番茄褪綠病毒RT-PCR檢測技術的優化及河南分離物的鑒定

馮　佳,　孫曉輝,　高利利,　劉靈芝,　喬　寧,　劉永光,　竺曉平*

(1. 山東省蔬菜病蟲生物學重點實驗室, 山東農業大學植物保護學院, 泰安　271018;2. 濰坊科技學院蔬菜花卉研究所, 濰坊　262700)

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番茄褪綠病毒RT-PCR檢測技術的優化及河南分離物的鑒定

馮佳1,孫曉輝1,高利利1,劉靈芝1,喬寧2,劉永光2,竺曉平1*

(1. 山東省蔬菜病蟲生物學重點實驗室, 山東農業大學植物保護學院, 泰安271018;2. 濰坊科技學院蔬菜花卉研究所, 濰坊262700)

為獲得高效、靈敏和穩定的番茄褪綠病毒(Tomatochlorosisvirus, ToCV)RT-PCR檢測體系,選取文獻報道的和重新設計的共9套ToCV的RT-PCR引物,經過一系列測試和比較,篩選出了靈敏度、特異性均較高的引物組合,并對反應條件、參數進行了優化,確定了最優反應條件。應用優化的ToCV RT-PCR檢測體系對從河南設施蔬菜生產區采集的疑似感病番茄樣品進行檢測,擴增產物測序后經BLAST比對發現,河南分離物的CP和HSP70基因序列與GenBank上注冊的ToCV典型分離物序列的相似性均達94%以上,通過對ToCV病毒粒子的電鏡觀察而進一步確定ToCV已在河南侵染設施番茄。

番茄褪綠病毒;RT-PCR;多重PCR;序列分析

番茄褪綠病毒(Tomatochlorosisvirus, ToCV)隸屬長線形病毒科(Closteroviridae)毛形病毒屬(Crinivirus),能通過2屬4種粉虱進行傳播,但不能通過摩擦接種傳毒[1]。自1998年美國首次發現ToCV后,其他多個國家陸續報道了該病毒的發生[2-7];國內ToCV最早在臺灣被發現[8],2012年后北京、山東、河北、天津等地區均有該病毒危害的報道[9-12]。2013年至2014年該病毒病害在山東等地大面積流行,造成番茄嚴重減產[13]。植株感染ToCV后首先表現為下部葉片葉脈間褪綠黃化,后逐漸向上部葉片蔓延,隨著病情加重,葉脈變成深綠色,感病葉片變厚、變脆,且易折,植株長勢變弱,果實變小且提前轉色。

高效、靈敏的ToCV檢測技術對病害的早期預警及發病規律的了解至關重要。目前國際上主要采用RT-PCR技術檢測番茄褪綠病毒[14-17],血清學方法應用得較少[18]。ToCV的分子鑒定通常需要同時檢測其外殼蛋白(coat protein, CP)基因和熱激蛋白(heat shock protein 70 family homologue, HSP70)基因。已報道的檢測ToCV的引物各不相同,針對的靶標序列也各有側重,有的僅針對CP基因或HSP70基因的部分片段,有的針對其全長,反應條件也差別不一。鑒于此,本研究對已報道的ToCV分子檢測技術體系進行了系統測試、比較和重新設計、優化、篩選,建立了快速、穩定、高效的ToCV RT-PCR檢測技術,并應用該技術對河南地區設施番茄病樣進行了檢測,確定了ToCV在河南省的發生情況。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1樣品采集

2014年7月至8月在河南省設施番茄產區共采集疑似感染番茄褪綠病毒的病樣46份,其中中牟縣10份,滑縣8份,內黃縣10份,北莊縣5份,馬村區9份,武陟縣4份。以本實驗室從河北、天津采集并測序鑒定的感病葉片和山東省農業科學院植物保護研究所提供的山東淄博感病葉片為陽性對照;以健康番茄植株葉片作為陰性對照。所有待測樣品和陽性樣品均保存于-20℃冰箱,用于RNA提取等后續試驗。

1.1.2菌株、載體及試劑

大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α由山東省蔬菜病蟲生物學重點實驗室提供;克隆載體pMD18-T、RNase Inhibitor、RTase M-MLV(RNase H-)、T4 DNA連接酶購自TaKaRa公司;快捷型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒Ⅱ(離心柱型)購自北京百泰克生物技術有限公司;EasyTaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA分子量標準Trans2K Plus購自北京全式金生物技術有限公司;其他生化試劑及普通化學試劑均為進口或國產分析純。

1.2方法

1.2.1疑似病樣總RNA的提取及cDNA合成

稱取疑似感病植物葉片0.1 g,加液氮研磨成粉末,采用TRIzol法提取葉片總RNA,用于后續cDNA的合成。反轉錄步驟參照文獻[15]進行。

1.2.2引物設計與合成

本研究所用引物共9套,其中5套來自已發表文獻[19-22]；利用Premier 5重新設計了針對HSP70和CP基因的引物4套(表1)。9套引物中針對CP基因4套、熱激蛋白HSP70 基因5套,引物由鉑尚生物技術(上海)有限公司合成。

表1　本研究所用引物信息

1.2.3RT-PCR檢測體系的優化

采用RT-PCR對表1中的引物進行對比和篩選優化,在優化時,針對影響PCR擴增的模板濃度、引物濃度和退火溫度進行檢測和調整[22-25]。以山東淄博ToCV陽性樣品RNA (1 μg)為模板合成cDNA。分別應用ToCV特異性引物(表1)進行PCR擴增,引物初始濃度均設為10 pmol/μL。cDNA的初始濃度為1 600 ng/μL,分別稀釋至25、50、75、100、125、150、180倍,通過比較擴增效果,選擇靈敏度高的引物組合,分別設置其濃度為7、5、4、3、2和1 pmol/μL進行靈敏度測試;同時對退火溫度進行優化,分別在30、33.8、37.4、42.2、48.4、52、59.5、64.2和68 ℃下進行擴增。最后對結果進行比較,選定最優引物組合、最佳引物濃度和退火溫度。應用優化的擴增體系對河南設施番茄產區的番茄樣品進行RT-PCR檢測。

1.2.4雙重PCR體系設計

ToCV的鑒定需要同時檢測CP和HSP70基因,采用雙重PCR擴增可以提高效率。分別用To-CP-F/R和To-HSP-F/R的下游引物對山東淄博陽性對照樣品葉片總RNA進行反轉錄,然后同時擴增CP基因和HSP70基因,試驗方法參考文獻進行[26-30]。擴增體系：10× PCR buffer 2.5 μL,2.5 mmol/L dNTPs 1.0 μL,To-CP-F/R和To-HSP-F/R各1.0 μL,cDNA 1.0 μL,TaqDNA 聚合酶 0.5 μL,ddH2O 補足 25 μL。擴增條件為：94℃ 3 min;94℃ 30 s,52℃ 30 s,72℃ 2 min,循環25次;72℃ 10 min。PCR擴增產物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照記錄結果。

1.2.5PCR產物回收及測序

參照凝膠回收試劑盒說明書對檢測結果呈陽性的樣品進行回收和純化,將純化的PCR產物連接到pMD18-T載體上并轉化DH5α。陽性克隆經驗證后,將菌液送上海鉑尚生物科技有限公司測序。

1.2.6序列分析

利用NCBI中的BLAST程序比較病毒樣品的CP和HSP70基因序列。從GenBank中下載已注冊的ToCV序列,用DNAStar中的MegAlign對選定的序列進行相似性比對,再利用MEGA 4.0構建系統進化樹。

1.2.7ToCV病毒粒子的提純和電鏡觀察

取300 g感病番茄葉片置于-20℃冰箱過夜(盡量去除粗大葉柄),參照Fribourg等[31]提取馬鈴薯Y病毒的方法并略加改進提取ToCV病毒粒子,最后回溶病毒沉淀時,適當減少0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液的用量并增加回溶時間,以增加溶液中病毒粒子的濃度。

利用磷鎢酸負染色技術對提純的ToCV病毒粒子進行染色觀察[32-34],選用3%的磷鎢酸染色液,將樣品滴加在Formvar膜的銅網上,室溫晾干后進行電鏡觀察。

2　結果與分析

2.1PCR擴增條件優化

RT-PCR檢測體系的優化結果表明,當cDNA模板稀釋至8.89 ng/μL時,引物To-HSP-F/R和To-CP-F/R依然可以擴增出可見的目的條帶,而其他ToCV特異性引物均未檢測出目的條帶(圖1)。選擇引物To-CP-F/R,對其濃度和退火溫度進行進一步調整優化。結果表明,退火溫度在30～68℃時均有條帶出現(圖2a),但退火溫度過高或過低均會對特異性擴增造成影響,最適退火溫度在37～64℃;引物濃度在1～10 pmol/μL時,均能檢測到特異性條帶(圖2b),但引物濃度過低同樣會影響特異性擴增,引物濃度在4～10 pmol/μL時,擴增效率最好。

2.2雙重PCR擴增體系鑒定及在河南番茄褪綠病毒檢測中的應用

以To-CP-F/R和To-HSP-F/R建立的雙重PCR檢測體系能同時檢測到ToCV的CP和HSP基因(圖3a)，達到了預期的效果。

以從河南省設施番茄種植區采集的46份番茄葉片總RNA為模板,利用引物To-CP-F/R和To-HSP-F/R進行雙重RT-PCR擴增。從檢測結果(表2)可以看出,僅河南中牟縣和滑縣樣品中擴增得到了970 bp和1 864 bp特異性條帶(圖3b),測序結果表明,河南中牟縣ToCV分離物(HNZZZM1)、滑縣地區ToCV分離物(HNAYHX)的CP基因全長為774個核苷酸,GenBank登錄號分別為KP264984和KP264983;HSP70基因全長為1 665個核苷酸,GenBank登錄號分別為KP264987和KP264986。

圖1　不同ToCV引物靈敏度對比結果Fig.1　Sensitivity of different ToCV primers

圖2　To-CP-F/R的最適退火溫度和濃度篩選Fig.2　Screening annealing temperature and primer concentrations of To-CP-F/R for RT-PCR

采集時間/年-月-日Collectiondate采集地點Collectionsite樣品癥狀Symptoms陽性樣品數/總樣品數Positive/totalsamples2014-07-28河南中牟縣ZhongmouCounty,Henan葉片黃化,植株矮小Leafchlorosis,plantdwarfing2/102014-07-29河南滑縣HuaCounty,Henan葉片黃化,植株矮小Leafchlorosis,plantdwarfing1/82014-07-31河南內黃縣NeihuangCounty,Henan葉片黃化,植株矮小Leafchlorosis,plantdwarfing0/102014-08-01河南北莊縣BeizhuangCounty,Henan葉片黃化,植株矮小Leafchlorosis,plantdwarfing0/52014-08-02河南馬村區MacunDistrict,Henan葉片黃化,植株矮小Leafchlorosis,plantdwarfing0/92014-08-02河南武陟縣WuzhiCounty,Henan葉片黃化,植株矮小Leafchlorosis,plantdwarfing0/4

圖3　ToCV的雙重PCR體系及河南感病番茄的檢測Fig.3　ToCV duplex PCR system and detection results of diseased samples from Henan

2.3引物穩定性比較

選取保存于-20℃冰箱的山東淄博、河南中牟、河北衡水和天津武清ToCV番茄陽性樣品對優化得到的兩對ToCV特異性引物To-CP-F/R和To-HSP-F/R進行穩定性比較。結果發現To-CP-F/R相對穩定,而To-HSP-F/R在擴增不同地區ToCV陽性樣品時穩定性存在差異 (圖4)。

圖4　引物To-HSP-F/R和To-CP-F/R對不同地區陽性樣品的擴增結果Fig.4　Amplification products of positive samples from different regions using To-HSP-F/R and To-CP-F/R

選取山東淄博陽性樣品測定HSP70基因分段擴增引物HSP-1-F/R、HSP-2-F/R的穩定性,結果表明HSP-2-F/R的擴增效率優于HSP-1-F/R(圖5a)。進一步選取河北衡水、天津武清、河南中牟和山東淄博ToCV陽性番茄樣品測定To-HSP-F/R和HSP-2-F/R的穩定性,結果表明,引物To-HSP-F/R的穩定性低于HSP-2-F/R(圖5b)。

2.4序列分析

采用DNAStar中的MegAlign軟件分析本試驗獲得的河南中牟縣ToCV分離物(HNZZZM1)和滑縣ToCV分離物(HNAYHX)的CP基因(GenBank登錄號KP264984和KP264983)和HSP70基因(GenBank登錄號KP264987和KP264986)的核苷酸序列。結果顯示,中牟縣和滑縣ToCV分離物的CP基因同源性為99.6%,HSP70基因同源性為99.16%。由于兩地分離物同源性較高,因此以河南滑縣分離物(HNAYHX)為代表與GenBank中注冊的各地區典型ToCV分離物的核苷酸序列進行一致性比較。結果表明,河南滑縣ToCV分離物(HNAYHX)的CP和HSP70基因序列與GenBank中代表性的ToCV分離物相似性均在94%以上(表3)。為進一步分析其進化關系及分類地位,選取國內外不同地區代表性的番茄褪綠病毒分離物,分別針對CP和HSP70基因序列構建系統進化樹(圖6a～b),結果表明ToCV河南分離物(HNZZZM1、HNAYHX)與中國北京(ToCV-BJ)、南京(Nanjing)、山東(SDSG)和日本(Tochigi)分離物親緣關系處于同一個大分支上,其中與日本分離物的親緣關系最近。

圖5　不同引物擴增HSP70基因結果Fig.5　Amplification results of HSP70 gene using different primers

分離物名稱Isolatename分離地點Location登錄號Accessionno.一致性/% IdentityCP序列HSP70序列Tochigi日本JapanAB513443100-Tochigi日本JapanAB513442-99.7AT80/99-IC西班牙SpainKJ74025798.098.8AT80/99西班牙SpainDQ13614697.998.8SDSG中國ChinaKC70951099.799.8SDTAMZ中國ChinaKC812627-99.7SDLC中國ChinaKC812626-99.7SDLC中國ChinaKC81262299.7-BJ中國ChinaKC31137599.7-ToCV-BJ中國ChinaKC88799999.899.6Nanjing中國ChinaKJ81504599.799.5Florida美國USAAY90344899.599.5Fr法國FranceEU62535098.3-ToC-Br2巴西BrazilJQ95260199.099.4Gr-535希臘GreeceEU28474499.199.3IS以色列IsraelDQ23467398.9-HP韓國KoreaKP11453799.8-Amelia美國USAHQ87984094.6-TICV-CA4美國USAFJ54230630.964.4

2.5ToCV病毒粒子觀察

用磷鎢酸負染法對安陽番茄樣品中提取的ToCV病毒粒子染色并進行電鏡觀察(圖7),電鏡結果可以清晰地顯示長度為800 nm左右的線條形病毒粒子聚集在一起。

3　討論與結論

ToCV的鑒定需要同時對CP和HSP70兩個基因進行測定,目前文獻中針對ToCV的檢測方法主要以RT-PCR為主,已報道的文獻中檢測CP基因的引物有ToCV-F/R[21]和CP-F/R[19];檢測HSP70基因的引物有ToC-5/6[20]、HSP-1-F/R和HSP-2-F/R[19],其中引物CP-F/R、HSP-1-F/R、HSP-2-F/R和ToC-5/6引用次數較多[5-9,15-17]。ToCV-F/R和CP-F/R均可擴增全長CP基因,引物ToC-5/6擴增HSP70基因的部分序列,HSP-1-F/R和HSP-2-F/R是通過擴增HSP70基因的上、下兩部分序列,通過重疊區拼接得到全長HSP70基因序列,但HSP-2-F/R的擴增效率高于HSP-1-F/R。本研究重新設計合成了檢測CP和HSP70全長基因的引物To-CP-F/R和To-HSP-F/R,并與已有的引物進行對比分析。結果表明,本研究設計的引物To-CP-F/R的靈敏度和穩定性均較好,而To-HSP-F/R的穩定性較已發表的分段擴增引物HSP-2-F/R[19]稍差,但該引物可直接一步擴增得到HSP70基因全序列,省去分段擴增和序列拼接等步驟,達到高效、省時的擴增效果。本研究對ToCV常規PCR檢測技術進行了優化,對引物的退火溫度和濃度進行了調整,同時設計并測試了雙重PCR體系。優化后的RT-PCR檢測體系對ToCV病毒的檢出率相對較高,避免了因引物靈敏度低而出現假陰性現象,同時得到了相對穩定的RT-PCR擴增條件,減少擴增過程中出現的引物濃度和退火溫度對PCR結果的影響;設計的雙重PCR體系可以同時擴增ToCV的CP和HSP70基因,能有效縮短試驗時間。用優化的RT-PCR檢測技術對河南番茄種植區的疑似感病番茄樣品進行檢測,確定河南番茄已受到ToCV的侵染,同時通過提純病毒和電鏡觀察,進一步確定了結果。

圖6　番茄褪綠病毒CP和HSP70基因進化樹Fig.6　Phylogenetic relationships based on sequences of the ToCV CP and HSP70 genes

圖7　ToCV病毒粒子電鏡圖片Fig.7　ToCV virus particles electron microscopy image

番茄褪綠病毒是番茄生產上近幾年新發生的病毒,該病毒可通過煙粉虱傳播,發展蔓延迅速,其引起的癥狀與生理性的營養缺素癥非常相似,給診斷帶來一定的難度,造成病情延誤,番茄產量下降,給種植戶帶來巨大的損失。開發和優化高效、準確的分子檢測方法,在植株發病的早期檢測并及時預警,有利于控制該病害的發生和流行。

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(責任編輯：楊明麗)

Technique optimization of RT-PCR for detecting Tomato chlorosisvirusand molecular identification of isolates in Henan Province

Feng Jia1,Sun Xiaohui1,Gao Lili1,Liu Lingzhi1,Qiao Ning2,Liu Yongguang2,Zhu Xiaoping1

(1. Shandong Provincial Key Laboratory for Biology of Greenhouse Vegetable Diseases and Insect Pests,College of Plant Protection,Shandong Agricultural University,Tai’an271018,China; 2. Institute of Vegetables and Flowers, Weifang University of Science & Technology, Weifang262700, China)

To obtain stable, sensitive and specific RT-PCR detection system forTomatochlorosisvirus(ToCV), 9 primer pairs redesigned or selected from those published research papers were compared for their productivity, sensitivity and specificity in the RT-PCR detection system, a series of tests were conducted and the primer pairs that most sensitive and specific among them were selected and confirmed, and the RT-PCR reaction conditions were optimized, The optimized RT-PCR detection system was used to detect the ToCV-suspected tomato samples from greenhouse vegetable-growing area in Henan Province. Sequence analysis revealed that theCPandHSP70 homologue gene of Henan isolates shared 97% nucleotide sequence identity with that of ToCV isolates registered in the NCBI, indicating the tomato plants were infected by ToCV in Henan. This results were also confirmed by electron microscopy observation of the virus particles extracted from the samples.

Tomatochlorosisvirus;RT-PCR;multiplex PCR;sequence analysis

2015-09-10

2015-11-23

公益性行業(農業)科研專項(201303028)；山東省科技發展計劃項目(2014GNC111008)；山東省自然科學基金(ZR2012CM032)

E-mail:zhuxp@sdau.edu.cn

S 436.412.11

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.04.020