柴胡皂苷提取物灌胃給予大鼠后肺組織中移形成分的LC-MS分析

喬亞榮， 張　峰， 方　媛， 賈金萍， 閆　艷， 田俊生， 秦雪梅， 高曉霞*

(1山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，太原　030006; 2山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院; 3山西大學(xué)大型科學(xué)儀器中心; *通訊作者, E-mail:gaoxiaoxia@sxu.edu.cn)

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柴胡皂苷提取物灌胃給予大鼠后肺組織中移形成分的LC-MS分析

喬亞榮1，2， 張峰1，2， 方媛1， 賈金萍3， 閆艷1， 田俊生1， 秦雪梅1， 高曉霞1*

(1山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，太原030006;2山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院;3山西大學(xué)大型科學(xué)儀器中心;*通訊作者, E-mail:gaoxiaoxia@sxu.edu.cn)

目的初步探討柴胡皂苷類成分在大鼠肺組織的代謝，為更好地揭示柴胡皂苷類成分在體內(nèi)過程提供依據(jù)。 方法采用液相質(zhì)譜聯(lián)用儀分析柴胡皂苷提取物灌胃給藥后大鼠肺組織中的成分，得到各成分的總離子流圖和二級質(zhì)譜圖，結(jié)合文獻(xiàn)與對照品對照對各色譜峰進(jìn)行鑒定。色譜條件：采用BEH-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫(0-4 min，25%A→37%A；4-10 min，37%A；10-18 min，37%A→50%A；18-22 min，50%A→90%A；22-25 min，90%A→90%A；25-26 min，90%A→25%A)，流速0.4 ml/min。質(zhì)譜條件：電噴霧電離離子源；正負(fù)離子掃描模式；溫度450 ℃，質(zhì)量掃描范圍：m/z 150-1 500。結(jié)果以柴胡皂苷類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律為指導(dǎo)，共鑒定出15種化合物。其中10種藥材原型成分，分別為柴胡皂苷(SS)a，SSc，SSf，SSd，SSb2，SSe， 3″-O-乙酰化柴胡皂苷 a，6″-O-乙酰化柴胡皂苷 a，3″-O-乙酰化柴胡皂苷d，6″-O-乙酰化柴胡皂苷d；5種代謝物分別為柴胡次皂苷F，柴胡次皂苷 D，柴胡次皂苷 G，去糖氧化柴胡皂苷a，去糖氧化柴胡皂苷d。結(jié)論通過柴胡皂苷提取物肺中成分分析，初步確認(rèn)了柴胡皂苷提取物在肺中的柴胡皂苷類成分以及代謝產(chǎn)物，為柴胡發(fā)揮解熱鎮(zhèn)痛作用的物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

LC-MS;柴胡皂苷類;代謝產(chǎn)物;體內(nèi)分析

柴胡，為傘形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.或狹葉柴胡BupleurumscorzonerifoliumWilld.的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品[1]，被歷版《中國藥典》[2]收載，是一種常用的中藥材[3]，有悠久的應(yīng)用歷史，具解表和里、疏肝解郁、升提中氣之功效[4]，性味苦，微寒，歸肝、膽、肺經(jīng)。研究表明，柴胡皂苷類成分具有解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗炎、保肝、止咳、抗病毒、抗?jié)兊榷喾N藥理活性[6]，是柴胡發(fā)揮解熱鎮(zhèn)痛作用的主要藥效成分[5]。但是，柴胡皂苷結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，極易轉(zhuǎn)化，生物利用度較低，在體內(nèi)主要以代謝產(chǎn)物的形式存在[7,8]。近年來，關(guān)于柴胡皂苷藥動(dòng)和代謝的研究越來越多[9-11]，主要集中在血液和肝組織中的分布和代謝[12]。柴胡皂苷有解熱作用[13]，解熱作用與肺組織關(guān)系密切，故本實(shí)驗(yàn)將首次探究柴胡皂苷類成分在肺組織的分布和代謝，為柴胡發(fā)揮解熱鎮(zhèn)痛作用的物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1儀器超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用儀(Thermo Scientific Q Exactive LC-MS，美國Thermo)，Xcalibur 2.0數(shù)據(jù)分析軟件，Sartorius電子分析天平(德國賽多利斯Sartorius有限公司)，高速冷凍離心機(jī)(TGL-6，長沙湘儀離心機(jī)有限公司)，真空干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠)，氮吹儀(實(shí)驗(yàn)室自制)，UP-250 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.1.2試藥與試劑柴胡(1408259131)購于山西省華陽藥業(yè)有限公司，經(jīng)山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心秦雪梅教授鑒定為紅柴胡BupleurumchinenseDC，且留樣于山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心。柴胡皂苷a(SSa)(批號：14111902)、柴胡皂苷d(SSd)(批號：14071710)對照品購自中國藥品生物制品檢定所；柴胡皂苷c(SSc)(批號：MUST-14102812)、柴胡皂苷b1(SSb1)(批號：MUST-14080110)、柴胡皂苷b2(SSb2)(批號：MUST-14041012)對照品購自成都曼斯特生物科技有限公司。

烏拉坦購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；95%乙醇、甲醇、乙腈、羧甲基纖維素鈉均為分析純，購自北京化工廠；純凈水購自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；色譜級甲醇和乙腈購自Fisher Scientific(USA)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康雄性SD大鼠12只，體質(zhì)量(200±20)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號SCXK(京2012-0001)。將大鼠置于晝夜節(jié)律光照條件下，自由進(jìn)食進(jìn)水，飼養(yǎng)7 d適應(yīng)環(huán)境，每天觸摸動(dòng)物以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)人員的操作。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1柴胡皂苷提取物的制備參照柴胡總皂苷的提取方法[14]，取柴胡200 g，加8倍量80%乙醇，回流提取3次，第1，2次每次2 h，第3次1 h，合并提取液，濾過，回收乙醇至無醇味，加水分散，濃縮至浸膏，然后加入等體積的石油醚，萃取，棄去并石油醚層后濃縮至浸膏，置于水浴鍋(60 ℃)上干燥，即得柴胡皂苷提取物。

1.2.2對照品溶液的制備稱取SSa，SSc，SSd，SSb1和SSb2對照品約2.5 mg，精密稱定，分別置于5 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得SSa 0.500 mg/ml、SSc 0.490 mg/ml、SSd 0.485 mg/ml、SSb10.510 mg/ml、SSb20.495 mg/ml的對照品貯備液。精密量取各貯備液適量，加甲醇稀釋至適當(dāng)濃度，進(jìn)樣前0.22 μm微孔濾膜濾過。

1.2.3灌胃液的制備柴胡皂苷提取物用0.1%羧甲基纖維素鈉水超聲溶解制得灌胃液，質(zhì)量濃度為30 g/ml(按生藥量計(jì))，各成分的含量分別為：SSc 0.042 mg/g，SSa 0.090 mg/g，SSd 0.385 mg/g，SSb20.102 mg/g，SSb10.098 mg/g(按生藥量計(jì))。

1.2.4組織樣本的采集SD大鼠12只，分成2組，每組6只，分別為空白組和給藥組。實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，自由飲水。按照1 ml/100 g體質(zhì)量，分別灌胃給予空白溶媒和柴胡皂苷提取物的灌胃液。給藥后30 min，按大鼠體重腹腔注射20%烏拉坦0.01 ml/g麻醉，取肺組織，-80 ℃冷藏備用。

1.2.5組織樣本的處理稱取肺組織樣本約1.000 g，精密稱定，置10 ml EP離心管中，加入2倍體積的生理鹽水，勻漿，取勻漿液2 ml，用甲醇沉淀蛋白的方法除去蛋白，即加入甲醇6 ml，渦旋混合3 min，3 000 r/min離心15 min，取上清液置于另一10 ml EP離心管中，常溫下N2流吹干，殘?jiān)尤?50 μl甲醇溶解，超聲3 min，渦旋2 min，轉(zhuǎn)移至0.5 ml EP離心管中，4 ℃下13 000 r/min離心10 min，取上清液，進(jìn)樣分析。

1.2.6色譜條件與質(zhì)譜條件色譜條件：BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相為水(A)-乙腈(B)；梯度洗脫：0-4 min，25%A→37%A；4-10 min，37%A；10-18 min，37%A→50%A；18-22 min，50%A→90%A；22-25 min，90%A→90%A；25-26 min，90%A→25%A；體積流量0.4 ml/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量1 μl；全波長掃描。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離離子源，正負(fù)離子模式，毛細(xì)管電壓3 kV，錐孔電壓40 V，離子源溫度120 ℃，脫溶劑氣溫度350 ℃，脫溶劑氣流量600 L/h，采用全掃描質(zhì)譜和二級質(zhì)譜測定，全掃描質(zhì)量掃描范圍m/z100-1 500。

采用高分辨質(zhì)譜在正負(fù)電離模式下測定后，得到對照品LC-MS的總離子流圖和二級質(zhì)譜圖以及空白組和給藥組肺組織的LC-MS的總離子流圖和二級質(zhì)譜圖。將得到的結(jié)果用Xcalibur 2.0數(shù)據(jù)分析軟件處理，得到給藥后肺組織扣除空白組背景后的總離子流圖，然后對其成分進(jìn)行分析。

2　結(jié)果

2.1柴胡皂苷類成分對照品質(zhì)譜結(jié)果分析

SSa對照品的負(fù)離子模式下一級質(zhì)譜圖中可見[M-H+HCOOH]-m/z825.462 65和[M-H]-m/z779.456 67，二級質(zhì)譜圖見圖1A，可見其主要的碎片離子為丟失葡萄糖162 D所得的碎片離m/z617.404 97，進(jìn)一步丟失巖藻糖146 D和CH3OH 32 D所得的碎片離子m/z439.320 13。SSd對照品的負(fù)離子模式下一級、二級質(zhì)譜圖同SSa。

對照品SSb1和SSb2具有相同的質(zhì)譜行為(見圖1B)，負(fù)離子模式下一級質(zhì)譜圖中可見[M-H+HCOOH]-m/z825.456 30 和[M-H]-m/z779.451 78，二級質(zhì)譜圖主要的碎片離子為丟失葡萄糖162 D所得的碎片離m/z617.404 97，進(jìn)一步丟失巖藻糖146 D、CH2O 30 D和H2O 18 D所得的碎片離子m/z423.322 94。

SSc對照品的負(fù)離子模式下一級質(zhì)譜圖中可見[M-H+HCOOH]-m/z971.513 06 和[M-H]-m/z925.507 02，二級質(zhì)譜圖見圖1C，可見其主要的碎片離子為丟失葡萄糖162 D所得的碎片離m/z763.457 28，丟失巖藻糖146 D所得的碎片離子m/z779.451 66，進(jìn)一步丟失葡萄糖162 D所得的碎片離子m/z617.400 15。

圖1　對照品SSa，SSb1和SSc二級質(zhì)譜圖Figure 1　The MS/MS chromatogram of standard SSa,SSb1 and SSc

2.2柴胡皂苷類成分及代謝物的指認(rèn)

灌胃給予大鼠柴胡皂苷提取物后，在大鼠的肺中總共檢測到17種成分(見表1)，其中9種為藥材原型成分，8種為代謝產(chǎn)物。鑒定出15種成分，提取m/z600-1 000的離子流圖(見圖2)，圖中標(biāo)記了鑒定出的15種成分。

表1給藥后組織中柴胡皂苷類成分及代謝物的LC-MS分析結(jié)果

Table 1The bupleurum saikosaponins and metabolites in rat tissue after administration by LC-MS

序號tR[M-H]+(m/z)(+)MS(m/z)MS2(m/z) [M-H]-(m/z)(-)MS(m/z)MS2(m/z) 化合物 15.40927.52805949.51080[M+Na]+909.52155[M+H-H2O]+803.45264[M+Na-Fuc]+925.51483971.51781[M-H+HCOOH]-779.45691[M-Fuc]-617.40430[M-Fuc-Glc]-柴胡皂苷c*25.66929.54572951.52881[M+Na]+927.53329973.53558[M-H+HCOOH]-781.47101[M-Fuc]-619.42084[M-Fuc-Glc]-柴胡皂苷f38.33781.47156803.45428[M+Na]+619.41962[M+H-Glc]+455.35141[M+H-Glc-Fuc-H2O]+779.45667825.46265[M-H+HCOOH]-617.40497[M-Glc]-439.32013[M-H-Glc-Fuc-CH3OH]-柴胡皂苷a*48.66781.47192803.45435[M+Na]+619.41962[M+H-Glc]+455.35141[M+H-Glc-Fuc-H2O]+779.45636825.46265[M-H+HCOOH]-617.40497[M-Glc]-柴胡皂苷b2*515.42781.47150803.45398[M+Na]+619.41479[M+H-Glc]+473.36179[M+H-Glc-Fuc-]+455.35107[M+H-Glc-Fuc-H2O]+779.45648825.46289[M-H+HCOOH]-617.40497[M-Glc]-439.31534[M-H-Glc-Fuc-CH3OH]-柴胡皂苷d*613.87823.48120845.46362[M+Na]+805.47101[M+H-H2O]+473.11438[M+H-CH2CO-Glc-Fuc]+455.35089[M+H-CH2CO-Glc-Fuc-H2O]+821.46819867.47237[M-H+HCOOH]-779.45587[M-CH3CO]-761.45020[M-CH3CO-H2O]-617.40405[M-CH3CO-Glc]-3″-O-乙酰化柴胡皂苷a714.36823.48236同6821.46774同66″-O-乙酰化柴胡皂苷a816.95823.48145同6821.46822同63″-O-乙酰化柴胡皂苷d918.95823.48175同6821.46698同66″-O-乙酰化柴胡皂苷d1010.69619.41937641.40155[M+Na]+601.40875[M+H-H2O]+455.35196[M+H-Fuc-H2O]+437.34085[M+H-Fuc-2H2O]+617.40356663.41193[M-H+HCOOH]-471.34680[M-Fuc]-439.32251[M-Fuc-CH3OH]-柴胡次皂甙F1111.16619.41876同10617.40417同10柴胡次皂甙D1217.36619.41925同10617.40503同10柴胡次皂甙G1312.74617.40338639.38544[M+Na]+455.35120[M+H-Fuc-O]+437.34082[M+H-Fuc-O-H2O]+615.38892661.39459[M-H+HCOOH]-585.37872[M-H-CH3OH]-439.32147[M-H-Fuc-CH3OH]-去糖氧化柴胡皂苷a1418.13617.40326同13615.39505同13去糖氧化柴胡皂苷d1512.57787.45862[M+Na]+455.35123[M+H-Fuc-Glc-2H]+763.46024809.467419[M-H+HCOOH]-601.41034[M-H-Glc]-柴胡皂苷e168.08673.42719601.40869649.43091695.43622663.40991未知1712.04507.27240325.18341279.23406未知

*通過對照品指認(rèn)的成分，其余根據(jù)質(zhì)譜規(guī)律，結(jié)合參考文獻(xiàn)推測

2.2.1柴胡皂苷類成分1,3,4,5與對照品的一級、二級質(zhì)譜圖的對比，保留時(shí)間確定成分1,3,4,5分別為SSc，SSa，SSb2，SSd。成分2,15的主要碎片離子見表1，根據(jù)其裂解規(guī)律，推測其為為SSf，SSe。

2.2.2乙酰化柴胡皂苷類成分6的負(fù)離子模式下的一級質(zhì)譜圖中可見m/z867.47237和m/z821.467 74，在二級質(zhì)譜圖可見m/z779.455 87，m/z761.450 20，m/z617.404 05，m/z439.321 93，根據(jù)其一級和二級質(zhì)譜的數(shù)據(jù)，推測m/z821.467 74為[M-H]-，丟失C2H2O 42 D得到碎片離子m/z779.455 87，再丟失H2O 18 D得到m/z761.450 20，m/z779.455 87丟失葡萄糖162 D得m/z617.404 05，進(jìn)一步失去一分子巖藻糖146 D和CH3OH 32 D得m/z439.321 93，成分7-9呈現(xiàn)同樣的裂解規(guī)律，正負(fù)離子模式下的碎片離子見表1，推測其分別為SSa和SSd乙酰化后的化合物，即3″-O-乙酰化柴胡皂苷a，6″-O-乙酰化柴胡皂苷a，3″-O-乙酰化柴胡皂苷d，6″-O-乙酰化柴胡皂苷d。正離子模式下的碎片離子見表1，驗(yàn)證了負(fù)離子模式下的推測結(jié)果。

1.SSc;2.SSf;3.SSa;4.SSb2;5.SSd;6.3″-O-乙酰化柴胡皂a;7.6″-O-乙酰化柴胡皂苷a;8.3″-O-乙酰化柴胡苷d;9.6″-O-乙酰化柴胡苷d;10.柴胡次皂甙F；11.柴胡次皂甙D；12.柴胡次皂甙G；13.去糖氧化柴胡皂苷a；14.去糖氧化柴胡皂苷d；15.SSeB.給藥組圖2　空白組和給藥組肺組織LC-MS分析負(fù)離子模式下提取的離子流圖Figure 2　Ion chromatogram in the negative mode of lung tissues in the blank sample and drug spiked sample

2.2.3柴胡皂苷代謝物成分10-14在灌胃液和空白組的肺組織中均未檢測到，但在給藥組的肺組織樣本中檢測到，故推測其為代謝物。

成分10的負(fù)離子模式下的一級質(zhì)譜圖中可見m/z663.411 93和m/z617.403 56，在二級質(zhì)譜圖可見m/z471.346 80，m/z439.322 51，推測m/z617.403 56為[M-H]-，丟失巖藻糖146 D得到碎片離子m/z471.346 80，進(jìn)一步失去CH3OH 32 D得m/z439.321 93，成分11,12呈現(xiàn)同樣的裂解規(guī)律，推測其分別為SSa，SSd，SSb2失去一分子葡萄糖所得，即柴胡次皂甙F、柴胡次皂甙D、柴胡次皂甙G。正離子模式下的碎片離子見表1，驗(yàn)證了負(fù)離子模式下的推測結(jié)果。

成分13的負(fù)離子模式下的一級質(zhì)譜圖和二級質(zhì)譜圖中可見m/z661.394 59，m/z615.388 92，m/z585.378 72和m/z439.321 47，推測m/z615.388 92為[M-H]-，丟失CH2O 30 D得到碎片離子m/z585.378 72，進(jìn)一步失去巖藻糖146 D得m/z439.321 47，成分14呈現(xiàn)同樣的裂解規(guī)律，根據(jù)其在色譜圖中的出峰順序推測其分別SSa和SSd失去一分子葡萄糖氧化所得，即去糖氧化柴胡皂苷a和去糖氧化柴胡皂苷d。正離子模式下的碎片離子見表1，驗(yàn)證了負(fù)離子模式下的推測結(jié)果。

3　討論

根據(jù)柴胡皂苷類成分的結(jié)構(gòu)和對照品的裂解規(guī)律，總結(jié)發(fā)現(xiàn)：柴胡皂苷類成分先失去m/z146鼠李糖/巖藻糖、m/z162葡萄糖/半乳糖等糖鏈結(jié)構(gòu)，得到失去一分糖或者兩分子糖的碎片離子；進(jìn)一步失去所有的糖鏈得到苷元結(jié)構(gòu)；苷元結(jié)構(gòu)進(jìn)一步失去m/z32 CH3OH和不同數(shù)目的m/z18 H2O得到碎片離子。這一裂解規(guī)律為柴胡皂苷類成分和代謝物的指認(rèn)提供依據(jù)。

組織樣品采集時(shí)間的確定：大鼠灌胃給予柴胡皂苷提取物后，分別在15，30，45，60 min時(shí)取肺組織，然后經(jīng)LC-MS分析后，發(fā)現(xiàn)30 min時(shí)組織中柴胡皂苷類成分及代謝物含量較高。

本實(shí)驗(yàn)通過LC-MS分析了柴胡皂苷類成分進(jìn)入大鼠體內(nèi)后在肺組織的行為分布，鑒定出10種原型成分和5種代謝產(chǎn)物，為柴胡皂苷類成分在體內(nèi)的分布及代謝過程提供依據(jù)。但是，中藥成分在體內(nèi)的代謝過程復(fù)雜，柴胡皂苷類成分的體內(nèi)代謝需要更多的實(shí)驗(yàn)來揭示其在體內(nèi)復(fù)雜的代謝過程。

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LC-MS analysis of saikosaponins in rat lung tissues after oral administration of bupleurum saikosaponin extract

QIAO Yarong1,2, ZHANG Feng1,2, FANG Yuan1, JIA Jinping3, YAN Yan1, TIAN Junsheng1, QIN Xuemei1, GAO Xiaoxia1*

(1ModernResearchCenterforTraditionalChineseMedicine,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China;2CollegeofChemistryandChemicalEngineering,ShanxiUniversity;3ScientificInstrumentCenter,ShanxiUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:gaoxiaoxia@sxu.edu.cn.)

ObjectiveTo explore the metabolic profile of saikosaponins in rat lung tissues, and provide evidences for the profile of saikosaponinsinvivo.MethodsA rapid,sensitive LC-MS was developed to explore the components of bupleurum saikosaponin extract in rat lung tissues after oral administration. The LC-MS full scan and MS/MS were established to identify the components in rat lung tissues. The separation was performed on an BEH C18(2.1 mm×100 mm, 1.7 μm), with acetonitrile-water as the mobile phase. The gradient profile was as follows: 0-4 min，25%A→37%A；4-10 min，37%A；10-18 min，37%A→50%A；18-22 min，50%A→90%A；22-25 min，90%A→90%A；25-26 min，90%A→25%A. The flow rate was maintained at 0.4 ml/min. MS method was set with ESI ion, positive and negative ions mode and temperature of 450 ℃, and the full mass range was from 150 to 1 500.ResultsBased on the MS pattern of saikosaponins, 15 compounds were identified in rat lung tissues, including saikosaponin a(SSa), SSc, SSf, SSd, SSb2, SSe, 3″-O-acetylsaikosaponin a, 6″-O-acetylsaikosaponin a, 3″-O-acetylsaikosaponin d, 6″-O-acetylsaikosaponin d, prosaikogenin F, prosaikogenin D, prosaikogenin G.ConclusionLC-MS results indicate that the active constituents in bupleurum saikosaponin extract in lung are confirmed, and provide an evidence for the antipyretic effects of saikosaponinsinvivo.

LC-MS;saikosaponin;metabolite;analysisinvivo

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81001688,81473415)；國際科技合作資助項(xiàng)目(2011DFA32630)；“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目(2012ZX09103201-035)；山西省振東制藥研究生教育創(chuàng)新中心碩士研究生實(shí)踐教學(xué)模式探索項(xiàng)目

喬亞榮，女，1990-11生，碩士,E-mail: qiaoyarong1990@sina.cn

2015-10-20

284

A

1007-6611(2016)03-0264-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.03.015