美國白蛾hcapn3基因的克隆及HcAPN3蛋白與Cry1Ac結合特性分析

王翠蘋,　趙　丹,　李少雅,　郭家萍,　郭　巍,2*,　陸秀君

(1. 河北農業大學植物保護學院, 河北省農作物病蟲害生物防治工程技術中心,保定　071001;2. 北京農學院植物科學技術學院,北京　102206)

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美國白蛾hcapn3基因的克隆及HcAPN3蛋白與Cry1Ac結合特性分析

王翠蘋1,趙丹1,李少雅1,郭家萍1,郭巍1,2*,陸秀君1

(1. 河北農業大學植物保護學院, 河北省農作物病蟲害生物防治工程技術中心,保定071001;2. 北京農學院植物科學技術學院,北京102206)

通過比對分析已知昆蟲氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)氨基酸序列并結合本實驗室的美國白蛾(Hyphantriacunea)中腸iTRAQ結果,設計了hcapn3基因特異引物,獲得hcapn3基因片段。通過RACE-PCR技術獲得美國白蛾中腸氨肽酶N基因(hcapn3)全長序列(GenBank登錄號為KJ013598)。Blastp分析表明,獲得的氨肽酶屬于氨肽酶N3家族,命名為HcAPN3。序列分析顯示HcAPN3包括952個氨基酸殘基,具有典型的谷氨酸鋅化氨肽酶(Gluzincin)結構域和羧基端(ERAP1_C)結構域。利用Bac to Bac表達系統在昆蟲細胞中表達108 kDa的 HcAPN3蛋白。在原核表達系統中表達58 kDa 的Gluzincin結構域和49 kDa ERAP1_C的結構域蛋白。Ligand Blot分析結果顯示,HcAPN3蛋白及Gluzincin結構域可與Cry1Ac蛋白特異性結合,但ERAP1_C結構域未能與Cry1Ac結合。本研究首次克隆了美國白蛾氨肽酶基因并分析了HcAPN3與Cry1Ac的結合特性,為下一步功能研究提供基礎。

美國白蛾;氨肽酶N;HcAPN3;Gluzincin結構域;Ligand Blot分析

美國白蛾[Hyphantriacunea(Drury)]是一種重要的世界性檢疫害蟲。適應性強,食性廣,繁殖能力強的特點為其大范圍傳播和為害提供了條件。該蟲現已從北美傳播至18個歐亞國家和地區[1]。1979年傳入我國以來,已迅速擴展至長江以南地區,每年給我國農林業生產造成巨大的損失[1-2]。

蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis,Bt)是目前世界范圍內產量最大、應用范圍最廣的環境友好型微生物殺蟲劑,其殺蟲蛋白基因也是目前應用得最為廣泛和最有潛力的一類抗蟲基因[2-5]。目前研究者已篩選分離出多種對美國白蛾高毒力的Bt菌株,并對其殺蟲晶體蛋白以及基因類型進行了研究,結果表明，對美國白蛾高毒力的Bt菌株中均鑒定出Cry1Ac基因型[2,6],本研究前期工作證明Cry1Ac蛋白是對美國白蛾高毒力的殺蟲晶體蛋白。

Bt Cry蛋白可與昆蟲中腸上皮刷狀緣膜(BBMV)特異性結合,從而引起昆蟲中腸結構及生理發生變化,使昆蟲死亡[7]。其在BBMV上的受體主要有4類,分別是類鈣黏蛋白(cadherin-like protein)、氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)、堿性磷酸脂酶(alkaline phosphatase,ALP)和糖脂(glycolipids)[7-11]。其中氨肽酶N是研究最多的一種重要的受體蛋白。

氨肽酶N是一種依賴于Zn2+的N-端水解酶類[9-10],存在于中腸的BBMV上[11], 是Bt毒素的重要受體之一。Knight等1994年首次從煙草天蛾中分離得到APN1，并證實其為Bt毒素的受體[12],此后,相繼從舞毒蛾[13]、煙芽夜蛾[14]、家蠶[15]、歐洲玉米螟及亞洲玉米螟[16-17]、甜菜夜蛾[18],埃及伊蚊[19]等昆蟲中克隆了APN基因,并證實其蛋白為Bt毒素的受體。目前在GenBank中已登記50多種APN基因,關于美國白蛾中腸受體蛋白的研究尚未有報道。本研究首次分離鑒定了美國白蛾中腸APN3蛋白,與Cry1Ac蛋白進行了配體印跡分析,為進一步研究美國白蛾中腸氨肽酶功能,及與Bt殺蟲蛋白相互作用機制奠定了基礎。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試昆蟲及細胞

美國白蛾(Hyphantriacunea)幼蟲采集自河北省保定市,在室內進行飼養。粉紋夜蛾(Trichoplusiani)細胞系BTI-Tn-5B1-4(High Five細胞),由青島農業大學李國勛教授惠贈。

1.1.2主要試劑

RNA提取試劑盒(RNeasy Mini Kit)購自QIAGEN公司;反轉錄試劑盒購自Promega;凝膠回收試劑盒購自天根有限公司;限制性內切酶購自寶生物工程有限公司;T4快速連接酶購自Thermo公司;大腸桿菌DH5α、BL21和DH10Bac菌種由本實驗室保存并用于制備感受態細胞;Bt(Cry1Ac)菌株由本實驗室保存,Cry1Ac蛋白抗體由河北省生物研究所制備;蛋白質定量檢測試劑盒購自上海生工生物工程有限公司;胎牛血清購自美國Invitrogen公司;昆蟲細胞培養基TNM-FH insect medium購自Sigma公司;桿狀病毒表達系統(Bac-to-Bac Baculovirus Expression System)購自美國Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1hcapn3全長基因序列的獲得

解剖美國白蛾,提取中腸并將其迅速置于液氮,用研缽研磨至粉末,按試劑盒說明書提取總RNA,檢測RNA質量。按反轉錄試劑盒說明書將1 μg總RNA 反轉錄為cDNA。利用美國白蛾中腸iTRAQ結果,經序列比對設計hcapn3基因特異引物,APNF:5′-GAACTGGGGAATGGTTAACT-3′(NWGMVN);APNR:5′-AGAACAAAACGTCGTTGAC-3′(VNDVLF)。

以合成的 cDNA 第一鏈為模板,用引物APNF和APNR進行 PCR 擴增,其擴增參數為:94 ℃預變性 3 min;94 ℃變性 45 s,51 ℃退火 45 s,72 ℃延伸 1 min,25個循環;72℃保溫 10 min,4 ℃保存。PCR產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳后,純化回收,回收產物送北京華大基因測序。根據測序結果分別設計5′RACE及3′RACE引物,APN5F:5′-CTAGTGGAGAAGTGGGCAGTGATTGAAGGGAGA-3′;APN3R:5′-CGCTATACAATCTCCGGGGTTAGGCCAGCTG-3′。按照RACE反轉錄試劑盒說明合成5′RACE和3′RACE模板,并分別進行PCR擴增。擴增參數如下:94 ℃預變性 3 min,74 ℃延伸2 min,5 個循環;94 ℃變性3 min,72 ℃退火 45 s,72 ℃延伸 2 min,5 個循環;94 ℃變性3 min,72 ℃退火 45 s,70 ℃延伸 2 min,25 個循環;4 ℃保存。擴增產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳后按照凝膠回收試劑盒說明書進行純化回收,回收產物送北京華大基因公司測序。

1.2.2hcapn3序列分析

通過CBS Prediction Server預測信號肽序列,糖基化位點,通過GPI Prediction Server分析GPI錨定位點,利用Blastp進行結構域分析,通過DNAMAN 分析開放閱讀框,等電點及蛋白分子量。

1.2.3hcapn3在昆蟲細胞系中的表達

PCR產物經純化、酶切后與載體連接。將10 μL連接產物轉化至100 μL DH5α感受態細胞,涂布于含有100 mg/L Amp的LB平板上。PCR及酶切方法鑒定陽性重組子,取1 mL菌液送至北京華大基因測序。

鑒定正確的重組子轉化大腸桿菌DH10Bac感受態細胞,37 ℃,220 r/min培養4 h,涂布于含IPTG (40 μg/mL),X-gal (100 μg/mL),Kan (50 μg/mL),Gen (7 μg/mL),Tet (10 μg/mL)的LB平板上,37 ℃培養48 h,挑取白色單克隆菌落,提取重組Bacmid DNA,進行PCR鑒定。鑒定正確的重組Bacmid DNA按照Bac to Bac 試劑盒說明,利用脂質體CellfectinⅡ reagent轉染昆蟲High Five細胞,27℃培養72 h,收集上清為第一代病毒株(P1),取P1病毒上清液感染對數生長期的High Five細胞,出現感染跡象后,500 g離心5 min收集上清液,即為擴增后的P2病毒,按此方法擴增P3病毒,病毒滴度達到1×108pfu/mL后,收集蛋白進行SDS-PAGE電泳及Western Blot分析。

1.2.4HcAPN3結構域的克隆與表達

以合成的cDNA第一鏈為模板,進行PCR擴增,參數如下:94 ℃預變性3 min;94 ℃變性45 s,65 ℃退火45 s,72℃延伸1 min,25個循環;72℃保溫10 min,4 ℃保存。

PCR產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳后純化回收,純化的PCR產物和pET30a載體經NotⅠ和XhoⅠ同時雙酶切,回收酶切產物,進行連接。將10 μL連接產物轉化至100 μL BL21感受態細胞,涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB平板上。PCR及酶切方法鑒定陽性重組子。

鑒定正確的重組子經1 mmol/L IPTG,37 ℃,220 r/min誘導蛋白表達,參照《分子克隆實驗指南》[20]進行SDS-PAGE電泳,Western Blot 分析。

1.2.5重組蛋白與Cry1Ac的配體印跡分析

參照Bravo等的方法[10]提取Cry1Ac蛋白,利用蛋白質定量檢測試劑盒測定Cry1Ac蛋白濃度。按照Cry1Ac與胰蛋白酶質量比為40∶1,于26 ℃處理4 h,獲得有活性的毒素片段。

HcAPN3重組蛋白及結構域蛋白進行SDS-PAGE電泳,轉至PVDF膜,以1% BSA封閉1 h,與胰蛋白酶消化后的Cry1Ac毒蛋白孵育1 h,洗膜,以Cry1Ac抗體為一抗,以AP偶聯的羊抗兔IgG抗體為二抗,進行Ligand Blot分析。

2　結果與分析

2.1hcapn3基因的克隆

PCR擴增獲得922 bp的目的hcapn3基因片段。5′RACE和3′RACE反應分別獲得約1.4 kb和1.7 kb的片段(圖1),RACE反應產物測序后序列拼接,獲得hcapn3的全長序列。設計特異引物進行PCR擴增得到2.9 kb的全長基因片段(圖2)。經Blastp分析可知,獲得的全長基因編碼美國白蛾氨肽酶N3,命名為hcapn3,推導的氨基酸序列與舞毒蛾APN3(GenBank登錄號:AAL26894.1)相似性最高,達65.13%。

2.2hcapn3序列分析

hcapn3基因GenBank登錄號為KJ013598,開放閱讀框為2 859 bp,編碼952個氨基酸殘基,預測分子量大小為108.2 kDa,等電點為4.84。推導的氨基酸序列N-端具有15個氨基酸的信號肽序列,C末端930,931位氨基酸殘基為預測的GPI錨定位點,含有Gluzincin 和ERAP1_C保守結構域,谷氨酸鋅化氨肽酶的保守氨基酸序列GAMEN。糖基化位點預測結果顯示HcAPN3含有2個O-糖基化位點,分別位于414和566位,6個N-糖基化位點分別位于133、373、419、641、654、930位。預測的跨膜片段位于227～245位氨基酸殘基。

圖1　hcapn3的RACE擴增產物Fig.1　Amplified products of hcapn3 by RACE-PCR

2.3hcapn3在昆蟲細胞系中的表達

重組病毒作為分泌蛋白存在于培養基中,轉染High Five細胞后48 h收集培養基,離心取上清,作為P1原代病毒,繼續感染對數生長期的High Five細胞,出現感染跡象后,離心收集上清,即為擴增后的P2病毒,繼續擴增獲取P3病毒,離心取上清進行SDS-PAGE及Western Blot分析,結果顯示HcAPN3在昆蟲細胞系中成功表達108 kDa的蛋白(圖3)。

圖2　hcapn3全長基因PCR擴增產物鑒定Fig.2　Identification of hcapn3 PCR products

圖3　HcAPN3蛋白在昆蟲細胞中表達的Western Blot分析Fig.3　Western Blot analysis of HcAPN3 proteins in insect cells

2.4HcAPN3結構域在大腸桿菌中的表達

HcAPN3結構域表達分析結果表明,37 ℃,以1 mmol/L IPTG進行誘導,Gluzincin 和ERAP1_C 兩個結構域重組蛋白得到成功表達,分別表達約58 kDa和 49 kDa的目的蛋白(圖4a～b)。

圖4　Gluzincin (a)和ERAP1_C (b)結構域原核表達的Western Blot分析Fig.4　Western Blot analysis of expressed recombination proteins at different induction time points

2.5重組蛋白與Cry1Ac蛋白的配體印跡(Ligand Blot)分析

配體印跡分析結果顯示,HcAPN3重組蛋白和Gluzincin結構域能分別與Cry1Ac蛋白結合產生108 kDa和58 kDa條帶(圖5),表明 HcAPN3重組蛋白和Gluzincin結構域可與Cry1Ac結合,而ERAP1_C結構域重組蛋白未能與Cry1Ac發生結合(圖5)。

圖5　重組蛋白與Cry1Ac的配體印跡分析Fig.5　Ligand Blot analysis of Cry1Ac toxin binding to recombinant proteins

3　討論

APN目前已被確認為是Bt毒素的受體[15-17],其作為受體的功能已被廣泛研究。然而APN同工酶家族種類較多,其結構特點也不盡相同[17],尤其在不同的物種中差異較大,不同的 Bt Cry蛋白通過與不同種類的APN互作,從而起到殺蟲作用[21]。目前研究認為各類APN在昆蟲體內同時表達,并且分子量、酶活性、糖基化特征等相似度高,使其難以分離和純化[22],因而分離鑒定APN同工酶的種類對于研究Bt Cry蛋白的殺蟲機理以及為APN的分類提供依據等都有著重要的意義。本研究通過PCR及RACE-PCR技術首次成功分離鑒定了美國白蛾APN3全長基因序列,并在昆蟲細胞系中成功表達HcAPN3全長蛋白。序列分析表明HcAPN3具有的典型氨肽酶結構特征,即屬于鋅金屬肽酶,N-末端具有信號肽,C-末端含有糖基化磷脂酰肌醇(GPI)錨定信號序列,鋅結合位點HEXXH,谷氨酸鋅化氨肽酶的保守結構GAMEN,含有Gluzincin和ERAP1_C保守結構域。

閆志利等研制的唐海1號Bt制劑2萬IU/mg 500～1 500倍液對美國白蛾防效接近100%[5]。徐明等利用Bt懸浮劑與滅幼脲的混劑對美國白蛾進行防治,結果顯示混劑對第2～3代幼蟲的毒力指數均高于100,防治效果良好[3]。陳穎等利用Bt-15A3對美國白蛾的防治試驗表明Bt-15A3水懸劑防治2～3齡、4～5齡幼蟲,200倍液用藥后3 d校正防效分別達到100%、98.00%[23]。陳月華等從Bt-15A3中鑒定出Cry1Ac基因型[24],于濤等[2]和趙煥麗等[6]在篩選對美國白蛾高毒力的Bt菌株中均鑒定出Cry1Ac基因型,本試驗前期研究證明Cry1Ac蛋白是對美國白蛾高毒力的殺蟲晶體蛋白。Wang等發現通過原核表達的棉鈴蟲APN3蛋白可與Cry1Ac發生結合[25]。本研究通過Ligand Blot分析發現昆蟲細胞系表達的HcAPN3重組蛋白可以與Cry1Ac發生特異性結合,推測其可能為Cry1Ac蛋白的結合蛋白。為了進一步驗證Cry1Ac蛋白與APN蛋白結合區域,在大腸桿菌中分別克隆和表達了hcapn3保守的Gluzincin 和ERAP1_C結構域。由于昆蟲細胞系表達蛋白周期較長,所以我們利用周期較短的原核表達系統對結構域蛋白進行表達。結果顯示Gluzincin結構域可與Cry1Ac特異結合,而ERAP1_C結構域則不能與Cry1Ac發生結合,推測Cry1Ac 與 HcAPN3的結合區域位于Gluzincin保守結構域,但HcAPN3是否為Cry1Ac蛋白的受體蛋白以及與Cry1Ac的具體結合位點還需進一步研究。本研究通過分離鑒定新的hcapn3基因,為研究美國白蛾氨肽酶基因的功能,闡明Bt Cry蛋白與受體蛋白的作用機理奠定理論基礎。

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(責任編輯：楊明麗)

Cloning of midgut aminopeptidasehcapn3 gene fromHyphantriacuneaand binding to Cry1Ac toxin of HcAPN3

Wang Cuiping1,Zhao Dan1,Li Shaoya1,Guo Jiaping1,Guo Wei1,2,Lu Xiujun1

(1. College of Plant Protection, Agricultural University of Hebei, Biological Control Centre of Plant Diseases and Pests of Hebei, Baoding071001, China; 2. Plant Science and Technology College, Beijing University of Agriculture, Beijing102206, China)

The specific primers of aminopeptidase N gene were designed, and a fragment ofhcapn3 was obtained by PCR method. A full-length gene (GenBank accession no. KJ013598) encoding APN ofHyphantriacuneawas obtained by RACE-PCR method based on the sequences of published APNs from insects and iTRAQ ofHyphantriacuneamidgut. Analysis of the protein sequences by NCBI Blastp revealed that it belonged to aminopeptidase N gene family 3, named HcAPN3. The primary structure of HcAPN3 contained 952 amino acids residues, a typical Gluzincin aminopeptidase family domain and ERAP1_C domain. Thehcapn3 gene was successfully expressed in insect cells as secreted proteins (108 kDa) using recombinant baculoviruses (Bac to Bac system). Further, the Gluzincin aminopeptidase family domain and ERAP1_C-like C-terminal domain were expressed inE.colias 58 kDa and 49 kDa proteins by SDS-PAGE analysis, respectively.InvivoLigand-Blotting study demonstrated binding of Cry1Ac toxin to both HcAPN3 and peptidase Gluzincin family domain, not to ERAP1_C domain. The first identified aminopeptidase N fromH.cuneamay be a candidate receptor for Cry1Ac toxin.

Hyphantriacunea;aminopeptidase N;HcAPN3;Gluzincin domain;Ligand Blot analysis

2015-02-05

2015-04-16

國家現代農業產業技術體系(CARS-14); 國家自然科學基金(34711775); 北京農學院促進人才培養綜合改革專項計劃(BNRC&CC201404)

E-mail:guowei@hebau.edu.cn

S 433.4;S 763.3

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.02.010