海南省不同寄主植物炭疽病菌侵染油茶研究

李　河,　李　楊,　蔣仕強,　萬　智,李航宇,　徐建平,　周國英

(1.中南林業科技大學林學院,經濟林培育與保護教育部重點實驗室, 長沙　410004;2.中南林業科技大學林學院,森林有害生物防控湖南省重點實驗室, 長沙　410004)

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海南省不同寄主植物炭疽病菌侵染油茶研究

李河1,2*,李楊1,2,蔣仕強1,萬智1,李航宇1,徐建平1,2,周國英1,2

(1.中南林業科技大學林學院,經濟林培育與保護教育部重點實驗室, 長沙410004;2.中南林業科技大學林學院,森林有害生物防控湖南省重點實驗室, 長沙410004)

為了明確海南省不同寄主植物炭疽病菌侵染油茶的潛力,本研究分離、鑒定海南省4個油茶林中不同寄主植物的炭疽病菌種類及其致病性。結果從油茶、葛根、山麻桿、飛機草、蒲葵、鯽魚膽、桃花心木、黃蘭、羊蹄甲、山礬、銀柴、降香黃檀和檀香等13種植物上,共獲得135株炭疽病菌,其中果生刺盤孢菌(Colletotrichumfructicola)85株、暹羅刺盤孢菌(C.siamense) 45株,盤長孢狀刺盤孢菌(C.gloeosporioides) 3株,君子蘭刺盤孢(C.cliviae)和山茶刺盤孢(C.camelliae)各1株;4個采樣地的油茶樹與葛根等當地其他12種植物具有相同的炭疽病菌C.fructicola和C.siamense,這兩種菌占總分離炭疽菌的96%;通過致病性測定,不同寄主來源的這5種炭疽菌均能引起油茶炭疽病。海南省當地多種植物的炭疽病菌是油茶的潛在侵染源。

油茶;炭疽病菌;致病性

油茶又名茶子樹、油茶樹,在海南被稱為山柚茶,主要是山茶科(Theaceae) 山茶屬(Camellia)植物中油脂含量較高且具有栽培經濟價值的一類植物的總稱,與橄欖、油棕、椰子并稱為世界四大木本油料植物。油茶是我國南方特有的重要木本食用油料樹種[1],也是海南島的傳統植物資源,在海南有野生種和栽培種分布。有別于中國其他油茶分布省區的是,海南島特有的氣候環境條件孕育了豐富而具有特色的油茶資源,所產茶籽油的口感與品質有別于內地,其價格較為昂貴[2]。油茶炭疽病在海南省發生普遍,目前的防治方法是砍除病株,修剪病枝葉等,減少病原的初始菌量。目前報道的油茶炭疽病菌有3種,分別是盤長孢狀刺盤孢菌(Colletotrichumgloeosporioides)、果生刺盤孢菌(C.fructicola)和暹羅刺盤孢菌(C.siamense);另外,我們前期對海南五指山南圣鎮油茶炭疽病菌分離鑒定,也發現該地區的炭疽病原菌主要是果生刺盤孢菌(C.fructicola),這些研究結果都與以前報道油茶炭疽病菌只是盤長孢狀刺盤孢菌(C.gloeosporioides)的結論不一致[3-5];海南地區其他寄主植物炭疽病是否與油茶炭疽病具有相同的病原菌,其他寄主植物的炭疽病菌是否也可以侵染油茶,目前尚不清楚,這給油茶炭疽病的防治帶來困難。本試驗擬對海南省油茶和其他寄主植物的炭疽病菌種類及其致病性進行研究,明確海南省不同寄主植物炭疽病菌侵染油茶的潛力,為采取有效的防治措施控制油茶炭疽病提供依據。

1　材料與方法

1.1材料

炭疽病葉樣品:油茶及其他植物炭疽病葉采自均屬熱帶氣候、林下植被豐富的海南省南圣鎮、通什鎮、楓木林場和澄邁林場4個樣地。南圣鎮與通什鎮兩地處于海南島中部偏南,相距35 km左右,采樣地通什鎮海拔約為725 m,南圣鎮海拔約為330 m。年平均溫度為20～23℃,全年降雨量為1 687～2 324 mm,土壤為山地紅壤為主,pH在4～6之間,呈酸性,土壤深厚肥沃,特別適宜種植油茶。楓木實驗林場位于海南屯昌縣楓木鎮境內,采樣地海拔150 m。因地處海南中部山區的東北部,屬“屯昌淺盆地氣候”。年平均氣溫23.4℃,年平均降雨量2 125 mm,年平均相對濕度85%,土壤為磚紅壤。澄邁林場位于海南島北部,林場地貌屬于低丘陵和緩坡地區,年平均溫度23.7℃,年降雨量1 749 mm,采樣地海拔76 m;土壤主要是紅壤,適宜種植油茶。主要包括油茶(Camelliaoleifera)、葛根(Puerariaeradix)、山麻桿(Alchorneadavidii)、飛機草(Eupatoriumodoratum)、蒲葵(Livistonachinensis)、鯽魚膽(Maesaperlarius)、桃花心木(Khayasenegalensis)、黃蘭(Micheliachampaca)、羊蹄甲(Bauhiniapurpurea)、山礬(Symplocossumuntia)、銀柴(Aporosachinensis)、降香黃檀(Dalbergiaodorifera)和檀香(Santalumalbum)等13種植物的炭疽病葉。

試劑:DNA快速提取試劑盒Fast DNA Kit,美國MPBIO公司;葡萄糖、2×TaqPCR Master Mix、天根生化科技(北京)公司。

儀器:Nikon 80I顯微鏡,NIKON儀器(上海)有限公司;快速核酸提取儀,美國MPBIO公司;5145D離心機,德國Eppendorf公司;ABI 9700 PCR儀,美國應用生物系統公司。

1.2方法

1.2.1病原菌分離、純化

病原菌分離方法參考方中達[6]的組織分離法,從病健交界處組織進行分離,于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA培養基) 純化培養后 4℃冰箱保存備用。

1.2.2病菌多基因分子鑒定

病原菌DNA 的提取:參考夏花等[7]的試驗研究。基因選擇及目的片段擴增與測序參照 Weir 等[8]的方法、反應體系及條件。對所有分離篩選獲得的菌株,選擇核糖體轉錄間隔區(internal transcribed spacers,ITS)、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(glyceralde-hyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和鈣調蛋白基因(calmodulin,CAL)進行擴增與測序。相應的PCR擴增引物見表1。PCR 產物委托上海鉑尚生物技術有限公司測序。

表1　本試驗所用引物和退火溫度

菌株多基因系統發育樹構建:將測序獲得的每個菌株的3個基因,經過ClustalW軟件比對且手工校正后的各個基因按照ITS-CAL-GAPDH的順序分別首尾相連,并下載GenBank中同時含有ITS、CAL和GAPDH 3個基因序列的炭疽屬菌株及模式菌株序列,3個基因按照ITS-CAL-GAPDH的順序首尾相連后采用MEGA6.0構建所有病原菌株3個組合基因序列的近鄰歸群(neighbor-joining,NJ) 系統發育樹,朱頂紅炭疽菌(C.hippeastri) 作為外群。

1.2.3病原菌形態觀察及致病性測定

將采用多基因分子方法鑒定出的Colletotrichumspp.菌株用打孔器在其菌落邊緣切取直徑5 mm的菌絲塊,轉接到新的 PDA 平板上,于28℃、黑暗條件下培養。每處理重復3次。供試菌株接種于 PDA 平板上培養10 d 后,挑取培養物在顯微鏡下觀察分生孢子、孢子梗、附著胞形態及有無剛毛。

為了闡明其他寄主植物的炭疽病菌是否可以侵染油茶,明確海南油茶潛在侵染源,把從海南4個地點的13種不同寄主植物上分離獲得的不同炭疽病菌對油茶進行致病性測定。具體做法是,油茶葉用75%乙醇表面消毒處理,細針蘸取濃度為15×10倍顯微鏡下每視野30～40個炭疽病菌孢子懸浮液后刺扎油茶葉,以無菌水處理及無刺傷葉片接種作對照(CK),觀察病害發生情況,并對接種后發病葉進行病原菌再分離與接種病菌進行比較。

2　結果與分析

2.1炭疽病菌的分離與鑒定

經過對菌株的菌落、分生孢子等形態特征觀察以及菌株的ITS基因序列在GenBank中Blast相似性搜索,確定從海南省4個地方采集的植物炭疽病樣品中,共分離獲得炭疽屬真菌135株(其中,南圣鎮29株、屯昌楓木林場38株、通什鎮20株、澄邁林場48株)。對所有135個菌株的ITS、CAL和GAPDH 3個基因序列按順序拼接起來后,與從GenBank中下載的炭疽屬其他已知種每個菌株相應的3個基因拼接序列構建的N-J系統發育樹(圖1),結果顯示135株病菌共分成5種病原菌,分別是:C.fructicola(85株),C.siamense(45株),C.gloeosporioides(3株),C.camelliae(1株),C.cliviae(1株)。

不同寄主植物上分離的菌株C.fructicola形態特征一致(圖2a～d),在PDA培養基上,菌落淺灰色至深灰色,圓形,規則,邊緣色稍淺;背面淺褐色至深褐色。菌核、剛毛未見;分生孢子堆為淺黃色;分生孢子梗圓柱狀,無色;分生孢子單胞,直,圓柱狀,兩端鈍圓,無色,光滑;菌絲體附著胞棍棒狀、褐色、邊緣完整;不同寄主植物上的菌株C.siamense形態特征也一致(圖2e～h),在PDA培養基上,菌落淺灰色,絨毛狀,邊緣整齊,背面中心深褐色向外逐漸變為米湯色,菌核、剛毛未見;分生孢子梗圓柱狀,分生孢子堆淺黃色,單胞,直,圓柱狀,兩端鈍圓,無色,光滑;菌絲體附著胞淺褐色至深褐色,邊緣不規則,有時形成多級次生附著胞,呈鏈狀。這兩種菌為分離炭疽病菌的主要種類,共分離獲得130株,占總分離菌株的96%;特別是在4個采樣地點的油茶樹上都分離到C.fructicola和C.siamense這兩種菌,而以前報道的油茶炭疽病菌——膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)未在油茶樹上分離出。

膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)只在南圣鎮的葛根上分離到3株,在PDA培養基上,菌落淺灰色至深灰色,絨毛狀,邊緣整齊,背面深褐色,未見菌核及剛毛。分生孢子堆橘紅色,分生孢子直,無色,光滑,圓柱狀,兩端鈍圓或一端鈍圓另一端稍尖;菌絲體附著胞橢圓狀,淺褐色,邊緣光滑,能形成多級次生附著胞,呈鏈狀(圖3a～d)。在澄邁林場的油茶樹上分離到了1株C.camelliae,在PDA培養基上,菌落圓形,灰白色,菌絲緊貼培養基,菌落背面初期中央為黑色、邊緣淺灰色,后期黑色素大量沉積,致使整個培養皿背面變為黑色;分生孢子梗圓柱狀,無色;分生孢子無色、光滑,單孢,長橢圓形或圓柱形,兩端圓或一端略粗,另一端稍尖;菌絲體附著胞棍棒狀,淺褐色,邊緣不規則,有時形成多級次生附著胞(圖3e～h)。在楓木林場的羊蹄甲葉上分離到1株C.cliviae,在PDA培養基上,菌落初期白色,后期變為灰色,絨毛狀,背面深褐色至黑色稍綠;可見菌核及剛毛;分生孢子梗無色,分生孢子堆淺黃色,分生孢子單孢,直,圓柱狀,光滑,無色,兩端鈍圓;菌絲附著胞褐色,不規則,邊緣圓鋸齒狀(圖3i～l)。

2.2炭疽病菌種類在不同寄主植物上的分布

海南省4個采樣地不同寄主植物上炭疽病菌種類分布見表2。從表2中可以看出,4個采樣地的油茶樹上都分離到C.fructicola,共有20個菌株;除通什外,其他3個采樣地的油茶樹都分離到C.siamense,共有14個菌株。同時,我們從每個采樣地其他的寄主植物上也都分離到了C.fructicola和(或)C.siamense,其中南圣鎮其他植物上分離到C.fructicola10株、C.siamense3株,從楓木林場其他植物上分離到C.fructicola2株、C.siamense23株,從通什鎮其他植物上分離到C.fructicola15株,從澄邁林場其他植物上分離到C.fructicola39株、C.siamense5株,這說明,油茶樹和其他寄主植物共享相同的炭疽屬病原菌種類——C.fructicola和C.siamense,這提示我們,采樣地中的其他植物炭疽病菌很可能是油茶樹的潛在侵染源。另外,以前認為的油茶炭疽病原菌——膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)未在油茶樹上分離得到;4個采樣地中,只在南圣鎮的葛根葉上分離到3株,其他植物上均未分離到,表明膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)可能不是海南植物炭疽病的主要致病菌。

圖1　依據ITS-CAL-GAPDH 3基因合并序列構建的不同寄主植物上炭疽病菌N-J系統發育樹Fig.1　N-J phylogenetic tree of Colletotrichum spp. based on their ITS-CAL-GAPDH sequences

圖2　炭疽病菌Colletotrichum fructicola和C.siamense的形態特征Fig.2　Morphological characteristics of Colletotrichum fructicola and C.siamense

圖3　炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides,C.camelliae,C.cliviae的形態特征Fig.3　Morphological characteristics of Colletotrichum gloeosporioides,C.camelliae and C.cliviae

2.3不同炭疽病菌對油茶葉的致病性測定

將海南省南圣鎮、楓木林場、通什鎮和澄邁林場4個地方不同寄主植物上分離的炭疽病菌C.fructicola,C.siamense,C.gloeosporioides,C.camelliae,C.cliviae的孢子懸浮液,分別刺傷接種至同一品種油茶葉片上。接種4 d后葉片開始發病,與對照相比,接種不同采樣地、不同寄主植物炭疽病菌孢子懸浮液的葉片都可以發病,發病率為100%,而無刺傷葉片接種也均發病,但發病時間較長,發病率較低;無菌水對照則未發病。患病葉片表現出的癥狀與田間自然發病癥狀相似。從接種后發病的組織中再次分離出相應的病菌,菌落形態、孢子形態與接種病菌種類一致。結果表明:從不同寄主植物上(包括油茶)分離得到的5種炭疽病菌都能引起油茶炭疽病,這說明油茶炭疽病菌不僅可以在同種寄主植物間傳播,其他的寄主植物,如葛根、山麻桿、飛機草、蒲葵、鯽魚膽、桃花心木、黃蘭、羊蹄甲、山礬、銀柴、降香黃檀和檀香等植物的炭疽病菌也能侵染油茶,是油茶的潛在侵染源。

表2　4個采樣地不同寄主植物上炭疽病菌種類分布

3　討論

炭疽菌(Colletotrichum)種級鑒定標準是以附著胞和分生孢子形態等綜合特征來確定[9-11]。但炭疽屬真菌中許多種的分生孢子、附著胞都非常相似,很難以這兩種特征來進行炭疽菌種的鑒定。此外,一些學者認為,僅根據形態學特征來進行炭疽菌種的鑒定與分類通常是不適當的[11-12]。傳統的病原真菌形態分類主要基于其表現型,而分子系統學則是從遺傳本質上進行分類。隨著分子生物學技術的進步, 基于多基因分子標記的系統學方法被引入炭疽屬真菌的分類研究中[13]。Taylor等[14]提出了基于多基因譜系的系統學種(phylogenetic species)的概念來區別于以前的形態和生物學種。目前,形態特征結合多基因系統學鑒定炭疽菌屬真菌已成為發展趨勢[8,15-18]。Crouch等[19]運用ITS、Apn2、Mat1/Apn1和Sod2基因進行聯合分析,將形態上極難區分識別的集合種C.graminicola區分開來,恢復C.cereale和C.eleusinsines為合格種,并引入了6個新種;Damm等[20]運用ITS、ACT、TUB2、CHS-1、HIS3和GPDH等6個基因序列進行聯合分析,準確地區別出形態上極其相似的草本植物上分離的該屬真菌,并引入了4個新種。

油茶炭疽病是由炭疽屬真菌引起的一種重要病害。該屬的真菌地理分布和寄主范圍廣泛,危害高大喬木、果樹、藥用植物、花卉、灌木、蔬菜和大田作物等多種植物。我們通過調查發現,油茶林及附近的植被構成非常復雜,包括草本植物、木本植物;這些植物與油茶樹一樣容易被炭疽屬真菌危害,如杉木炭疽病、楊樹炭疽病、泡桐炭疽病、山茶炭疽病、蘆薈炭疽病、菜豆炭疽病、辣椒炭疽病、草坪炭疽病等[21-25]。這些植物的炭疽病是否與油茶炭疽病具有相同的病原種類以及這些寄主植物的炭疽病菌是否可以侵染油茶,成為油茶炭疽病的潛在侵染源,目前尚不清楚,這嚴重影響了油茶炭疽病防治。本研究從海南省4個不同的地方采集了油茶、葛根、山麻桿、飛機草、蒲葵、鯽魚膽、桃花心木、黃蘭、羊蹄甲、山礬、銀柴、降香黃檀和檀香等13種植物的炭疽病葉樣品,分離到5種共135株炭疽屬真菌。其中油茶與其他寄主植物共享的炭疽病菌種類有兩種:C.fructicola(85株)和C.siamense(45株);另外,從南圣鎮的葛根上分離到3株C.gloeosporioides,從楓木林場的羊蹄甲上分離到1株C.cliviae,從澄邁林場的油茶上分離到1株C.camelliae。通過致病性測定,發現從不同寄主植物上分離得到的5種炭疽病菌都能引起油茶炭疽病,這說明不同寄主植物的炭疽病菌都能侵染油茶,是油茶的潛在侵染源。研究結果對采取有效措施防治油茶炭疽病具有重要意義:如避免具有相同病原的樹種與油茶混栽,清除林內可感染相同病原的雜草、灌木等;在防治油茶炭疽病的同時,對其他植物的炭疽病也要進行防治等。

本研究結果表明,海南油茶林中當地植物的炭疽病菌是油茶的潛在侵染源,我們需要進一步研究全國油茶炭疽病菌及潛在寄主植物種類,并從分子水平證明不同寄主植物間的炭疽病菌存在基因交流或重組(雜交),研究結果將為整體考慮油茶及其他寄主植物制定可持續控制油茶炭疽病策略提供重要的理論依據。

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(責任編輯：田喆)

The initial inoculum source of oil tea anthracnose in Hainan Province

Li He1,2,Li Yang1,2,Jiang Shiqiang1,Wan Zhi1,Li Hangyu1,Xu Jianping1,2,Zhou Guoying1,2

(1.Key Laboratory for Non-wood Forest Cultivation and Conservation of Ministry of Education, Central South University of Forestry and Technology, Changsha410004, China; 2. Hunan Provincial Key Laboratory for Control of Forest Diseases and Pests, Central South University of Forestry and Technology, Changsha410004, China)

The objective of this study is to clarify the initial inoculum plant source of oil tea anthracnose in Hainan Province. Isolation and identification, artificial infection tests were used for analyzing the pathogens causing oil tea anthracnose in four tea-oil plantations in Hainan. A total of 135 strains of anthracnose pathogen were isolated from the host plantsCamelliaoleifera,Puerariaeradix,Alchorneadavidii,Eupatoriumodoratum,Livistonachinensis,Maesaperlarius,Khayasenegalensis,Micheliachampaca,Bauhiniapurpurea,Symplocossumuntia,Aporosachinensis,DalbergiaodoriferaandSantalumalbum, includingC.fructicola(85 isolates),C.siamense(45 isolates),C.gloeosporioides(3 isolates),C.cliviae(1 isolate) andC.camelliae(1 isolate).C.fructicolaandC.siamensewere shared by the oil tea and other 12 plants in the four sampling sites, and the two species accounted for 96% of total isolates. Pathogenicity tests showed that the fiveColletotrichumspecies isolated from different host plants could infect oil tea leaves. The anthracnose pathogens of many other plants were the potential infection sources of the oil tea in Hainan Province.

Camelliaoleifera; anthracnose pathogen; pathogenicity

2015-07-17

2015-09-14

國家自然科學基金(31570641,31100479)

E-mail: csuftlihe@163.com

S 435.659

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.04.009