湖南省永州地區柑橘慢衰病與黃龍病病原鑒定及分布調查

宋志強,　成飛雪,　程菊娥,　張德詠,　何代進,　劉　勇*

(1. 湖南農業大學植物保護學院, 長沙　410128; 2. 湖南省農業科學院植物保護研究所, 園藝作物病蟲害綜合治理湖南省重點實驗室, 長沙　410125; 3. 湖南生物機電職業技術學院, 長沙　410127)

?

湖南省永州地區柑橘慢衰病與黃龍病病原鑒定及分布調查

宋志強1,2,成飛雪2,程菊娥2,張德詠1,2,何代進3,劉勇1,2*

(1. 湖南農業大學植物保護學院, 長沙410128; 2. 湖南省農業科學院植物保護研究所, 園藝作物病蟲害綜合治理湖南省重點實驗室, 長沙410125; 3. 湖南生物機電職業技術學院, 長沙410127)

為明確湖南省柑橘黃化癥狀與柑橘慢衰病和柑橘黃龍病的相關性,應用形態學和分子生物學方法對湖南省永州地區表現黃化癥狀的柑橘進行了兩種病原的鑒定及分布調查。結果表明,造成該地區柑橘黃化現象的主要原因為柑橘半穿刺線蟲和黃龍病菌對柑橘的侵染。所檢樣本中,柑橘慢衰病平均發生率為82.1%,土壤中的半穿刺線蟲群體密度最高達到3 077條/100 mL。永州地區柑橘黃龍病病菌屬于韌皮部桿菌屬類細菌亞洲種,平均檢出率為64.3%。柑橘半穿刺線蟲和黃龍病菌在柑橘園存在混合侵染現象,混合侵染率為53.6%。柑橘半穿刺線蟲在永州地區柑橘產區分布廣泛,是造成柑橘黃化癥狀的重要病因,重視并有效防控柑橘半穿刺線蟲已迫在眉睫。

柑橘慢衰病;柑橘黃龍病;柑橘半穿刺線蟲;病原鑒定;分布調查

柑橘半穿刺線蟲(Tylenchulussemipenetrans)引起的柑橘慢衰病(citrus slow decline disease)是柑橘上最重要的病害之一,廣泛分布于全世界柑橘產區,造成極大的經濟損失[1]。柑橘半穿刺線蟲是一種專化性強的定居型半內寄生線蟲,能夠寄生50多種柑橘品種及其雜交種,也可在葡萄、草莓、荔枝、蘋果、柿、杉木等植物上繁殖[2-3]。柑橘被侵染后活力減退,葉片褪綠黃化,長勢衰弱似缺肥、缺水、生長不良癥狀,嚴重時葉片脫落,果實變小,甚至枯死[4]。此外,柑橘半穿刺線蟲侵染柑橘根部造成的傷口有利于真菌、細菌等病原物的入侵,加重對柑橘的危害[5]。柑橘受害后一般減產30%～50%,嚴重時達100%[6];福建省5個重要柑橘產區柑橘半穿刺線蟲果園發病率為74.6%,果園株發病率為5%～100%[7]。

柑橘黃龍病(citrus Huanglongbing,HLB)是世界柑橘生產中的一種極具毀滅性的病害,其病原為韌皮部桿菌屬類細菌(CandidatusLiberibacter spp.),根據病原對熱的敏感性、傳播媒介和地理分布,可分為亞洲種(Ca. L. asiaticus)、非洲種(Ca. L. africanus)和美洲種(Ca. L. americanus)[8-9]。目前在我國僅發現亞洲種,在田間主要通過柑橘木虱(Diaphorinacitri)傳播,還可借助嫁接、菟絲子傳播。田間典型癥狀為葉片斑駁型黃化、均勻型黃化及缺素性黃化,果實呈“紅鼻果”或“斜肩果”，一般會造成30%～100%的產量損失[10];我國廣西柑橘黃龍病年平均發生率超過5%,每年造成的直接經濟損失超過8.05億～9.62億元[11]。

湖南省是全國柑橘主產區之一，面積、產量、產值均穩居全國第一。近年來,湖南省特別是永州地區柑橘黃化衰退現象日趨嚴重,極大地威脅了柑橘產業的發展。由于柑橘慢衰病及黃龍病都會引起柑橘出現黃化癥狀,在多數情況下,柑橘慢衰病所表現的黃化癥狀常被基層誤診為柑橘黃龍病,造成防控措施不當,防治效果低下,而進行拋荒、砍伐或挖除,給柑橘產業造成了巨大的經濟損失。福建省長泰縣因將柑橘慢衰病誤診為黃龍病,每年挖除的病樹約占果樹總數的10%[12]。因此,準確了解造成柑橘黃化現象的病因,對其防控具有極其重要的意義。本研究團隊于2014-2015年對湖南省永州地區表現黃化癥狀的柑橘進行了柑橘半穿刺線蟲和黃龍病病原鑒定及分布調查,以期為柑橘慢衰病和黃龍病的有效防控提供科學指導。

1　材料與方法

1.1樣品采集

2014年6月-2015年11月對湖南省永州市冷水灘區、零陵區、道縣和江永縣柑橘園中表現黃化癥狀的柑橘進行了取樣調查。采用五點取樣法分別采集柑橘植株的葉片、根系及根際土壤,進行柑橘慢衰病和柑橘黃龍病病原檢測。

1.2柑橘半穿刺線蟲形態學鑒定

柑橘慢衰病最主要的診斷方法是鑒定柑橘根系及根際土壤中是否存在柑橘半穿刺線蟲。柑橘根組織中的雌蟲在體視顯微鏡下用細解剖針直接剝離;土壤中2齡幼蟲和雄蟲采用淺盤法分離。將雌蟲以及分離獲得的2齡幼蟲和雄蟲經緩慢加熱殺死后用TAF固定液固定,制成臨時玻片,于光學顯微鏡下進行形態觀察、拍照。采用de Man公式進行形態測計,其中:n=樣本數;L=體長;Stylet=口針長;Tail=尾長;Spicule=交合刺長度;a=體長/最大體寬;b=體長/頭端至食道與腸連接處的距離;c=體長/尾長;c＇=尾長/肛門或泄殖腔處體寬;V=陰門至頭端的距離/體長×100;DGO=背食道腺開口至口針基部球的距離。

1.3柑橘半穿刺線蟲分子生物學鑒定

1.3.1柑橘半穿刺線蟲DNA提取

單條線蟲DNA的提取參照王江嶺等的方法并稍作修改[13]。挑取單條線蟲放入含有8 μL ddH2O和1 μL 10×PCR buffer (Mg2+free)的200 μL PCR管中,放入液氮中冷凍1 min,置于95℃下2 min,重復5次;向PCR管中加入1 μL 1 mg/mL蛋白酶K,65℃溫育15 min,95℃反應10 min,獲得的DNA提取液直接進行PCR擴增。

1.3.2柑橘半穿刺線蟲PCR檢測

分別以柑橘半穿刺線蟲的雌蟲、雄蟲和2齡幼蟲的DNA為模板,采用Liu等報道的特異性引物Ts-SF(5′-TACCAGGTTGAGCAGAGTTCTT-3′)和Ts-SR(5′-TCCTACCCTTCCA CAGCG-3′)進行PCR擴增[14],片段大小為297 bp。PCR反應體系為25 μL:10×EasyTaqbuffer 3 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL,10 μmol/L正反向引物各1 μL,5 U/μLEasyTaqDNA polymerase 0.5 μL,模板DNA 5 μL,補足ddH2O至25 μL。反應程序:94℃預變性4 min;94℃變性30 s,59℃退火30 s,72℃延伸30 s,共35個循環;72℃延伸5 min。PCR擴增結束后,取5 μL擴增產物于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳。

1.4土壤中柑橘半穿刺線蟲群體密度調查

將采集的柑橘土壤樣品充分混勻后,分別取100 mL,采用淺盤法分離土壤樣品中的2齡幼蟲,在倒置顯微鏡下統計柑橘半穿刺線蟲2齡幼蟲的數量。每樣品重復3次,計算每100 mL土壤樣品中的柑橘半穿刺線蟲群體密度。

1.5柑橘黃龍病分子生物學檢測

以黃梢或葉片黃化作為田間診斷柑橘黃龍病依據的同時,采用分子生物學技術對其進行準確診斷。采用CTAB法提取柑橘葉脈總DNA。參照Hocquellet等報道的柑橘黃龍病菌特異性引物A2(5′-TATAAAGGTTGACCTTTCGAGTTT-3′)和J5(5′-ACAAAAGCAGAAATAGCACGAACAA-3′)進行PCR擴增[15],亞洲種和非洲種片段大小分別為703 bp和669 bp。PCR反應體系為25 μL:10×EasyTaq buffer 3 μL,2.5 mmol/L dNTPs 2 μL,10 μmol/L正反向引物各1 μL,5 U/μL EasyTaq DNA polymerase 0.5 μL,DNA模板1 μL,補足ddH2O至25 μL。反應程序:94℃預變性4 min;94℃變性30 s,62℃退火30 s,72℃延伸1 min,共35個循環;72℃延伸10 min。PCR擴增產物于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳分析,然后將PCR產物回收、轉化、克隆并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。將獲得的序列與GenBank核酸數據庫中已知序列進行同源性比較。

2　結果與分析

2.1柑橘半穿刺線蟲形態鑒定

2.1.1測計值

雌蟲:n=20;L=379.2(350.1～410.5)μm;a=4.7(4.0～5.3);b=3.0(2.7～3.4);V=90.1(87.3～93.0);Stylet=12.1(10.5～13.3)μm。

圖1　柑橘半穿刺線蟲的形態特征圖Fig.1　Morphological characters of Tylenchulus semipenetrans

雄蟲:n=20;L=360.0(317.9～410.1)μm;a=33.9(29.2～45.6);b=3.2(2.9～3.5);c=8.7(7.7～10.1);c＇=4.9(4.0～5.6);Stylet=10.2(9.4～11.1)μm;Spicule=19.1(16.8～21.5)μm;DGO=6.0(5.2～6.9)μm。

2齡幼蟲:n=20;L=379.6(337.1～414.5)μm;b=3.4(3.1～3.7);Stylet=13.8(13.0～14.7)μm。

2.1.2形態描述

雌蟲:成熟雌蟲與雄蟲異型,蟲體前部潛入根組織內,后部外露于根表面,膨大呈囊狀(圖1a)。頭部骨化弱,口針中等發達,基部球大而圓(圖1b)。具兩個彎曲的卵巢,陰門向腹面斜裂,近尾端,產卵于膠質卵囊中。排泄孔位于陰門前,無直腸和肛門。尾端有一指形突起(圖1c)。

雄蟲:蟲體蠕蟲形,纖細(圖1d)。唇區圓形。口針纖細,有基部球。食道細長,中食道球退化,食道腺呈洋梨形,與腸交界明顯(圖1e)。交合刺細,無交合傘。尾圓錐形,末端稍鈍(圖1f)。

2齡幼蟲:蟲體蠕蟲形(圖1g)。頭部骨質化,口針較發達,有基部球。中食道球大,食道腺與腸基本平接或略覆蓋腸(圖1h)。尾漸細,末端鈍圓(圖1i)。

2.2柑橘半穿刺線蟲分子生物學鑒定

利用柑橘半穿刺線蟲特異性引物分別對雌蟲、雄蟲和2齡幼蟲的DNA進行PCR擴增,結果顯示,雌蟲、雄蟲和2齡幼蟲均擴增出297 bp大小的特異性片段(圖2),表明分離得到的線蟲為柑橘半穿刺線蟲,其結果與形態學鑒定結果一致。

圖2　不同齡期柑橘半穿刺線蟲PCR產物Fig.2　PCR products amplified from Tylenchulus semipenetrans at different developmental stages using the species-specific primers

2.3柑橘黃龍病病菌檢測

利用柑橘黃龍病菌特異性引物A2和J5對采集的28份樣品的葉脈DNA進行PCR擴增,結果顯示,共有18份樣品擴增出一條703 bp的特異性條帶,而陰性對照未擴增出相應的條帶(圖3)。所得序列與GenBank公布的柑橘黃龍病菌亞洲種序列(CP004005.1和CP001677.5等)同源性為100%。

圖3　利用特異性引物A2和J5檢測湖南永州地區柑橘樣品中的柑橘黃龍病菌Fig.3　Electrophoresis of PCR products of HLB pathogen from Yongzhou City, Hunan Province,using primers A2 and J5

2.4柑橘半穿刺線蟲和柑橘黃龍病分布

在所采集的28份柑橘土壤樣品中,有24份樣品檢出了柑橘半穿刺線蟲,冷水灘區、零陵區、道縣和江永縣均有柑橘半穿刺線蟲的分布,平均發生率為82.1%,土壤中的線蟲群體密度最高達到3 077條/100 mL,冷水灘區和零陵區發生率較高,均為100%,其次是江永縣,發生率為91.7%,而道縣發生率相對較低,為20%(表1)。

從表1中可以看出,永州地區所采集的柑橘葉片樣品中,柑橘黃龍病的平均檢出率為64.3%,其中江永縣檢出率最高,為83.3%,道縣、零陵區和冷水灘區檢出率分別為60.0%、57.1%和25.0%,所檢測到的18個柑橘黃龍病分離物均為韌皮部桿菌屬類細菌亞洲種。

3　結論與討論

目前,已在我國湖南、湖北、廣東、廣西、福建等15個省(市、自治區)的柑橘產區中發現有柑橘半穿刺線蟲的分布和危害[3,16]。由于柑橘半穿刺線蟲在柑橘根部侵染危害,蟲體細小,無法用肉眼觀察到,雖發生普遍,危害嚴重,但其引起的柑橘慢衰病在柑橘生產中卻得不到重視,基層技術人員和種植戶基本不認識或不了解該病害,所表現的黃化癥狀常被誤診為柑橘黃龍病,而進行拋荒、砍伐或挖除,造成重大經濟損失。本研究利用形態學和分子生物學相結合的方法,明確了湖南省永州地區柑橘主要病原線蟲為柑橘半穿刺線蟲,平均發生率為82.1%,其中冷水灘區、零陵區和江永縣發生率比較高,土壤中的線蟲群體密度最高達到3 077條/100 mL,表明柑橘半穿刺線蟲在永州地區柑橘產區發生普遍且嚴重,是引起柑橘黃化癥狀的重要病因之一。

表1　采集樣品中柑橘半穿刺線蟲2齡幼蟲群體密度及黃龍病病菌檢測1)

1) “+”and “-”分別代表陽性和陰性結果。

"+"and "-" represent positive and negative results, respectively.

柑橘黃龍病于1919年在我國廣東省潮汕地區首次被發現[17],目前已有11個省(市、自治區)的柑橘產區遭受其危害,受害面積占柑橘種植總面積的80%以上[18]。本研究利用分子生物學方法對永州地區疑似柑橘黃龍病植株進行了檢測,結果表明所有表現黃化癥狀的柑橘樣品中僅有64.3%的樣品檢測結果呈現陽性,說明表現黃化癥狀的柑橘植株不一定都帶有黃龍病病菌。

造成柑橘黃化癥狀的病因有多種,主要包括柑橘黃龍病、柑橘線蟲病、柑橘病毒病和生理性病害等,單憑柑橘的田間黃化癥狀不易正確診斷出其病因。所以,正確快速地診斷出柑橘黃化癥的病因是有效控制病害危害和蔓延的基礎。本研究通過對表現黃化癥狀的柑橘調查取樣和檢測發現,柑橘慢衰病和柑橘黃龍病在永州地區柑橘產區發生普遍且嚴重,并且存在著混合或復合侵染現象。因此,在重點防控柑橘黃龍病的同時,也應重視并有效控制柑橘半穿刺線蟲的危害,從而保障柑橘生產安全,促進柑橘產業發展和增加農民收入。

[1]Ardakani A S, Mafi Z T, Hesar A M, et al. Relationship between soil properties and abundance ofTylenchulussemipenetransin citrus orchards, Kohgilouyeh va Boyerahmad Province[J].Journal of Agricultural Science and Technology, 2014, 16: 1699-1710.

[2]Irshad U, Mukhtar T, Ashfaq M, et al. Pathogenicity of citrus nematode (Tylenchulussemipenetrans) onCitrusjambhiri[J].The Journal of Animal & Plant Sciences, 2012, 22(4):1014-1018.

[3]張紹升. 植物線蟲病害診斷與治理[M].福州: 福建科學技術出版社, 1999: 181-183.

[4]Verdejo-Lucas S, McKenry M V. Management of the citrus nematode,Tylenchulussemipenetrans[J].Journal of Nematology, 2004, 36(4): 424-432.

[5]Safdar A, Javed N, Khan S A, et al. Synergistic effect of a fungus,Fusariumsemitectum, and a nematode,Tylenchulussemipenetrans, on citrus decline [J].Pakistan Journal of Zoology, 2013, 45(3): 643-651.

[6]馮志新.植物線蟲學[M].北京:中國農業出版社,2001:158-160.

[7]劉國坤, 張紹升, 潘東明, 等. 福建省柑橘半穿刺線蟲的分布與為害[M]∥廖金鈴, 彭德良, 段玉璽. 中國線蟲學研究(第二卷). 北京: 中國農業科學技術出版社, 2008: 93-97.

[8]Murray R G, Schleifer K H. Taxonomic notes: a proposal for recording the properties of putative taxa of procaryotes [J].International Journal of Systematic Bacteriology, 1994, 44(1):174-176.

[9]Texeira D C, Ayres J, Kitajima E W, et al. First report of a Huanglongbing-like disease of citrus in Sao Paulo State, Brazil and association of a new Liberibacter species, “CandidatusLiberibacter americanus”, with the disease [J].Plant Disease, 2005, 89(1):107.

[10]Iftikhar Y, Rauf S, Shahzad U, et al. Huanglongbing: Pathogen detection system for integrated disease management—A review [J].Journal of the Saudi Society of Agricultural Sciences, 2016, 15(1):1-11.

[11]鄧明學. 廣西柑橘黃龍病危害現狀、損失評估及控制對策[C]∥彭友良. 中國植物病理學會2006年學術年會論文集. 北京: 中國農業科學技術出版社, 2006: 393-397.

[12]劉國坤, 楊再福, 葉明珍, 等. 柑橘慢衰病診斷及其病原鑒定[J].福建農林大學學報(自然科學版), 2004, 33(4): 431-433.

[13]王江嶺, 張建成, 顧建鋒. 單條線蟲DNA提取方法[J].植物檢疫, 2011,25(2): 32-35.

[14]Liu Guokun, Chen Juan, Xiao Shun, et al. Development of species-specific PCR primers and sensitive detection of theTylenchulussemipenetransin China[J].Agricultural Sciences in China, 2011, 10(2): 252-258.

[15]Hocquellet A, Toorawa P, Bové J M, et al. Detection and identification of the twoCandidatusLiberibacter species associated with citrus Huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of theβoperon[J].Molecular and Cellular Probes, 1999, 13(5): 373-379.

[16]劉維志.植物線蟲志[M].北京:中國農業出版社,2003:547-549.

[17]Reinking O A. Diseases of economic plants in southern China[J].Philippine Agriculturist, 1919, 8(4):109-134.

[18]范國成, 劉波, 吳如健, 等. 中國柑橘黃龍病研究30年[J].福建農業學報, 2009, 24(2):183-190.

(責任編輯：楊明麗)

Identification and distribution survey of the pathogens of citrus slow decline disease and citrus Huanglongbing in Yongzhou City, Hunan Province

Song Zhiqiang1,2,Cheng Feixue2,Cheng Ju’e2,Zhang Deyong1,2,He Daijin3,Liu Yong1,2

(1. College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha410128, China; 2. Hunan Key Laboratory of Integrated Management of the Pests and Diseases on Horticultural Crops, Institute of Plant Protection, Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha410125, China; 3. Hunan Biological and Electromechanical Polytechnic, Changsha410127, China)

In order to determinate the correlation between etiolation symptoms of citrus in Hunan Province and citrus slow decline disease and citrus Huanglongbing (HLB), leaf, root and soil samples were collected from citrus with etiolation symptoms in Yongzhou City, Hunan Province and the identification and distribution survey of two pathogens were carried out based on morphological characteristics and molecular biology techniques. The results showed that the infection ofTylenchulussemipenetransand HLB pathogen were the main cause of etiolation phenomenon of citrus in this area. The average incidence rate ofT.semipenetransin collected samples was 82.1%. The highest population density of juveniles in samples was reached to 3 077 nematodes per 100 mL soil. The HLB pathogen isCandidatusLiberibacter asiaticus and the average detection rate was 64.3% in Yongzhou City. There were mixed infection ofT.semipenetransand HLB pathogen in citrus orchards and mixed infection rate was 53.6%.T.semipenetransis widely distributed in citrus growing regions of Yongzhou City, and it is the important cause of large range of etiolation symptoms of citrus. There is extremely urgent for paying attention to and effectively controllingT.semipenetrans.

citrus slow decline disease;citrus Huanglongbing;Tylenchulussemipenetrans;pathogen identification;distribution survey

2016-01-27

2016-02-29

湖南省研究生科研創新項目(CX2015B249)；國家自然科學基金(31171826)

E-mail: haoasliu@163.com

S 436.66

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.04.032