自發性高血壓大鼠心肌組織Ets-1及CTGF的表達變化及意義

郝廣華， 韓振華， 袁海峰， 靳耀鋒， 高登峰， 董　新

(1西安交通大學醫學院第二附屬醫院心內科，西安　710004； 2西安交通大學醫學院第二附屬醫院腦病科； 3西安交通大學醫學院第二附屬醫院病理科；*通訊作者，E-mail: guanghua-h@163.com)

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自發性高血壓大鼠心肌組織Ets-1及CTGF的表達變化及意義

郝廣華1*， 韓振華1， 袁海峰2， 靳耀鋒3， 高登峰1， 董新1

(1西安交通大學醫學院第二附屬醫院心內科，西安710004；2西安交通大學醫學院第二附屬醫院腦病科；3西安交通大學醫學院第二附屬醫院病理科；*通訊作者，E-mail: guanghua-h@163.com)

目的研究自發性高血壓大鼠(SHR)心肌組織轉錄因子Ets-1及其下游結締組織生長因子(CTGF)的表達，探討其與心室重構的關系。方法16、32周齡Wistar-Kyoto(WKY)大鼠和16、32周齡SHR。采用稱重方法測定心臟重量/體重，尾套測壓法測量各組大鼠尾動脈收縮壓(SBP)，Masson染色觀察左心室膠原沉積，實時定量RT-PCR及免疫組織印跡方法檢測左心室Ets-1及CTCF的表達。結果與同周齡WKY大鼠相比，SHR的SBP及心臟重量/體重顯著升高(P<0.05)，左心室膠原纖維沉積明顯增多，左心室Ets-1及CTGF mRNA及蛋白表達水平均顯著增高(均P<0.05)，且32周齡SHR左心室Ets-1及CTGF mRNA表達及蛋白表達水平高于16周齡SHR。結論隨著SHR周齡的增加、SBP的升高和心室重構的加重，其左心室Ets-1及CTGF顯著增高。提示Ets-1可能是參與調控心室重構的一個重要因子。

自發性高血壓；心室重構；Ets-1；結締組織生長因子

高血壓的流行已經是威脅公眾健康的重大問題。高血壓誘發的心室重構以心肌細胞肥大及成纖維細胞增殖、膠原及細胞外基質沉積為主要特征，可導致心臟收縮及舒張功能障礙，是心力衰竭的病理基礎，與心律失常、猝死以及心力衰竭的發生發展密切相關，因此是心臟事件的獨立危險因素[1]。

轉錄因子Ets-1屬于Ets (E-twenty-six)轉錄因子家族，在細胞增殖、分化、凋亡、代謝及組織重塑等多種生物學過程中發揮著重要效應。其主要通過調節一些編碼細胞外基質成分及與基質降解有關的酶類等基因的表達參與組織重塑過程[2,3]。我們近期的一項研究提示Ets-1參與調控血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)誘發的心臟成纖維細胞增殖、結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)合成及釋放，從而參與了心肌纖維化病變[4]。本實驗擬以自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR)為研究對象，觀察其左心室組織Ets-1及CTGF的表達情況，探討其在高血壓心室重構中的作用。

1　材料及方法

1.1實驗動物

24只不同周齡SHR和Wistar-Kyoto(WKY)大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK(滬)2007-0005。將動物分為WKY(16,32周)組和SHR(16,32周)組，每組6只。動物飼養于室溫23 ℃左右，12 h明暗交替的環境中，允許自由飲食。所有實驗操作已得到西安交通大學醫學院動物倫理委員會批準。

1.2主要試劑

兔抗Ets-1多克隆抗體、生物素化山羊抗兔IgG購自美國Santa Cruz公司。兔抗CTGF多克隆抗體購自英國ABCAM公司。SYBR ExScriptTMRT-PCR試劑盒購自日本Takara公司。

1.3大鼠血壓測量及心肌組織標本采集

各組大鼠稱重并測血壓，采用尾套測壓法測量尾動脈收縮壓(systolic blood pressure，SBP)，取3次測量的平均值。經水合氯醛腹腔麻醉(0.35 mg/kg)后，打開胸腔，迅速分離并取出心臟，投入預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)液中，洗凈殘血并去除大血管，稱重后去除心房及右心室，沿垂直于心臟長軸方向將左心室分為兩部分，一部分放入4%多聚甲醛液固定，石蠟包埋；另一部分分為數塊投入液氮中保存，用于組織mRNA及總蛋白的提取。

1.4左心室膠原纖維 Masson染色

4%多聚甲醛固定液固定組織，石蠟包埋切片，厚度為5 μm，常規脫蠟至水，置Masson復合染液中8 min，0.2%醋酸水溶液清洗2次，再置入1%磷鎢酸中15 min，0.2%醋酸水洗2次，至亮綠染液40 s，0.2 %醋酸水溶液清洗2次，滴度酒精脫水；二甲苯透明，中性樹膠封片。倒置顯微鏡下觀察，膠原纖維呈綠色，心肌纖維呈紅色。

1.5實時定量RT-PCR檢測Ets-1及CTGF mRNA表達

用TRIzol試劑提取心肌組織總RNA，測定260 nm和280 nm處的吸光度(OD)，計算RNA濃度；按SYBR ExScriptTMRT-PCR試劑盒說明進行逆轉錄。GAPDH引物序列為：上游 5′-GCC TTC TCC ATG GTG GTG AA-3′；下游 5′-GGT CGG TGT GAA CGG ATT TG-3′；擴增產物長度為309 bp。Ets-1引物序列為：上游 5′-TGA TGT GGG CTG TGA ATG AG-3′；下游 5′-TGA AGT AAT CCG AGG TGT AAC G-3′；擴增產物長度為262 bp。CTGF引物序列為：上游 5′-AAG AAG ACT CAG CCA GAC C-3′；下游 5′-AGA GGA GGA GCA CCA AGG-3′，擴張片段長度為260 bp。按實時定量PCR試劑盒說明構建PCR反應體系后采用ABI PRISM 7000 sequence detection PCR system在下述條件擴增：94 ℃預變性10 s；進入循環，95 ℃ 5 s，60 ℃退火、延伸31 s，共45個循環。每樣本做3個復管。用ABI primer 7000 SDS軟件求出各樣本的CT值，以2-ΔΔCt法計算各組RNA表達與正常對照比較的Folds值。

1.6免疫印跡檢測 Ets-1及CTGF蛋白表達

用裂解液(RIPA)裂解組織后提取總蛋白，采用 BCA法測定蛋白含量。稀釋蛋白樣品為10 μg/μl，加入上樣緩沖液后煮沸10 min后離心，進行8% SDS-PAGE凝膠電泳并電轉至PVDF膜上，封閉緩沖液封閉1 h，分別滴加兔抗大鼠Ets-1抗體(1∶200)、兔抗大鼠CTGF抗體(1∶1 000)、β-actin抗體(1∶200)，4 ℃孵育過夜，生物素化山羊抗兔IgG孵育45 min，TBST洗膜，置于化學發光試劑中反應1-3 min；常規方法顯影定影，拍照后采用Gel Doc 2000系統行拍照及灰度分析。

1.7統計學分析

2　結果

2.1大鼠體重、收縮壓和心臟重量/體重變化

與同周齡WKY組相比，16及32周齡SHR組的收縮壓顯著增加(P<0.05，見表1)，且隨周齡的增加，SHR的血壓呈明顯升高趨勢，由16周的(134.9±9.0)mmHg升至32周的(153.7±13.3)mmHg。16周及32周SHR大鼠的心臟重量/體重也較同周齡WKY明顯增加(P<0.05)，32周SHR的心臟重量/體重明顯高于16周齡SHR。

表1大鼠的體重、收縮壓和心臟重量/體重

Table 1Comparison of body weight, SBP, heart weight/body weight between SHR and WKY rats

周齡組別體重(g)收縮壓(mmHg)心臟重量/體重(mg/g)16周WKY351.8±16.3103.2±4.33.2±0.1SHR287.1±18.6134.9±9.0*4.1±0.1*32周WKY439.3±18.1104.5±5.23.2±0.1SHR363.9±10.7153.7±13.3*4.5±0.1*

與同周齡WKY大鼠相比，*P<0.05

2.2大鼠左心室膠原含量變化

Masson 染色可見SHR的心肌細胞肥大，心肌間質及血管旁藍綠色的膠原纖維組織明顯增多，排列紊亂(見圖1)，且隨周齡增加，膠原染色明顯增加。WYK組心肌間隙清晰可見，膠原纖維分布稀疏，著色淡。膠原纖維染色在不同WKY周齡組間變化不明顯。

2.3大鼠左心室Ets-1及CTGF mRNA表達

實時定量RT-PCR結果表明，與同周齡WKY組相比，SHR組左心室心肌組織Ets-1及CTGF mRNA表達水平顯著增高(P<0.05)，且32周 SHR左心室Ets-1及CTGF mRNA表達高于16周SHR。不同周齡WKY組大鼠心肌細胞Ets-1及CTGF表達無明顯變化(見圖2)。

A.16周WKY組　　　　　B.32周WKY組　　　　　C.16周SHR組　　　　　D.32周SHR組圖1　各組大鼠心肌膠原染色 (Masson，×200)Figure 1　Masson staining of left ventricular collagen fiber of rats (×200)

A.Ets-1 mRNA表達　　　　　　　　　　　　　B.CTGF mRNA表達與同周齡WKY大鼠相比，*P<0.05圖2　實時定量RT-PCR示各組大鼠心肌組織Ets-1 及CTGF mRNA的表達Figure 2　 Real-time RT-PCR analysis of Ets-1 and CTGF mRNA levels in left ventricle of rats

2.4大鼠左心室Ets-1及CTGF蛋白的表達

采用免疫印跡實驗方法觀察各組大鼠左心室心肌組織中Ets-1及CTGF蛋白的表達水平。如圖 3所示，SHR的心肌組織中Ets-1蛋白的表達顯著高于同周齡WKY組(P<0.05)。且32周 SHR的Ets-1蛋白表達較16周者增高。大鼠左心室CTGF蛋白的表達變化同Ets-1變化一致(見圖4)。

3　討論

高血壓心室重構對心臟的收縮及舒張功能起決定性作用，介導該結構變化的關鍵因素仍未完全闡明。Ang Ⅱ作為腎素-血管緊張素系統的主要效應分子，通過激活其Ⅰ型受體(AT1)，促進心肌細胞及心臟成纖維細胞增殖、分化、合成和分泌大量細胞外基質蛋白，及促纖維化因子如CTGF，在心室重構中具有極其重要的作用[5]。

研究證實，多種組織的纖維化重構過程可誘導Ets-1過表達。Ets-1又可進一步調控一些編碼細胞外基質成分的重要基因以及與基質降解密切相關的酶類的表達[6,7]。這些研究提示，Ets-1可能是介導組織重構的一個重要因子。在本研究中，隨著SHR血壓的升高以及心肌肥厚的發展，Ets-1的mRNA及蛋白表達持續升高。提示Ets-1可能參與了高血壓心室重構的病理過程。既往亦有研究證實，Ets-1參與Ang Ⅱ誘發的腎臟纖維化[2]、TNF-α誘導的支氣管成纖維細胞 MMP-9 的表達[8]、以及肝臟星狀細胞的活化[9]，從而參與多種組織的纖維化及修復過程。我們近期的研究表明在大鼠心臟成纖維細胞中，Ang Ⅱ通過AT1受體介導，激活PKC、ERK及JNK等信號轉導通路，從而誘導Ets-1基因的表達[4]。據此我們推測，SHR心肌組織中Ets-1表達的增高，可能也與上述信號轉導機制有關。當然，壓力負荷及其他促纖維化因子如TGF-β對心肌組織Ets-1的表達調節需要進一步研究來闡明。

圖3　免疫印跡方法示各組大鼠左心室Ets-1蛋白的表達Figure 3　Western blot analysis of Ets-1 protein levels in left ventricle of rats

圖4　免疫印跡方法示各組大鼠左心室CTGF蛋白的表達Figure 4　Western blot analysis of CTGF protein levels in left ventricle of rats

CTGF屬于生長因子CCN家族成員。其在成纖維細胞中表達且參與觸發多種促纖維化的細胞過程。近期研究顯示，心臟成纖維細胞中CTGF表達的上調是Ang Ⅱ誘發心臟重塑的一個重要介導因素[10]。而且，Ets-1可通過結合于CTGF啟動子的Ets-1結合序列而誘發CTGF的表達，表明CTGF也是Ets-1的下游靶基因[11]。在本實驗中，SHR肥厚的左心室組織Ets-1表達上調，同時伴隨著CTGF表達的上調。提示Ets-1可能參與調節CTGF的促心室重構作用。我們近期的研究表明，轉錄因子Ets-1通過參與調控心臟成纖維細胞增殖、CTGF等促組織纖維化因子的表達。從而可能介導了心肌重構過程[4]。

綜上所述，本研究表明隨著SHR周齡的增加、血壓的升高及心肌纖維化的加重，其左心室Ets-1及CTGF顯著升高。提示Ets-1可能是心肌纖維化過程的一個重要介導因素。本研究結果為進一步揭示心室重構這一病理過程提供了實驗依據。

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Myocardial expression of Ets-1 and CTGF in spontaneously hypertensive rats and its relationship with cardiac remodeling

HAO Guanghua1*, HAN Zhenhua1, YUAN Haifeng2, JIN Yaofeng3, GAO Dengfeng1, DONG Xin1

(1DepartmentofCardiology,SecondAffiliatedHospital,Xi’anJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Xi’an710004,China;2DepartmentofEncephalopathy,SecondAffiliatedHospital,Xi’anJiaotongUniversitySchoolofMedicine;3DepartmentofPathology,SecondAffiliatedHospital,Xi’anJiaotongUniversitySchoolofMedicine;*Correspondingauthor,E-mail:guanghua-h@163.com)

ObjectiveTo investigate the expression of Ets-1 and connective tissue growth factor(CTGF) in left ventricle of spontaneously hypertensive rats(SHR), and to explore the role of Ets-1 in cardiac remodeling.MethodsDifferent age of Wistar-Kyoto(WKY) rats and SHR were divided into WKY(16, 32 weeks old) groups, SHR(16, 32 weeks old) groups. Systolic blood pressure(SBP) of rats was measured by tail cuff method. The ratio of heart weight to body weight was measured. Left ventricular fibrosis was detected by Masson staining. The expression levels of Ets-1 and CTGF mRNA and protein were analyzed by real-time RT-PCR and Western blot, respectively.ResultsIn comparison with WKY rats with the same age, SBP and the ratio of heart weight to body weight were significantly raised in SHR(P<0.05), left ventricular fibrosis in SHR was increased, and the mRNA and protein expression levels of Ets-1 and CTGF were increased(P<0.05). The expression levels of CTGF mRNA and protein were significantly higher in 32-weeks-old SHR than in 16-weeks-old SHR.ConclusionTranscriptional factor Ets-1 is a potential mediator in cardiac remodeling of hypertension.

spontaneous hypertension;cardiac remodeling;Ets-1;connective tissue growth factor

國家自然科學基金資助項目(30900693)；陜西省社會發展科技攻關基金資助項目(2015SF021)

郝廣華，女，1978-05生，博士后，主治醫師，E-mail：guanghua-h@163.com.

2016-01-23

R544.1

A

1007-6611(2016)03-0195-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.03.001