抗咯菌腈禾谷鐮刀菌的紫外誘導及其生物學特性

賈　嬌,　蘇前富,　孟玲敏,　張　偉,　李　紅,　劉婉麗,　晉齊鳴

(吉林省農業科學院植物保護研究所, 公主嶺　136100)

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抗咯菌腈禾谷鐮刀菌的紫外誘導及其生物學特性

賈嬌,蘇前富,孟玲敏,張偉,李紅,劉婉麗,晉齊鳴*

(吉林省農業科學院植物保護研究所, 公主嶺136100)

為評估玉米莖腐病病原菌禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)對咯菌腈的室內抗藥性風險,本研究通過室內紫外照射獲得抗咯菌腈突變體,分析抗性突變體對咯菌腈的抗藥性、遺傳穩定性和生物學特性,及其對咯菌腈、戊唑醇、苯醚甲環唑、嘧菌酯的交互抗性。結果表明,經紫外照射5 min,獲得17株抗咯菌腈突變體,其對咯菌腈的EC50為72.78～290.09 μg/mL,是親本菌株的4 000～17 000倍;抗性突變頻率為1.7×10-6,可穩定遺傳;最適生長溫度均為25℃,最適pH均為8,與親本菌株相同;菌落生長速度低于親本菌株;在含有0.9 mmol/L NaCl的PDA培養基中培養的菌落形態與不含NaCl的PDA培養基中的相比,親本菌株和4號抗性菌株色素沉積減少,而1號和16號抗性菌株色素沉積增加。推測禾谷鐮刀菌對咯菌腈存在中等或高等的室內抗藥性風險。室內抗藥性測定表明抗性突變體對咯菌腈和苯醚甲環唑均產生了抗性。

咯菌腈;禾谷鐮刀菌;交互抗性

玉米莖腐病(corn stalk rot)是世界玉米產區普遍發生的一種土傳病害,一般年份發病率為10%～30%,嚴重年份發病率達到80%。它不僅造成玉米早衰、莖稈倒伏,而且其病原菌產生的真菌毒素危害人畜健康,是玉米生產上亟待研究解決的重要問題[1-2]。該病害病原較為復雜,主要由鐮刀菌(Fusariumspp.)、腐霉(Pythiumspp.)和赤霉(Gibberellaspp.)等多種病菌單一或復合侵染發生[3]。晉齊鳴、白金凱等的研究結果認為禾谷鐮刀菌是我國東北春玉米區造成該病害發生的主要致病菌[4-5]。有研究報道苯基吡咯類殺菌劑咯菌腈(fludioxonil)對禾谷鐮刀菌具有較好的抑制作用[6]。袁虹霞等[7]的研究表明,咯菌腈對花生莖腐病病原具有很高的殺菌活性;郭寧等[8]研究發現用咯菌腈做種衣劑防治玉米莖腐病也具有一定的作用;郝俊杰等[9]報道咯菌腈處理玉米種子可較好地抑制禾谷鐮刀菌的侵染。咯菌腈是先正達公司開發的一種非內吸性殺菌劑,對子囊菌、半知菌和擔子菌具有很好的防效[10],已作為農作物的拌種劑廣泛使用。已有研究報道禾谷鐮刀菌對戊唑醇、多菌靈和氰烯菌酯等化學藥劑的抗藥性具有中或高等風險[11-13],但有關禾谷鐮刀菌對咯菌腈的抗藥性風險目前未見報道。因此,本研究通過室內紫外誘導獲得禾谷鐮刀菌抗咯菌腈的突變菌株,研究抗性突變菌株的生物學特性及其對其他化學藥劑的抗性,為明確禾谷鐮刀菌對該藥劑產生的潛在抗藥性風險及應用該藥劑防治玉米莖腐病提供參考。

1　材料和方法

1.1材料

供試菌株:禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)菌株來自吉林省農業科學院植物保護研究所病蟲害綜合防治研究室。

供試藥劑:95%咯菌腈原藥,杭州宇龍化工有限公司;甲醇,北京化工廠;10%苯醚甲環唑水分散顆粒劑,先正達中國投資有限公司;60 g/L戊唑醇種子處理懸浮劑,拜爾作物科學有限公司;250 g/L嘧菌酯懸浮劑,河北威遠生物化工股份有限公司。上述化學殺菌劑中制劑用滅菌蒸餾水、原藥用甲醇分別溶解配制。

儀器:恒溫培養箱,上海一恒科學儀器有限公司;8 W紫外燈。

培養基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar,PDA):馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g,加蒸餾水至1 000 mL;CMC培養基:羧甲基纖維素鈉15 g、硝酸銨 1 g、磷酸二氫鉀 1 g、七水硫酸鎂 0.5 g、酵母提取物 1 g、瓊脂粉 15 g,加蒸餾水至1 000 mL;SNA培養基:磷酸二氫鉀 1 g、硝酸鉀1 g、七水硫酸鎂 0.5 g、氯化鉀 0.5 g、葡萄糖 0.2 g、蔗糖 0.2 g,加蒸餾水至1 000 mL;水瓊脂培養基為2%的瓊脂培養基。所有培養基均經121℃ 高壓滅菌20 min。

1.2方法

1.2.1咯菌腈對禾谷鐮刀菌的毒力測定

采用菌絲生長速率法測定咯菌腈對禾谷鐮刀菌菌絲生長的抑制作用,咯菌腈的濃度設置為:0、3、1、0.5、0.125和0.062 5 μg/mL。在禾谷鐮刀菌菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌盤,接種在含有咯菌腈的PDA培養基中央,以添加相應量甲醇為對照,25℃黑暗培養5 d,十字交叉法測量菌落直徑,每個處理重復3皿,試驗重復2次。

1.2.2禾谷鐮刀菌抗咯菌腈突變體的紫外誘導

將禾谷鐮刀菌接種在CMC培養基上,培養7 d,待其大量產生分生孢子,將培養皿蓋打開,放置在距離8W紫外燈20 cm處照射5 min,經雙層紗布過濾制備成1×107個/ mL的分生孢子懸浮液,取200 μL均勻涂布于含有0.3 μg/mL 咯菌腈的培養基上,25℃黑暗培養2 d,將萌發的抗性菌株在不含咯菌腈的PDA培養基上連續培養5代,并測定含有0.3 μg/mL 咯菌腈的培養基上生長速度較快的突變體(同1.2.1方法)對咯菌腈的敏感性,計算抗性突變頻率和抗性倍數。

抗性突變頻率=抗性突變菌株數/涂板的分生孢子總數量;

抗性倍數=抗性突變體的EC50值/親本菌株的EC50值。

1.2.3抗性遺傳穩定性測定

隨機選取5株紫外誘變獲得的抗性突變體進行測定。將5株抗性突變體在PDA培養基上繼代培養9代,25℃黑暗培養5 d,通過測量菌落直徑法測定咯菌腈對抗性菌株后代的EC50,計算其抗性倍數,并根據抗性菌株的生長速度確定其遺傳穩定性。

1.2.4抗性突變菌株的生物學特性研究

1.2.4.1溫度對抗性突變菌株的影響

選取5株能穩定遺傳的抗性突變菌株及其親本菌株,于25℃培養3 d,自菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅,接種在不含咯菌腈的PDA培養基上,分別于5、15、20、25和32℃培養箱中培養3 d,用十字交叉法測量菌落直徑,每個處理重復3次,試驗重復2次。

1.2.4.2pH對抗性突變菌株的影響

用鹽酸或氫氧化鈉溶液調節不含咯菌腈的PDA培養基的pH分別為4、6、7、8和10,分別接種直徑5 mm的預培養菌落邊緣菌餅,于25℃培養3 d后用十字交叉法測量菌落直徑,每個處理重復3次,試驗重復2次。

1.2.4.3NaCl對抗性突變菌株的影響

將直徑5 mm的咯菌腈抗藥突變體和親本菌株的菌碟接種在含0、0.1、0.3、0.7和0.9 mmol/L NaCl的PDA平板上，25℃黑暗培養5 d,測量菌落直徑,觀察菌落形態。

1.2.5抗性突變體對其他藥劑的敏感性測定

采用菌絲生長速率法,分別測定出發菌株和7株抗咯菌腈的突變菌株對戊唑醇、苯醚甲環唑和嘧菌酯的敏感性,并利用DPS軟件計算親本菌株及抗性菌株對其他藥劑的EC50。

1.3數據分析

采用DPS 7.0統計軟件進行數據處理,計算藥劑的毒力回歸方程及EC50。

2　結果與分析

2.1紫外誘導抗藥性

研究發現咯菌腈對禾谷鐮刀菌菌絲生長的抑制作用回歸方程為y=0.946+1.087x,EC50為0.016 μg/mL,EC95為0.529 μg/mL。通過紫外線誘導獲得17株抗性菌株,抗藥性分析發現抗性菌株對咯菌腈的抗性倍數為4 000～17 000倍(表1),當咯菌腈的濃度為500 μg/mL時,對抗性突變菌株的抑制率為52.2%～83.1%,表明野生型菌株經紫外線誘導可產生對咯菌腈高抗突變菌株,抗性突變頻率為1.7×10-6。

表1　紫外誘變禾谷鐮刀菌獲得的抗咯菌腈突變體

2.2抗性菌株的遺傳穩定性

由表2可知,經紫外誘導的5株抗性突變體在無藥的PDA培養基上繼代培養9代后, 第1代和第9代的菌落生長速度無明顯差異,對咯菌腈的EC50也無明顯變化,表明室內紫外誘導獲得的抗咯菌腈突變體可穩定遺傳。

表2　抗咯菌腈突變體的抗性遺傳穩定性

2.3抗性突變菌株的生物學特性

2.3.1溫度對抗性突變菌株的影響

由圖1可見,親本菌株和抗性突變菌株在不同溫度條件下培養3 d菌絲生長速率變化趨勢一致;最適溫度均為25℃;在4℃和32℃條件下,親本菌株和抗性突變菌株幾乎不能生長;在相同溫度下,抗性突變菌株菌絲生長速率均慢于親本菌株。表明抗性突變菌株對溫度的敏感性與親本菌株相同。

2.3.2pH對抗性突變菌株的影響

分析不同pH的PDA培養基對親本菌株和抗性突變菌株菌絲生長速率的影響,結果發現,親本菌株和抗性突變菌株在不同pH的PDA培養基中的生長速率變化趨勢是一致的;最適pH均為8;在相同pH的條件下,抗性突變菌株菌絲生長速率均小于親本菌株;4號突變菌株的菌絲生長速率在pH 4和6時,明顯慢于親本菌株,pH為7和8時與親本菌株相近(圖2)。表明抗性突變菌株對pH的適應性與親本菌株相似,4號突變菌株對pH的適應性略有增強。

圖1　溫度對親本菌株和抗性菌株菌絲生長的影響Fig.1　Effects of temperature on colony area of parental isolates and resistant mutants

2.3.3滲透壓對抗性突變體的影響

試驗表明,親本菌株和抗性突變體在含有高濃度NaCl的PDA培養基中生長沒有受到抑制。在0.9 mmol/L 的NaCl滲透壓條件下,親本菌株和4號抗性突變體的菌落形態無明顯變化,但1號和16號抗性突變體培養基中紅色素的沉積明顯增加。說明親本菌株和對咯菌腈抗性較低的突變體在增加滲透脅迫條件下生長受到抑制,而抗性較強的突變菌株對滲透脅迫不敏感。

圖2　pH對親本菌株和抗性突變菌株菌絲生長的影響Fig.2　Effects of pH value on colony diameter of parental isolates and resistant mutants

圖3　0.9 mmol/L的NaCl對親本菌株和抗性突變菌株菌絲生長的影響Fig.3　Effects of 0.9 mmol/L NaCl on colony diameter of parental isolates and resistant mutants

2.4禾谷鐮刀菌對其他藥劑的抗藥性

紫外誘變獲得的7株抗咯菌腈突變菌株對苯醚甲環唑的抗性明顯低于親本菌株,對戊唑醇和嘧菌酯的抗性高于親本菌株,表明紫外誘導禾谷鐮刀菌突變不僅對咯菌腈抗性增強,對嘧菌酯的抗性也增強,紫外誘導禾谷鐮刀菌突變可導致多重抗藥性發生(表3)。

3　討論

咯菌腈是一種通過抑制絲裂原活化蛋白激酶/組氨酸激酶磷酸化導致病菌死亡的殺菌劑,已廣泛應用于防治農業生產中的真菌病害[14-15]。有關該藥劑的抗藥性問題也有大量報道,如核盤菌抗性菌株對咯菌腈的抗藥性達到敏感菌株的2 000倍以上,具有較高的抗性風險[16];番茄灰霉病菌對咯菌腈的抗藥性是親本菌株的310倍以上,抗性風險較低[17];馬鈴薯早疫病菌對咯菌腈高度敏感,但不同地區的馬鈴薯早疫病菌對咯菌腈的EC50相差34.87倍[18],以上研究結果表明,不同病原菌對咯菌腈的敏感性不同,且抗性風險也不相同。本研究發現禾谷鐮刀菌對咯菌腈具有高度的敏感性,EC50僅為0.016 μg/mL,通過紫外誘導獲得17株突變體對咯菌腈表現了較強的抗藥性,表明紫外照射可誘導禾谷鐮刀菌產生對咯菌腈抗藥性增強的突變體。李恒奎等[13]研究發現紫外誘導禾谷鐮刀菌產生抗氰烯菌酯的突變體,繼代培養8代后其抗藥性可穩定遺傳;周明國等[19]研究發現禾谷鐮刀菌對多菌靈的抗性可穩定遺傳。本研究發現抗性突變體繼代培養9代對咯菌腈的抗性水平未發生明顯變化,可穩定遺傳,推測禾谷鐮刀菌若突變為抗性菌株對多種化學藥劑的抗性均可穩定遺傳。

表3　禾谷鐮刀菌抗咯菌腈突變體及其親本菌株對4種藥劑的敏感性1)

1) 表中數據為平均值±標準差。根據Duncan’s差異顯著性測定,同列中不同字母表示抗性菌株與其親本菌株之間差異顯著(P<0.05)。

Data in the table are mean±SD. Values within a column followed by different letters indicate significant variation between strains according to Duncan’s test (P<0.05).

然而美國分離的112株禾谷鐮刀菌中對咯菌腈的敏感性差異非常大,100 μg/mL的咯菌腈對抗性菌株的抑制率小于20%,且抗性菌株的致病力沒有減弱,表明在美國田地中已經存在抗咯菌腈菌株[20]。本研究經室內誘變獲得了高抗咯菌腈的突變菌株,表明禾谷鐮刀菌經紫外照射后會產生對咯菌腈抗性增強的突變菌株。然而在我國的田地中高抗咯菌腈的禾谷鐮刀菌是否已經出現尚需要采集我國不同地區的禾谷鐮刀菌進行藥劑敏感性測定。

殺菌劑的大量、連續、廣泛使用不僅會造成田間植物病原菌對其產生抗藥性[21],還會導致突變菌株對其他藥劑的抗性增強,研究報道戊唑醇與百菌清復配可增加對禾谷鐮刀菌的抑制效果;戊唑醇與多菌靈復配可破壞禾谷鐮刀菌抗性菌株細胞的滲透性[22-23]。然而關于禾谷鐮刀菌對多菌靈、戊唑醇和氰烯菌酯的抗性報道較多[11,13,19],對兩種或多種藥劑的抗性未見報道。本研究發現紫外誘導禾谷鐮刀菌突變不僅對咯菌腈抗性增強,對嘧菌酯的抗性也增強,表明紫外誘導禾谷鐮刀菌突變可導致多重抗藥性發生。潘以樓等研究發現草莓灰霉病菌對多菌靈、腐霉利和乙霉威等藥劑產生多重抗藥性[24],然而紫外照射導致禾谷鐮刀菌多重抗藥性出現的機理有待進一步研究。

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(責任編輯：田喆)

Ultraviolet induction and characteristics of Fusariumgraminearumresistant to fludioxonil

Jia Jiao,Su Qianfu,Meng Lingmin,Zhang Wei,Li Hong,Liu Wanli,Jin Qiming

(Institute of Plant Protection, Jilin Academy of Agricultural Sciences, Gongzhuling136100, China)

To assess the resistance risk ofFusariumgraminearumto fludioxonil in the laboratory, 17 UV-induced mutants resistant to fludioxonil were obtained. The resistance, stability and biological characteristics of the mutants were studied. Cross-resistance of the mutants to fludioxonil, tebuconazole, difenoconazole and azoxystrobin was tested. The results showed that EC50values of the mutants to fludioxonil ranged from 72.78 μg/mL to 290.09 μg/mL and the ratio of EC50values of mutants resistant to fludioxonil, compared with that of its parental strains, was 4 000-17 000 times. The frequency of resistance mutation was 1.7×10-6and the resistance obtained was stable. The optimum temperature for the colony growth was 25℃, and the optimum pH value was 8 for both resistant isolates and their parental strains. The growth rates of resistant mutants were lower than those of their parental strains. The pigment of parental strains and resistant isolate 4 in PDA containing 0.9 mmol/L NaCl was lower than that in PDA without NaCl, but the pigment of resistant isolates 1 and 16 was higher. Fludioxonil-resistant isolates ofF.graminearumshowed moderate or high risk and have developed resistance to azoxystrobin.

fludioxonil;Fusariumgraminearum;cross-resistance

2015-08-11

2015-10-23

國家現代農業(玉米)產業技術體系(CARS-02); 吉林省科技廳青年科技基金(20140520158JH)

E-mail: qiming1956@163.com

S 481.4

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.04.006