長鏈多不飽和脂肪酸EPA、DHA的基因工程研究進展

李文宗 王磊

（中國農業科學院生物技術所，北京 100081）

綜述與專論

長鏈多不飽和脂肪酸EPA、DHA的基因工程研究進展

李文宗 王磊

（中國農業科學院生物技術所，北京 100081）

長鏈多不飽和脂肪酸（long chain polyunsaturated fatty acid，LCPUFA）對維持人體健康具有重要作用，對其需求逐年增加，但是由于環境污染與漁業資源的下滑，有限的魚油資源越來越不能滿足人們需求。運用現代生物技術人們已相繼分離了多個LCPUFA合成相關基因，并闡明了多條LCPUFA合成代謝途徑。通過轉基因技術在高等植物中成功合成了對人體健康十分重要的長鏈多不飽和脂肪酸，尤其是二十碳五烯酸（EPA），二十二碳六烯酸（DHA）。綜述了LCPUFA的合成途徑及轉基因研究的最新進展，分析合成LCPUFA存在的問題及解決方法，并對未來多不飽和脂肪酸EPA，DHA的基因工程研究進行展望。

長鏈多不飽和脂肪酸；EPA；DHA；轉基因植物

長鏈多不飽和脂肪酸，指含有兩個或兩個以上雙鍵且碳鏈長度為18-22個碳原子的直鏈脂肪酸，大部分由寒冷地區的水生浮游植物合成。長鏈多不飽和脂肪酸（long chain polyunsaturated fatty acid，LCPUFA）按照從甲基端開始第1個雙鍵的位置不同，可分為ω-3和ω-6多不飽和脂肪酸［1］。它同維生素、礦物元素一樣是人體的必需營養素，是一類在醫學［2］和保?。?］方面有重要作用的物質。ω-3長期攝入量不足容易導致心臟和大腦等重要器官功能障礙。ω-3不飽和脂肪酸中對人體最重要的兩種不飽和脂肪酸是二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）。EPA即二十碳五烯酸的英文縮寫，可以幫助降低膽固醇和甘油三酯的含量，促進體內飽和脂肪酸代謝。具有降低血液黏稠度，增進血液循環，提高組織供氧的作用?？煞乐怪驹谘鼙诘某练e，預防動脈粥樣硬化的形成和發展、預防腦血栓、腦溢血、高血壓等心血管疾病［4］，被稱為“血管清道夫”。DHA是神經系統細胞生長及維持的一種主要成分，是大腦和視網膜的重要構成成分，在人體大腦皮層中含量高達20％，在眼睛視網膜中所占比例最大，約占50％，因此，對胎嬰兒智力和視力發育至關重要［5-7］，同時還具有軟化血管的功效，俗稱“腦黃金”。研究發現一些植物來源的多不飽和脂肪酸能夠在人體內被轉化為EPA和DHA，但是效率比較低［8］。LCPUFA主要來源于深海魚類，但魚類自身合成能力很有限，主要靠食用單細胞藻類和浮游植物通過食物鏈富集［9］。由于人們生活水平的提高和漁業資源的減少［10］，以及重金屬和有機物造成的海洋污染［11-14］，LCPUFA的市場供需差額越來越大，單純地靠從魚類食物中攝取已不能滿足需要。利用基因工程手段，通過轉基因植物生產LCPUFA具有成本低、重金屬含量低、減少海洋捕撈、保護生態等優點，并能補充滿足人們的營養健康需求［15，16］。

1　LCPUFA的生物合成途徑

1.1需氧型LCPUFA合成途徑

人和動物可從膳食來源或通過轉換亞油酸（linoleic acid，LA）或亞麻酸（α-linolenic acid，ALA）而獲得ω-3長鏈多不飽和脂肪酸，LA和ALA是人類膳食中的必須脂肪酸。盡管人類和許多其他脊椎動物能夠將植物來源的LA或ALA轉換為長鏈多不飽和脂肪酸，但這種轉換的速率比較低，且隨著年齡的增長其轉化效率越來越低。由于農作物和園藝植物以及其他被子植物不具有合成長鏈ω-3脂肪酸如EPA、DHA所需要的酶。因此與動物不同，高等植物不能合成EPA和DHA，而微藻類、苔蘚和真菌可以合成ω-3長鏈多不飽和脂肪酸，它們的合成往往需要一系列的氧去飽和與延長反應（圖1），都是以必需脂肪酸LA和ALA為前體物質，丙二酸單酰輔酶A為二碳單元供體，在一系列脂肪酸脫氫酶與脂肪酸延長酶的催化作用下，最終合成長鏈多不飽和脂肪酸［17-19］。而目前研究清楚的主要有△4、△6和△8途徑（圖1）。

1.1.1△6途徑 △6途徑的研究最為詳細，該途徑以LA和ALA為底物，當以LA為底物時在△6-脫氫酶的去飽和作用下生成γ-亞麻酸（GLA），而γ-亞麻酸在△6-延長酶的延長作用下合成二高γ-亞麻酸（DGLA），最后二高γ-亞麻酸在△5-脫氫酶的作用下生成花生四烯酸（ARA）。當以ALA為底物時，在△6-脫氫酶的去飽和作用下生成十八碳四烯酸（SDA），而十八碳四烯酸（SDA）在△6-延長酶的延長作用下合成二十碳四烯酸（ETA），最后二十碳四烯酸（ETA）在△5-脫氫酶的作用下生成二十碳五烯酸（EPA）。其中ARA可以在 △17-脫氫酶的作用下生成EPA。

1.1.2△8途徑 △8途徑與△6途徑的主要差別在于△6途徑中最初底物首先在△6-脫氫酶的催化下進行脫氫反應，然后進行碳鏈延長。而△8途徑在△9-碳鏈延長酶的作用下，先進行碳鏈延長再氧化脫氫。當以LA為底物時在△9-延長酶的延長作用下生成二十碳二烯酸，而后二十碳二烯酸在△8-脫氫酶的作用下生成二高γ-亞麻酸（DGLA），最后二高γ-亞麻酸在△5-脫氫酶的作用下生成花生四烯酸（ARA）。當以ALA為底物時在△9-延長酶的延長作用下生成二十碳三烯酸，而后二十碳三烯酸在△8-脫氫酶的作用下生成二十碳四烯酸，最后二十碳四烯酸在△5-脫氫酶的作用下生成EPA。

1.1.3△4途徑 △4途徑一般發生在低等生物中，是EPA轉化為DHA的主要途徑。EPA在△5-延長酶的作用下生成二十二碳五烯酸（DPA）而后二十二碳五烯酸（DPA）在△4-脫氫酶的作用下最終生成DHA。

1.2厭氧型LCPUFA合成途徑

該途徑存在于海洋微生物體內。其在催化生成LCPUFA時與需氧型LCPUFA合成途徑［20］較類似，均以乙酰輔酶A為最初底物，丙二酸單酰輔酶A為二碳單元供體經過縮合、脫水及還原等過程不斷加入二碳單元，延長碳鏈合成最終產物。該過程中需要一種關鍵的酶即復合體酶一聚酮體合成酶（polyketide synthase，PKS），它是由基因組中的3個或4個開放閱讀框編碼的亞單位組成的多結構域酶［21］。該途徑比需氧型LCPUFA合成途徑相對簡單。

2　利用轉基因植物合成EPA和DHA

2.1△6途徑產生多不飽和脂肪酸的研究進展

將來自紫草科琉璃苣屬植物（Borago officinalis）的△6-desaturase基因和來自小立碗蘚（Physcomitrella patens）的△6-elongase基因和來自高山被孢霉（Mortierella alpina）的 △5-desaturase基因與種子特異性啟動子連接成功構建表達載體，轉化到亞麻（Linum usitatissimum）和煙草（Nicotiana tabacum）［22］中，從而獲得△6合成途徑。結果在種子中ARA，EPA只有很少的積累，大約只有1.0％ 的 AA和 0.8％的 EPA。同時也發現了大量的中間產物，其中γ-亞麻酸（g-linolenic acid，GLA）和十八碳四烯酸（stearidonic acid，SDA）等的含量較高［22］。結果分析認為第二步的反應即從SDA到ETA的過程中△6-elongase碳鏈延長的效率很低，僅為10％，出現“瓶頸”現象。

圖1　需氧型LCPUFA的生物合成途徑

當EPA在轉基因植物中能成功合成以后，Rbert等把目標放在了獲取更多的DHA，Robert等［23］將斑馬魚（Daniorerio）的△6/△5- 雙功能脫氫酶基因、秀麗線蟲（Caenorhabditis elegans）的△6-elongase基因 、鹽生巴夫藻（Pavlova salina）的△5-elongase基因和△4-desaturase基因分2步轉入擬南芥中，最終生成了0.5％的DHA，來自于斑馬魚（Daniorerio）的△6/△5-雙功能脫氫酶基因在行使去飽和作用時是以?；?CoA 中的脂肪酸為底物，其產物可直接被△6-碳鏈延長酶利用，大大提高了碳鏈延長效率，突破了“瓶頸”現象。但是可能是由于脫氫酶來源于動物在植物中的活性不高，導致最終得到的DHA的含量也不高。雖然結果不盡如人意，但是證明了在轉基因植物中可以合成DHA。

使用芥菜為轉基因植物合成LCPUFA，Wu等［24］采用相同的方法先將來自于畸雌腐霉（Pythium irregulare）的△6-desaturase基因和來自于海洋破囊壺菌（Thraustochytrium sp.）的△5-desaturase基因和來自于小立碗蘚（Physcomitrella patens）的△6-elongase基因與種子特異性啟動子連接成功構建表達載體，轉化到芥菜中，產生了約7.7％的ARA和0.8％的 EPA。為了得到更多的EPA，Wu等［24］在此基礎上又加入了來自于金盞花（Calendulaofficinalis）的△12-desaturase基因，目的在于為了增加LA的含量與減少18：2n-9副產物的生成，加入了來自于海洋破囊壺菌（Thraustochytrium sp.）的△6-elongase基因，為了加強碳鏈延長過程從而克服“瓶頸”現象。加入來自于畸雌腐霉（Pythium irregulare）的ω3 desaturase基因，為了促進花生四烯酸轉變為EPA，結果顯示最終EPA濃度達到了8％。隨后Wu等［24］又加入了來自于虹鱒（Oncorhynchus mykiss）的△5-elongase基因與來自于海洋破囊壺菌（Thraustochytrium sp.）的△4-desaturase基因，形成了DHA的合成途徑，研究人員又加入了溶血磷脂?；D移酶（LPAAT），它可以增強脂肪酸從磷脂中轉換到?；o酶A中的能力從而進一步克服“瓶頸”現象。最后他們將這9個基因與特異性啟動子連接成功后轉化，最后在種子中得到約0.2％的DHA，最高含量可以達到1.5％。

Kinney等［25］以大豆為轉基因受體，將來自于異枝水霉（Saprolegnia diclina）的 △6-desaturse基因，高山被孢霉（Mortierella alpina）的△6-elongase基因，高山被孢霉（Mortierella alpine）的△5-desaturase基因，異枝水霉（Saprolegnia diclina）的△17-desaturase基因，巴夫藻（Pavlova viridis）的△5-elongases基因，裂殖壺菌（Schizochytrium limacinum）的△4-desaturase基因，擬南芥的FAD3基因與特異性啟動子連接，成功構建表達載體后轉化大豆。Kinney等［25］最終得到的結果顯示，轉基因大豆種子中EPA的含量為l9.5％，幾乎沒有ARA。這是由于轉基因大豆中包含來自異枝水霉的△17-脂肪酸脫氫酶，催化ARA脫氫后形成了更多的EPA。而DHA的含量最高能達到3.1％。與轉基因煙草、亞麻不同的是大豆中碳鏈延長反應沒有受到明顯限制，從SDA到二十碳四烯酸的延長率為56％，使二十碳脂肪酸的含量高達40.2％［26］。

Cheng等［27］將畸雌腐霉（Pythium irregulare）的△6-desaturase基因，海洋破囊壺菌（Thraustochytrium sp.）的△5-desaturase基因和△6-elongase 基因，致病疫霉菌（Phytophytora infestans）的ω3 desaturase基因，金盞花（Calendula officinalis）的 △12-desaturase基因與特異性啟動子napin［28］連接，成功構建表達載體Napin-A。隨后他們將表達載體Napin-A轉化到無芥酸芥菜型油菜株系（Zero-erucic B. juncea line l424），高芥酸埃塞俄比亞芥株系（Higherucic B. carinata line）及無芥酸埃塞俄比亞芥株系（Zero-erucic B. carinata line）3個不同的轉基因受體中以探究不同轉基因受體對長鏈多不飽和脂肪酸合成的影響發現，無芥酸芥菜型油菜株系中EPA的含量最高達到10.8％，二十二碳五烯酸（DPA）達到0.4％，△6-desaturase與△5-desaturase的脫氫效率分別為57.7％和80.8％?！?-elongase的轉換效率為35.2％。在高芥酸埃塞俄比亞芥株系中EPA的含量最高達到13.7％，DPA達到1.4％，△6-desaturase與△5-desaturase的脫氫效率分別為81.8％和87.8％?！?-elongase的轉換效率為41.9％。在無芥酸埃塞俄比亞芥株系中EPA的含量最高能達到25％，DPA達到4.0％，△6-desaturase與△5-desaturase的脫氫效率分別為91.5％和86.5％?！? -elongase的轉換效率為51.9％。對比結果發現無芥酸埃塞俄比亞芥是最優的轉基因受體。來自麥角菌（Claviceps purpurea）的ω3 desaturase基因［29］具有將ω-6多不飽和脂肪酸轉變為ω-3多不飽和脂肪酸的功能，來自畸雌腐霉（Pythium irregulare）的ω3 desaturase基因［30］能高效的將花生四烯酸（ARA）轉變為EPA。將這兩個基因與畸雌腐霉（Pythium irregulare）的△6-desaturase基因，海洋破囊壺菌（Thraustochytrium sp.）的△5-desaturase基因和假微型海鏈藻（Thalassiosira pseudonana）的elongase基因一起構建表達載體轉化芥菜，結果顯示這兩個基因能大大增加芥菜中EPA的含量［27］。這為今后在植物中合成長鏈多不飽和脂肪酸提供了新的高效的基因。

Ruiz-Lopez等［31］以亞麻薺（Camelina sativa）為轉基因受體，將來自于海洋真核微藻（Ostreococcus tauri）的Δ6-desaturase基因，小立碗蘚（Physcomitrella patens）的△6-elongase基因，海洋破囊壺菌（Thraustochytrium sp.）的△5-desaturase基因，大豆疫霉菌（Phytophthora sojae）的△12-desaturase基因，致病疫霉（Phytophthora infestans）的ω3 desaturase基因與特異性啟動子連接，成功構建EPA表達載體。結果顯示EPA的含量最高可以達到31％。其中SDA的平均含量為2.9％，表明了△6-elongase基因具有高效的延長作用，突破了“瓶頸”現象。ω-6多不飽和脂肪酸GLA，二高γ-亞麻酸與ARA的含量分別為2.7％、0.8％和1.7％，且ω-3多不飽和脂肪酸與ω-6多不飽和脂肪酸的濃度比值為9∶1，表明該途徑能有效的減少ω-6多不飽和脂肪酸及中間產物的產生。為了進一步得到DHA，Ruiz-Lopez等依據以上研究，在其基礎之上加入來自于海洋真核微藻（Ostreococcus tauri）的△5-elongases基因，赫氏圓石藻（Emiliania huxleyi）的 Δ4-desaturase 基因，將這7個基因與特異性啟動子連接，成功構建DHA表達載體。最終結果顯示EPA與DHA的含量最高能達到12％和14％［31］，非常接近于魚油中EPA與DHA的含量（即13％EPA，13％DHA）。

目前所知，得到的DHA含量最高的是 Petrie和Liu等［32］在擬南芥中利用△-6途徑得到的。DHA的最高含量能達到15.1％。Liu等將來自于芽殖酵母（Lachancea kluyveri）的△12-desaturase基因，畢赤酵母（Pichia pastoris）的 △15-desaturase 基因，細小微胞藻（Micromonas pusilla）的 △6-desaturase基因，塔胞藻（Pyramimonas cordata）△6-elongases基因和△5-elongases基因，鹽巴夫微藻（Pavlova salina）的△5-desaturases基因和△4-desaturases 基因與特異性啟動子以及煙草花葉病毒的沉默阻抑物連接成功構建表達載體，轉化擬南芥［32］。來自于細小微胞藻（Micromonas pusilla）的 △6-desaturase在整個合成途徑中起到了至關重要的作用，△6-desaturase具有偏向性，在植物中對ω3脂肪酸底物的轉換效率高于對ω6脂肪酸底物的轉換效率即對作為脂肪酸底物的ALA的△6-去飽和酶的活性高于對LA的△6-去飽和酶活性，從而提高了EPA、DPA、DHA的水平，且該△6-desaturase還具有△8-desaturase的活性。同時最重要的一點是對作為脂肪酸底物的ALA-COA的△6-desaturase活性要高于對作為脂肪酸底物的連接與磷脂酰膽堿（PC）的sn-2位置的ALA的△6-desaturase活性，因此大大的提高了△6-elongases的延長效率，突破了“瓶頸”且能在植物中高效的表達。在此途徑中還有一個重要的酶即來自于塔胞藻的△5-elongases，該酶可以高效的將EPA轉換為DPA從而提高DHA的含量［32］。

2.2△8途徑產生多不飽和脂肪酸的研究進展

Qi等［33］在擬南芥中成功構建了多不飽和脂肪酸的合成途徑。將 Ca35S啟動子分別與來自于等鞭金藻（Isochrysis galbana）的△9-elongases基因、纖細裸藻（Euglena gracil）的△8-desaturase基因及高山被孢霉（Mortierella alpina）的△5-desaturase基因連接，成功構建合成 LCPUFA的△8途徑，最終雖在轉基因擬南芥葉片中檢測到含量為 18.8％的非內源二十碳 LCPUFA，其中 ARA 為 6.6％，EPA 3.0％，但種子中幾乎沒有目的脂肪［33］。此途徑中的△9-碳鏈延長酶直接利用擬南芥內酰基-CoA庫中富含的LA-CoA、ALA-CoA進行碳鏈延長，酶促底物不需由磷脂庫向酰基輔酶A庫的轉運，繞過了“瓶頸”有利于LCPUFA 的起始合成。雖結果不是很理想，但提供了一個產生LCPUFA的新方案。

3　轉基因植物合成EPA、DHA存在的問題及解決方法

3.1?；?PC庫與?；?COA庫之間高效的酰基轉換

在植物、苔蘚和微藻類中，VLC-PUFA去飽和作用天然發生在主要屬于酰基-PC庫的脂肪酸底物，而延長作用發生在?；?COA庫的底物，也就是說在合成LCPUFA的過程中去飽和反應與碳鏈延長反應的底物需要在?；?PC庫與?；?COA庫之間來回不停地轉換，但是在植物體內植物內源的?；D移酶并不能有效的催化它們之間的轉換，從而影響最終EPA與DHA的產量［34］。其實脂肪酸在?；?PC庫與?；?CoA庫之間相互轉換時，多種酶可促進此過程。酰基-CoA：溶血磷脂?；D移酶（the acyl-CoA：lysophospatidylcholine acyltrasferase，LPCAT）就是其中的一種，Domergue等［35］認為此酶對目的脂肪酸的積累可能非常有用，因其不僅可催化酰基-CoA中的脂肪酸轉移到酰基-PC庫中，也可催化溶血磷脂中sn-2脂肪酸形成?；?CoA，從而實現高效的酰基轉換。同時還可使用依賴于?；?CoA的△6-desaturase，能大大提高△6-elongases的延長效率，最終產生更多長鏈多不飽和脂肪酸。

3.2合成LCPUFA時產生的中間產物和副產物

前面介紹的研究中轉基因植物在合成長鏈多不飽和脂肪酸的過程中也都發現生成了大量的中間產物（GLA；dihomo-gamma-linolenic acid，DGLA）和副產物（sciadonic acid，SCA；juniperonic acid，JUN），約占35％［37］。這些中間產物和副產物組成復雜且營養價值低，應將其濃度降到最低［38］?？衫镁哂衅眯缘拿福鐏碜杂诩毿∥澹∕icromonas pusilla）的 △6-去飽和酶［32］及更加高效的酶。

3.3提高終產物DHA的含量

在目前的研究中，人們已經成功的在轉基因植物中穩定獲得EPA與DHA，DHA的濃度最高能達到15.1％［32］，但在一定程度上我們還可以繼續進行合成途徑的優化得到更大濃度的DHA。（1）選取合適的LCPUFA受體，種子中富含亞油酸或亞麻酸如大豆，油菜等油料植物都是很好的LCPUFA受體。（2）要選取合適的目標基因，有時候基因的功能雖然相同但是來源不同的兩個基因在行使功能的時候效率可能相差很大。同時我們拿到目標基因以后要進行密碼子優化［39］，可以提高LCPUFA的合成效率。（3）載體的構建，構建載體時需要選擇合適的啟動子，選擇啟動子時不僅要考慮基因表達的時間特異性、空間特異性還要注意受體植物本身的特異性［28］。在構建表達載體時，每一個轉化的基因前后都有特異的啟動子與終止子從而構成一個完整的表達框?；蚬こ淌侄慰梢陨a出只含有EPA的ω-3不飽和脂肪酸（針對中老年人，因為EPA具有類激素效應，孕婦、兒童等特殊群體要避免攝入）；或者生產出高DHA的ω-3不飽和脂肪酸，適合不同人群的需要。利用基因工程改良作物，在植物中生產EPA或DHA將大大的彌補市場上長期缺乏的魚油資源，具有重要的應用價值和前景。

4　展望

長鏈多不飽和脂肪酸，尤其是EPA與DHA對人體健康和發育具有非常重要的作用，一般約20 kg深海魚類可以提取出1 kg魚油，1 kg魚油中大概有30-120 g是DHA（魚油中DHA和EPA的比例通常都保持在1∶3左右）。即一小瓶深海魚油保守估計也需要20 kg以上的鯖魚（Mackerel）、沙丁魚（Sardines）、金槍魚（Tuna）、鯨魚（Whale）或者其他深海魚類。但大西洋藍鰭金槍魚瀕臨滅絕，其他多種金槍魚的生存狀態也先后拉響了警報，多種鯨魚數量更是銳減。當各種海洋資源在人類巨大的消費能力下都顯得捉襟見肘時，現有的魚油越來越不能滿足人們的需求［40］。利用基因工程技術在植物中合成長鏈多不飽和脂肪酸可以化解深海魚油資源的匱乏，滿足人們的健康需求。已有的研究結果展示出了在植物中生產多不飽和脂肪酸EPA、DHA的巨大潛力，按照EPA或DHA占植物含油量的5％-10％計算，一畝油菜可以生產EPA或DHA 4-8 kg，按4 kg計算也相當于33-133 kg的深海魚油。而且利用

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（責任編輯 狄艷紅）

Research Progress on Genetic Engineering for Long-chain Polyunsaturated Fatty Acids EPA and DHA

LI Wen-zong WANG Lei
（Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

Long-chain polyunsaturated fatty acids（LCPUFAs）play an important role in maintaining human health. The demand of edible EPA and DHA has significantly increased in recent years. However，the fish oil resource is obviously reduced due to the environmental pollution and the decline of the fishery resources，thus can't meet the demands of people. The researchers have successively separated multiple genes that involved in LCPUFA synthesis and clarified the multiple LCPUFA synthetic pathways. LCPUFAs，especially DHA and EPA，have been successfully produced in monocot and dicot plants through genetic engineering. We summarized the latest research progress of LCPUFAs bio-synthesis and genetic engineering in higher plants，and analyzed the issues of LCPUFA synthesis，then proposed the possible solutions，and had an prospect of LCPUFA by genetic engineering.

long-chain polyunsaturated fatty acids；EPA；DHA；transgenic plant

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.001

2015-11-13

李文宗，男，碩士，研究方向：植物分子生物學與基因工程；E-mail：lwzm1010@163.com

王磊，男，博士，研究員，研究方向：植物分子生物學與基因工程；E-mail： wanglei01@caas.cn