapid detection of recombinant bacterial colonies in gene cloning.

Alkaline lysis method; recombinant; fast; screening

2016-04-25

呂新，男，1980年生，助理研究員。

李玥仁，男，1966年生，研究員(E-mail:yuerenli@yeah.net)。

福建省公益類青年科研項目(2014R1025-5)。

10.13651/j.cnki.fjnykj.2016.05.005