Id-1在結直腸癌中的表達及其臨床意義

武雪亮, 王立坤, 薛　軍*, 楊東東, 屈　明, 郭　飛, 楊瑞敏, 劉　博

(1河北北方學院附屬第一醫院血管腺體外科，張家口 075000； 2河北北方學院附屬第一醫院超聲醫學科； 3河北北方學院附屬第一醫院病理科；*通訊作者，E-mail：yfyxuejun@163.com)

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Id-1在結直腸癌中的表達及其臨床意義

武雪亮1, 王立坤2, 薛軍1*, 楊東東1, 屈明1, 郭飛1, 楊瑞敏2, 劉博3

(1河北北方學院附屬第一醫院血管腺體外科，張家口 075000；2河北北方學院附屬第一醫院超聲醫學科；3河北北方學院附屬第一醫院病理科；*通訊作者，E-mail：yfyxuejun@163.com)

目的研究DNA結合分化抑制蛋白1(Id-1)在結直腸癌組織中的表達及其與臨床病理參數間的相關性。方法選取我院結直腸癌和正常黏膜組織各50例，應用逆轉錄聚合酶鏈反應法(RT-PCR)和蛋白質印跡法(Western blot)檢測兩組中Id-1 mRNA和蛋白質的表達情況，并應用免疫組化法(SP)檢測Id-1在兩組中的表達，分析Id-1在結直腸腫瘤發生、發展中的作用。結果結直腸癌組織中Id-1 mRNA的表達水平較正常組織高(0.96±0.03vs0.20±0.04，P=0.011)；Id-1蛋白在結直腸癌組織中的表達水平亦較正常組織高(0.82±0.04vs0.31±0.02，P=0.020)。免疫組化顯示Id-1在結直腸癌組織組中陽性表達明顯高于正常黏膜中的表達，差異有統計學意義(72.00%vs24.00%，χ2=23.431，P=0.000)。Id-1表達與腫瘤漿膜浸潤、TNM分期、淋巴結轉移、肝轉移及脈管浸潤等密切相關(均P<0.01)，而與腫瘤大小及分化程度無關(P>0.05)。結論Id-1的特異性高表達與結直腸腺癌的發生、發展具有較高的相關性，有望成為特異性較高的腫瘤標志物。

DNA結合分化抑制蛋白1；結直腸腫瘤；逆轉錄聚合酶鏈反應；Western blot；免疫組化

DNA結合分化抑制蛋白1(inhibitors of DNA binding-1,Id-1)是近年來研究較熱的一種致癌基因, 動物實驗表明其可促進細胞增殖，誘導腫瘤血管生成，促進腫瘤生長侵襲，加速腫瘤生長并轉移[1,2]。目前已證實Id-1在乳腺癌、宮頸癌、食管癌等多種惡性腫瘤中呈高表達狀態[3-5]，但在結直腸方面研究較少。本研究通過對Id-1行免疫組織化學染色、RT-PCR和Western blot分析檢測，旨在探討Id-1在結直腸癌中的表達情況及其與相關臨床病理因素間的關系。

1　材料與方法

1.1病例資料

收集2012-05～2014-05河北北方學院附屬第一醫院血管腺體外科手術切除的結直腸癌組織50例和正常組織50例，癌組織取自癌灶中心處，另取標本殘端切緣經病理證實為正常腸組織。全部病例均為原發性腫瘤，且術前未行新輔助放化療等針對性治療。其中男 ∶女為29 ∶21,年齡33-71歲，平均(51.2±2.9)歲;正常結直腸組織中,男 ∶女為28 ∶22,年齡33-69歲，平均(52.0±2.1)歲。兩組一般資料具有可比性(P>0.05)。1.2主要試劑與實驗方法

1.2.1主要試劑兔抗人單克隆濃縮型Id-1抗體(ab50932 R2-1G6)，購于香港abcam公司；兔抗人GAPDH多克隆一抗(ab54621 R2-3)、羊抗兔二抗(ab5214 R2-2)，購于美國Santa Cruz公司；總RNA提取試劑、反轉錄試劑盒、SDS-PAGE標準指示劑、BCA蛋白定量試劑盒均購自Fementas公司；RIPA試劑購自Solarbio公司；DAB顯色劑購于TIANGEN公司。引物由TaKara生物工程公司合成。

1.2.2RT-PCR法檢測Id-1 mRNA表達提取并測定總RNA濃度，設計Id-1上游引物：5′-CTGAGGCACTGGCGAGGAGA-3′，下游引物：5′-GAGAAGCACCAAACGTGACCAT-3′，擴增長度140 bp；GAPDH(內參)上游引物：5′-ACCCACTCCTCCACCTTGA-3′，下游引物：5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCC-3′，擴增長度：107 bp。反應體系：1×PCR Buffer 2.5 μl，dNTP 0.5 μl，cDNA模板2 μl，Taq酶1.25 U，上下游引物各1 μl，RNA酶抑制劑1 μl，反應總體積25 μl。根據試劑盒說明書操作進行擴增：以1 μlDNA樣本作為模板，以去離子水為陰性對照模板；擴增條件為95 ℃預變性2 min；95 ℃10 s，退火溫度15 s，72 ℃延伸45 s，共35個循環；最后72 ℃再延伸10 min。產物于2%瓊脂糖凝膠后電泳分離，于紫外線燈下觀察結果。

1.2.3Western blot法檢測Id-1蛋白表達RIPA裂解液提取總蛋白并定量。取50 μg蛋白，置入5×緩沖液(4∶1)，100 ℃水浴，5 min 3次，8%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，后轉至PVDF膜，取出膜，加5%脫脂奶粉封閉，棄封閉液滴加特異性的一抗(Id-1：1∶1 500；GAPDH：1∶150)4 ℃孵育過夜，加TBST洗滌液，10 min 3次，滴加特異性二抗(1∶1 500)37 ℃孵育1 h，再次加入TBST洗滌液，10 min 3次，ECL法檢測條帶，進行密度定量分析。

1.2.4免疫組織化學染色檢測Id-1蛋白表達10%甲醛溶液固定部分標本，石蠟包埋，切片厚度為4 μm，使用蘇木精-伊紅(hematoxylin-esin，HE)染色方法，病理診斷。切片經80 ℃烤箱烤片30 min，乙醇脫水，滅活內源性過氧化物酶，枸櫞酸緩沖液高溫高壓水化修復；PBS洗3次，加一抗，4 ℃過夜；PBS洗3次，加二抗。室溫下DAB顯色，蘇木精輕度復染，并用1%的鹽酸乙醇分化5 min、流水沖5 min、梯度乙醇脫水、松節油透明5 min，最后樹膠封片，陰性對照為PBS代替一抗。

Id-1陽性表達的判定：細胞質中染有棕黃色，褐色顆粒為陽性細胞，計算陽性細胞百分比并評分，≤5%為0分，6%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，>75%為4分；無著色:0分，淺黃色:1分，黃色:2分，深黃色:3分。兩者相乘，0分為(-),1-4分為(+),5-8分為(++),9-12分為(+++),(+)-(+++)均視為陽性。

2　結果

2.1Id-1的RT-PCR檢測結果

以Id-1/GAPDH比值作為RT-PCR定量分析，癌組織中Id-1 mRNA 的表達水平明顯高于結直腸正常組織，差異具有統計學意義(0.96±0.03vs0.20±0.04，P=0.011,見圖1)。

1，3.結直腸癌組； 2，4.結直腸正常組圖1　RT-PCR檢測結直腸癌及正常腸黏膜組織Id-1 mRNA的表達Figure 1　Expression level of Id-1 mRNA in colorectal adenocarcinoma and normal colorectal tissues detected by reverse-transcription polymerase chain reaction

2 2Id-1的Western blot檢測結果

以Id-1/GAPDH比值做蛋白定量檢測，Id-1蛋白在結直腸癌組織中的表達水平亦較結直腸正常組織高，差異具有統計學意義(0.82±0.04vs0.31±0.02，P=0.020,見圖2)。

1，3. 結直腸癌組； 2，4.結直腸正常組　　圖2　Western blot印跡法檢測結直腸癌及正常黏膜組織Id-1蛋白的表達Figure 2　Expression level of Id-1 protein in colorectal adenocarcinoma and normal colorectal tissues detected by Western blot

2.3Id-1的免疫組化檢測結果

Id-1在結直腸癌組織組陽性表達率是72.00%(36/50)，明顯高于正常黏膜的24.00%(12/50)，差異具有統計學意義(χ2=23.431，P=0.000，見圖3及表1)。

2.4Id-1蛋白與臨床病理參數之間的關系

Id-1蛋白的表達水平與患者腫瘤大小、分化程度無關，而與腫瘤漿膜浸潤、肝轉移、淋巴結轉移、腫瘤TNM分期、脈管浸潤密切相關(P<0.01，見表2)。

A.結直腸正常組織　　　　　　　　　　　　B.結直腸癌組織　圖3　免疫組化檢測結直腸組織中Id-1蛋白的表達 (SP,×200)Figure 3　Expression level of Id-1 protein in colorectal tissues detected by immunohistochemistry (SP，×200)

表1Id-1蛋白在結直腸癌組織及正常組織中的表達(例)

Table 1Positive expression of Id-1 protein in colorectal adenocarcinoma and normal colorectal tissues(cases)

組別nId-1-++++++χ2P正常組503874123.4310.000癌組501461119

3　討論

Id-1系螺旋-環-螺旋(helix-loop-helix，HLH)轉錄因子家族重要成員，是細胞分化的負性調控因子，其廣泛表達于哺乳動物的胚胎、生殖腺體及一些分化不成熟的組織細胞中，在正常組織中呈微量表達或不表達狀態，而在諸多惡性腫瘤及體外培養的腫瘤細胞系中高表達，且與腫瘤的惡性潛能及預后相關[6]。大多數HLH結構存在一個堿性HLH(bHLH)因子與其緊密相鄰，二者相互結合形成異質二聚體與目標DNA結合，誘導啟動子中的E-盒樣結構的靶基因轉錄并整合成所謂的“E-box”DNA序列，從而調控細胞增殖分化[7]。

Id-1通過多種途徑促進細胞增殖及侵襲。研究

證實，Id-1通過與E2A結合形成特異性復合物抑制E2A活化P21，激活CDK2誘導Rb蛋白磷酸化，抑制細胞分裂周期中G1/S停滯，促使細胞分裂周期順利進行[8]。Id-1表達上調能促進TGF-β1的表達，進而下調E-鈣黏蛋白表達，誘導上皮細胞間質化，導致細胞間極性消失、黏附力下降，使腫瘤細胞突破基底膜屏障，向鄰近組織遷移、浸潤[9,10]。

本實驗結果顯示Id-1mRNA和蛋白在腺癌組織中的表達明顯高于正常組織，證實Id-1特異性高表達可能在結直腸癌的發生、發展中發揮重要作用。Pillai等[11]研究表明Id-l在非小細胞肺癌組織中的表達隨腫瘤浸潤深度的加深而逐步增高，隨著淋巴結和遠處轉移而增強，在TNM Ⅲ和Ⅳ期的肺癌組織中表達較高。李曉梅等[12]對60例食管鱗癌組織行免疫組化檢測顯示Id-1在食管鱗癌組織中的陽性表達明顯高于正常食管黏膜。朱博等[13]研究證實，Id-1在正常胃黏膜、不典型增生胃黏膜和胃癌組織中的陽性表達呈逐步上升趨勢，且差異明顯，且與腫瘤分化程度、浸潤深度、TNM分期、淋巴結轉移和預后明顯相關，Id-1陽性患者生存期明顯低于陰性者。深入研究發現：結直腸癌伴漿膜浸潤者較未侵及漿膜者Id-1蛋白表達明顯增高；伴肝轉移、淋巴結轉移、血管浸潤者較無轉移浸潤者Id-1蛋白表達明顯增高；TNM分期越高，Id-1蛋白表達也越高，表明Id-1蛋白表達水平與結直腸腫瘤的惡性生物學行為密切相關，對結直腸癌的侵襲、轉移有促進作用。郭云等[14]對62例直腸癌組織性免疫組化檢測發現Id-1在癌組織中呈100%陽性染色，與腫瘤浸潤深度、淋巴結轉移密切相關，且與Ki-67和VEGF亦呈正相關性，考慮Id-1與Ki-67和VEGF具有協同作用；胡斌等[15]研究顯示結直腸癌中Id-1能上調MT1-MMP的表達水平，使MMP-2、MMP-9等基因金屬酶類過表達，促進基底膜的降解，加速癌細胞的浸潤轉移；此外，研究證實[10]，Id-1還能通過促進VEGF表達、抑制TSP-1表達兩方面共同作用，誘導腫瘤新生血管的形成，為腫瘤的生長、浸潤和轉移提供營養基礎。

表2Id-1在結直腸癌組織中的表達及與相關臨床病理指標的關系

Table 2Expression of Id-1 in colorectal adenocarcinoma tissues and its correlation with clinical pathological features

病理參數nId-1-+陽性率(%)χ2P腫瘤大小0.0430.836 ≥5cm3192270.97 <5cm1951473.68分化程度0.0740.964 高123975.00 中2161571.43 低1751270.59漿膜浸潤4.5210.034 有3993076.92 無115654.55TNM分期7.0440.008 Ⅰ+Ⅱ136753.84 Ⅲ+Ⅳ3782978.38淋巴結轉移15.2530.000 有2922793.10 無2112942.86肝轉移8.3330.003 有15015100.00 無351421 60.001脈管浸潤4.0790.043 有16215 93.75 無341221 61.76

綜上所述，Id-1的高表達與結直腸癌的發生、發展及其惡性生物學行為具有高度的相關性，因而Id-1有望成為新的腫瘤監測指標，為臨床診治及預后監測提供重要的參考。本實驗僅對Id-1在結直腸癌中的表達及與臨床病理特征的關系做出了相關研究，但對其致癌機制、作用通路未有相應研究，對Id-1抑制劑的應用是否可抑制細胞增殖的研究尚未有相關實驗加以證實，這也將是本課題進一步的研究方向。

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Expressions of Id-1 in colorectal adenocarcinoma tissues and its clinical significance

WU Xueliang1, WANG Likun2, XUE Jun1*, YANG Dongdong1, QU Ming1, GUO Fei1, YANG Ruimin2, LIU Bo3

(1DepartmentofVascularGland,FirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity,Zhangjiakou075000,China;2DepartmentofUltrasound,FirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity;3DepartmentofPathology,FirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity;*Correspondingauthor,E-mail：yfyxuejun@163.com)

ObjectiveTo investigate the expression of Id-1 in human colorectal adenocarcinoma tissues and explore their correlation with clinical pathological parameters of colorectal cancer.MethodsThe expression levels of Id-1 mRNA and protein in 50 specimens of normal colorectal tissues, and 50 specimens of colorectal adenocarcinoma tissues were detected using reverse-transcription polymerase chain reaction and Western blot. Meanwhile Id-1 protein was detected using immunohistochemistry. The correlation between Id-1 expression and the clinical pathological features was analyzed.ResultsThe expression level of Id-1 mRNA in colorectal adenocarcinoma tissues and normal colorectal tissues were 0.96±0.03 and 0.20±0.04, and there was significant difference(P=0.011).The expression of Id-1 protein in colorectal adenocarcinoma tissues was higher than that in normal colorectal tissues(0.82±0.04vs0.31±0.02,P=0.020).The positive expression rate of Id-1 protein in colorectal adenocarcinoma tissues was higher than that in normal colorectal tissues (72.00%vs24.00%,χ2=23.431,P=0.000).Expression of Id-1 was correlated with the depth of tumor invasion,TNM stage,lymph node metastasis,vessel invasion,and liver metastasis(P<0.01),but not with the tumor size and differentiation degrees(P>0.05).ConclusionThe high expression of Id-1 in colorectal adenocarcinoma tissues plays an important role in the process of cancer, and is expected to become a new tumor monitoring indicator for clinical diagnosis and treatment and prognosis judgment.Key words:Id-1;colorectal neoplasms;RT-PCR;Western blot;immunohistochemistry

河北省衛計委醫學科學研究重點課題計劃資助項目(20150058); 河北省科技支撐計劃資助項目( 152777237); 河北省張家口市科技局指令性計劃資助項目(1311055D)

武雪亮，男，1984-09生，碩士，主治醫師，E-mail：wxlwlk@163.com

2015-11-12

R735.37

A

1007-6611(2016)03-0228-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.03.008