三維培養人牙髓細胞細胞增殖能力的研究

翟莎菲， 蔣文凱， 倪龍興*

(1西安醫學院口腔醫學系，西安　710021； 2第四軍醫大學口腔醫學院； *通訊作者，E-mail：Longxing_Ni@hotmail.com； #共同通訊作者，E-mail：zhaishafei@xiyi.edu.cn)

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三維培養人牙髓細胞細胞增殖能力的研究

翟莎菲1#， 蔣文凱2， 倪龍興2*

(1西安醫學院口腔醫學系，西安710021；2第四軍醫大學口腔醫學院；*通訊作者，E-mail：Longxing_Ni@hotmail.com；#共同通訊作者，E-mail：zhaishafei@xiyi.edu.cn)

目的檢測普通貼壁培養和三維培養的牙髓細胞在一定時間的增殖能力。方法用U底鋪有瓊脂糖的96孔板作為非黏附表面，每孔接種104個牙髓細胞形成三維培養體系，誘使牙髓細胞發生 nemosis。以普通貼壁培養牙髓細胞作為對照組，分別在細胞接種20，40，60，80 h加入CCK8試劑，450 nm校正波長測量光密度(OD)值。 結果隨著培養時間的延長，普通貼壁培養牙髓細胞OD值逐漸增多；三維培養不同時間點的OD值不同，其中三維培養20-60 h OD值變化不大，80 h較60 h OD值顯著減少；并且在不同的時間點，三維培養的牙髓細胞的OD值均小于普通貼壁培養的牙髓細胞，差異具有統計學意義(P<0.05)。結論隨著培養時間的延長，三維培養的牙髓細胞細胞增殖能力均小于貼壁培養的牙髓細胞。

牙髓細胞；三維培養；增殖活力；nemosis

牙髓成纖維細胞是牙髓組織的主體細胞，因此又被稱為牙髓細胞。以往的研究認為牙髓細胞負責合成胞外基質，近年越來越多的研究發現牙髓細胞在牙髓組織免疫反應以及牙髓炎的發生發展中扮演重要的角色[1,2]，但牙髓細胞參與牙髓炎癥的免疫防御機制尚不清楚。近年來，一種被稱為“nemosis”的發生在成纖維細胞上的細胞激活形式被國內外研究所發現。Bizik等[3]發現利用三維培養的方法使得成纖維細胞之間形成緊密接觸，能使其激活，隨著自發性地釋放一系列的細胞因子，如促炎因子(IL-1、IL-6、IL-8、GM-CSF)和趨化因子(MIP-1α、RANTES、IL-8)，與此同時，成纖維細胞自身逐漸開始發生壞死，具有程序性壞死的特征，因此取名“nemosis”，希臘語意為“不可避免的報復”[3-6]。利用體外三維培養使得成纖維細胞自發性激活nemosis，可能為研究炎癥發生和保持以及炎癥相關致癌作用提供新思路[5]。迄今為止，發生nemosis的細胞研究發現的有包皮成纖維細胞、皮膚成纖維細胞等，但牙髓成纖維細胞能否發生nemosis，有何自有的特征，至今研究很少[4,7]。本實驗比較研究牙髓細胞增殖能力在非黏附不貼壁的三維培養體系中和普通貼壁培養體系中有何不同，為下一步搞清nemosis這種炎性細胞死亡在牙髓炎中的作用奠定實驗基礎。

1　材料和方法

1.1主要試劑和儀器

α-MEM培養液(Gibico，美國)；胎牛血清(Sigma，美國)；胰蛋白酶(Invitrogen，美國)；青霉素、鏈霉素(Invitrogen，美國)；瓊脂糖(BioWhittaker，美國)；CCK-8試劑(DOJINDO，日本)；酶標儀(Bio-Tek，美國)。

1.2人牙髓細胞的體外培養

實驗經西安醫學院醫學倫理委員會審核批準，經患者知情同意，取第四軍醫大學口腔醫院頜外門診拔除的健康(無齲壞、牙髓炎或牙周炎)第三磨牙，患者年齡15-25歲，參照文獻[8]方法，用含雙抗的PBS液反復清洗牙齒后，無菌條件下分離牙髓，根尖1/3部分剪棄，剩余牙髓剪成約1.0 mm3的碎塊，平鋪于孔板底壁滴加有500 μl含20%胎牛血清、100 U /ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的α-MEM培養液的6孔板內，用無菌蓋玻片小心覆蓋組織塊使之固定，緩慢輕輕加入上述培養液2 ml，置培養箱中37 ℃、5% CO2的孵箱中培養,每3 d換液1次，待細胞生長會合后，20 g/L胰蛋白酶消化原代細胞，按1∶3傳代，取4-6代細胞用于后述實驗。

1.3牙髓細胞的三維培養及形態觀察

蒸餾水配制0.8%的瓊脂糖溶液，高壓滅菌后鋪于U形底的96孔板形成非黏附表面。20 g/L胰蛋白酶消化牙髓細胞，用含10%胎牛血清的α-MEM制備5×104/ml的細胞懸液，接種于U形96孔板，每孔200 μl，置培養箱中37 ℃、5% CO2的孵箱,倒置顯微鏡觀察細胞形態。

1.4牙髓細胞增殖能力檢測

消化牙髓細胞，細胞計數后等量接種于平底96孔板和U型底96孔板，每組5個復孔。分別于細胞接種的20，40，60，80 h加入待檢測孔，每孔加入細胞培養液1/10體積的CCK8試劑，37 ℃、5% CO2培養1 h，酶標儀450 nm測量波長，650 nm校正波長測吸光度(OD)值。實驗重復3次。

1.5統計學分析

2　結果

2.1三維培養牙髓細胞形態

三維培養的牙髓細胞2 h即可發現細胞開始聚集，12 h時細胞和細胞之間距離更近，20 h左右即可形成類似“球體”，細胞球體內細胞之間連接緊密，普通的方法甚至胰酶都很難使其解體，大約48 h后細胞球體體積進一步縮小，與此同時球體周圍可見細胞碎片殘骸。

圖1　光鏡下三維培養40 h牙髓細胞(×40)Figure 1　Dental pulp cells morphology in three-dimensional culture at 40 h under optical microscope

2.2牙髓細胞胞膜損傷檢測

CCK8實驗的結果見圖2，實驗所測的光密度值的大小代表細胞數目多少。隨著培養時間的延長，普通貼壁培養牙髓細胞OD值逐漸增多；而三維培養20，40，60，80 h不同時間點的OD值有差異(P=0.042)，其中20 h，40 h，60 h OD值變化不大，80 h較60 h OD值顯著減少，差異具有統計學意義(P=0.006)。

與普通貼壁比較，*P<0.05;與60 h比較，#P<0.05圖2　貼壁培養和三維培養的牙髓細胞細胞增殖能力Figure 2　Comparison of dental pulp cells proliferation abilities between three-dimensional culture and normal adherent culture

3　討論

CCK8試驗是一種檢測細胞存活和生長的方法。CCK8試劑通過測量細胞代謝體現細胞活力，檢驗細胞增殖能力。CCK8試劑中含有WST-8，其能通過電子載體的作用進入細胞，經過線粒體的脫氫酶還原反應生成黃色甲臜染料，生成甲臜染料的數量和活細胞的數量呈正比，染料是水溶性的，因此不需要裂解細胞，因此可直接比色檢測，用于細胞增殖的檢測。傳統的檢測細胞生長所用的顯色劑是四唑鹽，商品名是噻唑藍，簡稱為MTT。MTT法檢測原理是：活細胞線粒體中存在琥珀酸脫氫酶，因此能使外源性的MTT還原為不溶性的甲臜藍紫色結晶物，進而沉積在細胞中。而死細胞不存在琥珀酸脫氫酶，還原后的甲臜是非水溶性的，需要加有機溶劑溶解，因此，MTT法較適宜普通貼壁細胞檢測細胞增殖活力。但對本研究的三維懸浮培養體系來說，操作繁瑣，重復性差，而且工作量比較大。因此本實驗選擇CCK8法同時普通貼壁和三維培養這兩種不同培養體系中牙髓細胞增殖能力。

成纖維細胞發生nemosis的特點是形成“球形”細胞聚集體的同時細胞開始逐步壞死。與細胞凋亡相比，nemosis不具有凋亡相關分子(如Fas、Daxx、caspase-3)激活和DNA斷裂，并且細胞發生nemosis能促使多種促炎因子的生成，因此，nemosis有別于經典的細胞凋亡[3,11,12]。本研究以普通貼壁培養牙髓細胞作為對照組，隨著培養時間的延長，對照組OD值逐漸增多；由于吸光度值的大小代表細胞數目多少，因此說明普通貼壁培養的牙髓細胞隨著培養時間延長細胞數逐漸增多，并從快速增長逐漸進入平臺期。以往的研究認為當細胞受到外界物理或化學性的損傷因子，缺氧以及營養不良等作用下會使細胞增殖能力受到影響。本研究觀察到在三維培養發生nemosis的牙髓細胞中，隨著培養時間的延長，OD值逐漸減少，說明發生nemosis能使得牙髓細胞增殖能力在一定程度上受損。三維培養牙髓細胞形成“球狀”細胞聚集體，進而細胞增殖能力在一段時間內受到抑制。這一改變的激發因素不是由于任何外界毒力刺激，僅是由細胞聚集所引起的。牙髓細胞和細胞之間的緊密接觸導致細胞代謝活力下調，可能暗示細胞與細胞之間存在接觸抑制—一種在普通貼壁培養細胞中的現象[13]。今后進一步對牙髓細胞nemosis損傷機制的研究將有助于揭示這種細胞激活形式在牙髓組織炎性反應中作用。

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Study on proliferation abilities ofinvitrothree-dimensional cultured human dental pulp cells

ZHAI Shafei1#，JIANG Wenkai2，NI Longxing2*

(1DepartmentofStomatology,Xi’anMedicalUniversity,Xi’an710021,China；2DepartmentofOperativeDentistryandEndodontics，FourthMilitaryMedicalUniversity；*Correspondingauthor，E-mail:Longxing_Ni@hotmail.com；#Co-correspondingauthor，E-mail:zhaishafei@xiyi.edu.cn)

ObjectiveTo compare the difference of proliferation abilities between normal adherent cultured dental pulp cells and three-dimensional cultured dental pulp cells.MethodsThe formation of nemosis was initiated by seeding 104dental pulp cells in one well of a U-bottomed, 96-well plate coated with agarose. The normal adherent cultured dental pulp cells in flat bottomed 96-well plate were used as control group. At 20 h，40 h，60 h，80 h after cell seeding, the CCK8 reagent was added. The optical density(OD) values were measured at a wavelength of 450 nm.ResultsOD values gradually increased in the adherent cultured dental pulp cells during the cell culture. In the three-dimensional cultured dental pulp cells，OD values showed no significant change from 20 h to 60 h, but decreased significantly at 80 h after cell seeding(P<0.05). Compared with dental pulp cells in the normal adherent culture, the OD values in the three-dimensional cultures were decreased at each time point(P<0.05).ConclusionThe proliferation ability in the three-dimensional cultured dental pulp cells are weaker than that of normal adherent cultured dental pulp cells.

dental pulp cells；three-dimensional culture；proliferation ability；nemosis

國家自然科學基金資助項目(81371139,81170946);陜西省社會發展科技攻關資助項目(2015SF157)；西安醫學院博士科研啟動基金資助項目(2015DC21)

翟莎菲，女，1983-08生，博士，講師，E-mail：zhaishafei@xiyi.edu.cn

2015-11-27

R781

A

1007-6611(2016)03-0247-03

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.03.012