三種核酸提取方法檢測丙肝HCV-RNA定量的比較

韓若冰， 辛毅娟， 文　靜， 張　榮， 張金花， 楊　柳

(第四軍醫大學西京醫院全軍臨床檢驗醫學中心，西安　710032; *通訊作者,E-mail: zhangzh@fmmu.edu.cn)

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三種核酸提取方法檢測丙肝HCV-RNA定量的比較

韓若冰， 辛毅娟， 文靜， 張榮， 張金花， 楊柳*

(第四軍醫大學西京醫院全軍臨床檢驗醫學中心，西安710032;*通訊作者,E-mail: zhangzh@fmmu.edu.cn)

目的比較及評價3種不同核酸提取方法檢測HCV-RNA結果的差異。方法依照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)EP9-A2 文件規定，收集40個新鮮血清標本，分別使用磁珠法、柱提法、手工法丙肝試劑以及Roche試劑進行平行檢測，記錄測定結果，計算線性方程及相關系數，并對其進行偏倚評估。 結果磁珠法和柱提法試劑與Roche試劑方法間的相關性良好(r>0.975)，而手工法與Roche試劑方法檢測結果間差異超出預設允許誤差范圍。結論各方法學的試劑與Roche試劑檢測結果大致相關性尚可，其中磁珠法結果較好。

丙肝病毒;磁珠法;核酸提取

丙肝是由丙肝病毒(hepatitis virus C，HCV)引起的肝病，HCV是單股正鏈RNA病毒。據世界衛生組織統計，全球約有2億人感染慢性丙肝，并面臨發生肝硬化和/或肝癌的風險[1]。丙肝病毒具有很強的傳染性，而且其發病沒有明顯的臨床癥狀，容易失去早期治療機會[2]。只有確診血清HCV-RNA定量陽性的丙肝患者，才需要抗病毒的治療[3]。現各大醫院多采用磁珠法、柱提法、手工法進行丙肝RNA定量檢測。

為此，我們按照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)指南文件EP9-A2要求對國產這3種方法學試劑對丙肝RNA病毒定量試劑檢測結果進行了比對和偏倚評估，以了解不同方法學試劑在檢測HCV-RNA定量時是否存在差異以及可比性。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1標本收集參照文件EP9-A2[2]，收集2014-07～2015-08在本院就診做高敏丙肝病毒RNA檢測時的EDTA抗凝血標本40例。將標本按4 000 r/min離心2 min，留取血漿冷凍于-80 ℃冰箱保存。

1.1.2試劑與儀器試劑A，B，C(試劑A為磁珠法提取試劑盒，試劑B為柱提法試劑盒，試劑C為手工法提取試劑盒)由廣州中山達安公司提供；檢測下限均為1×103IU/ml，試劑D由Roche診斷產品有限公司提供，檢測下限是15 IU/ml。試劑A用和實公司生產的SMART32核酸提取儀提取丙肝RNA，試劑B,C按試劑盒步驟手工操作，試劑A，B，C均使用廣州中山達安試劑盒在ABI7500擴增儀進行擴增，試劑D用羅氏COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 48檢測系統及其配套試劑，實驗所用試劑均在有效期內，儀器均已進行校準。

1.2方法

1.2.1樣本測定每天收集檢測范圍均勻分布的40份患者血漿標本，連續5 d，共40份樣本。每份樣本均嚴格按照試劑盒A,B,C,D說明書操作，同時各自進行雙份測定，測定順序依1-8測定第1次，再按反序8-1測定第2次，以減少交叉污染及漂移對重復測定標本平均值的影響，順序中的濃度應盡可能隨機排列。同一標本均在2 h內完成方法學測定。

1.2.2作圖及線性關系的目測檢查以Roche檢測系統的測定結果為X，其余各方法學試劑的檢測結果為Y，經組內、組間離群值檢驗后，作散點圖。據圖目測評價圖的相對線性、足夠范圍和離散的均勻性。從散點圖中可以較為直觀地看出各方法學試劑與Roche試劑方法間的差別。

1.2.3離群值檢查根據文獻[4]，對各系統內和方法間進行組內與組間離群值檢查。

1.2.4X值合適范圍的檢驗根據文獻進行相關系數計算[4]，如果r≥0.975，則認為X范圍適合，數據滿足要求。X的誤差可以由數據范圍給以適當補償，并且簡單的線性回歸可以用來評價斜率(b)和截距(a)。

1.2.5線性回歸分析根據文獻[4]，計算兩個方法間的線性回歸方程：Y=a+bX。

1.2.6預期偏倚及可信區間計算根據文獻[4]，在醫學決定水平，利用回歸方程計算預期偏倚及95%可信區間，以預設的允許誤差10%為限，將預期偏差的可信區間與之進行比較，當預期偏差可信區間的下限<允許誤差<預期偏差可信區間的上限時，實驗方法與比對方法相當；當預期偏差可信區間的上限<允許誤差時，實驗方法與比對方法相當，偏差可接受；預期偏差可信區間的下限>允許誤差時，實驗方法與比對方法不相當，偏差不可接受。

1.3統計學方法

首先對HCV-RNA病毒載量數據進行對數轉換，用SPSS19.0軟件進行統計處理、作圖分析及偏差評估計算。

2　結果

2.1散點圖分析

結果顯示，磁珠法、柱提法與Roche試劑HCV-RNA測定值呈直線關系(見圖1-3)，說明其方法間相關性較好，手工法略差。

2.2X值合適范圍的檢驗及線性回歸分析

表1結果顯示，其中達安手工法r=0.973<0.975,其誤差稍大，其余各方法學與Roche的高敏磁珠法相比，r≥0.975，說明測定范圍足夠寬，誤差的影響可以忽略，也說明回歸統計的斜率b和截距a可靠。

圖1　達安磁珠法單個檢測值對Roche均值散點圖Figure 1　Scatter plot of Daan magnetic beads individual values to Roche mean value

圖2　達安柱提法單個檢測值對Roche均值散點圖Figure 2　Scatter plot of Daan column extraction individual values to Roche mean value

圖3　達安手工法單個檢測值對Roche均值散點圖Figure 3　Scatter plot of Daan manual individual values to Roche mean value

表1各方法學相關系數及直線回歸方程

Table 1The correlation coefficient and the linear regression equation of three methods

實驗方法比對試劑r直線回歸方程達安磁珠法Roche0.977Y=0.176+0.962X達安柱提法Roche0.975Y=0.111+0.929X達安手工法Roche0.973Y=0.272+0.929X

2.3偏差估計

計算預期偏差及其可信限范圍，根據EP9-A2文獻提供的公式[4]，并選擇1 000 IU/ml作為HCV-RNA的檢測限[5,6]，對預期偏倚及可信區間進行計算,判斷兩種檢測方法是否相當。我們以預設的允許誤差10%為限，按照“二分之一允許誤差”的標準[7]，計算得其允許偏倚為50 IU/ml，由回歸方程計算的預期偏差見表2，結果顯示，磁珠法試劑的預期偏差95%可信區間上限小于50 IU/ml，說明其與Roche試劑偏倚可接受，試劑間檢測結果具有良好的可比性，而柱提法和手工法試劑的預期偏差95%可信區間下限>50 IU/ml，說明其測定結果與Roche試劑測定結果間的差異較為顯著，超出了預設的允許誤差范圍，方法間所得的檢測結果不一致。

表2預期偏倚與可信區間的比較

Table 2Comparison of expected bias and confidence interval

實驗方法比對方法預期偏差95%的可信區間(IU/ml)下限上限偏倚評估達安磁珠法Roche3549可接受達安柱提法Roche162199不可接受達安手工法Roche239286不可接受

3　討論

患者體內的HCV-RNA病毒的有效清除與丙肝治療的反應以及降低相關并發癥的危險性息息相關[8]。高敏感度HCV-RNA定量檢測已經成為丙肝治療監測的趨勢。國際公認進口Roche試劑為檢測HCV-RNA定量的參比試劑。進口試劑靈敏度高、精密度好，操作簡便，無人為干擾，但試劑成本較高，儀器價格昂貴，檢測時間長，需要血漿量大。國產試劑基本為開放試劑，由于其試劑成本低廉，普及率很高。

筆者將三種方法學的HCV-RNA定量檢測國產試劑與進口高敏感度試劑進行比較。磁珠法核酸提取是以磁珠為載體，利用磁珠在高鹽低pH值下吸附核酸，在低鹽高pH值下與核酸分離的原理，再通過移動磁珠或轉移液體來實現核酸的整個提取純化過程[9]。而柱提法是試劑盒的膠回收柱采用特殊硅基質材料在一定的高鹽緩沖系統下高效、專一地吸附DNA的原理，以離心吸附柱式結構高效回收核酸片段[10]。而手工法提取HCV-RNA原理則是一種簡化的酸性異硫氰酸胍-酚-氯仿抽提。

本實驗根據CLSI EP9-A2文件的流程[4]，對國內3種方法學試劑的測定結果進行比對。結果顯示，各試劑的檢測結果的重復性均較好，基本沒有方法內和方法間離群值。以進口Roche試劑的檢測系統為比較方法時，其余三種試劑與其線性關系良好，說明各試劑與Roche試劑的相關性尚可。進一步我們通過偏差估計發現，磁珠法與Roche試劑偏倚可接受，說明磁珠法與Roche試劑的檢測結果具有較好的符合率，其原因可能是由于兩種試劑方法原理一致，磁珠法是半自動化提取，人為干擾因素較小。而柱提法和手工法試劑測定結果與Roche試劑測定結果間的差異較為顯著，由回歸方程計算的預期偏差超出了允許誤差范圍，可見，柱提法、手工法試劑與Roche試劑所得的檢測結果不一致。其原因可能為：①廠家引物保守序列設計不同，或試劑引物設計序列與HCV某些基因型不相匹配所致。②這兩種方法均需手工操作，步驟較多，容易出現人為干擾因素。③在實驗室環境中，常常會出現RNA酶對HCV-RNA的抑制現象，可能產生假陰性的結果。

以上三種方法基本涵蓋目前臨床上丙肝RNA定量檢測的所有核酸提取方法，Roche全自動檢測系統因其無人為干擾、檢測限低，精密度好，靈敏度和特異性高而被國際指南推薦，而國產試劑中，磁珠法相比較有操作簡便、費用低廉、與Roche試劑比較偏倚度低等優點，更合適廣泛普及。

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Comparison of three nucleic acid extraction methods in detecting HCV-RNA

HAN Ruobing,XIN Yijuan,WEN Jing,ZHANG Rong,ZHANG Jinhua, YANG Liu*

(CenterofClinicalLaboratoryMedicineofPLA,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China;*Correspondingauthor，E-mail:zhangzh@fmmu.edu.cn)

ObjectiveTo compare and evaluate the efficacy of the three different nucleic acid extraction methods for HCV-RNA determination.MethodsAccording to US National Clinical Laboratory Standards Committee(CLSI) EP9-A2,40 fresh serum samples were collected for parallel detection of HCV RNA reagents by magnetic beads, column extraction， manual method and Roche reagents. The results were recorded to calculate the linear equations and correlation coefficients, and estimate the bias.ResultsThe correlation of magnetic beads method and column extraction reagent to Roche reagent were good(r>0.975).Compared with Roche reagent, the expected bias of the results detected by manual method was less than the allowable error region.ConclusionCompared with other methods, the detection results of magnetic beads method are better consistent with Roche reagents.

HCV RNA;magnetic beads;nucleic acid extraction

韓若冰，女，1984-06生，本科，主管技師，E-mail:hanruobing1984@126.com

2015-12-18

R446

A

1007-6611(2016)03-0215-03

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.03.005