核糖體展示研究進展

郭園

（內蒙古農業大學職業技術學院，包頭 014109）

核糖體展示研究進展

郭園

（內蒙古農業大學職業技術學院，包頭 014109）

核糖體展示是一種無細胞系統，可以從文庫中篩選蛋白質和多肽。翻譯的蛋白質及其mRNA同時結合在核糖體上形成mRNA-核糖體-蛋白質三聚體，通過配體親和分離得到功能性蛋白及其編碼的mRNA，轉換成對應的DNA后進行相關蛋白的表達，可用于抗體及蛋白質文庫選擇、蛋白質體外改造等，而且其可以展示較大的文庫而不受細菌轉化的限制，可對毒蛋白、蛋白酶敏感和不穩定的蛋白質進行篩選，也可在特定位點進行氨基酸修飾。就核糖體展示技術的研究進展及其在蛋白質進化和篩選方面的應用進行綜述。

核糖體展示；抗體；選擇；蛋白質進化

展示系統可以從蛋白和肽為表型的文庫中，篩選與它們基因型相關的DNA或RNA，同時也可以通過多輪突變、篩選、復制進行進化，最終改變表型特征。而成功的展示則依賴于功能蛋白恢復其遺傳信息的能力。目前，已設計和驗證出一些基于細胞的展示方法，如噬菌體展示［1，2］和細胞表面展示［3-5］。另外，還有無細胞方法，如核糖體展示［6，7］和mRNA 展示［8，9］。

核糖體展示技術是在體外進行的，可避免一些基于細胞展示系統的限制。通過在無細胞系統中形成mRNA-核糖體-蛋白質三聚體（PRM），將新生蛋白與它們的相關mRNA分子聯系起來，通過蛋白質的功能特性選擇遺傳物質。mRNA可進行擴增或通過RT-PCR反轉錄成DNA，再進行循環、突變或克隆。近些年，研究人員利用核糖體展示技術進行廣泛的研究，對傳統的核糖體展示技術進行了改進，成功篩選到多種對靶分子有特異性親和力的抗體、酶和多肽等大分子及一些小分子。

1　核糖體展示原理

核糖體展示技術的本質是利用形成的mRNA-核糖體-蛋白質三聚體復合物，通過核糖體把新生蛋白和其mRNA聯系起來。最早的核糖體展示系統利用E. coli S30進行肽的篩選［10］，合成的DNA文庫編碼隨機肽序列通過加入氯霉素終止翻譯，產生多核糖體復合物。展示了肽表位的特定復合物通過固定化抗體進行捕獲，得到的多核糖體加入EDTA使其分解釋放綁定的mRNA，進而通過RT-PCR反轉錄成cDNA（圖1）。之后發展出的真核核糖體展示系統ARM（antibody-ribosome-mRNA）則被用于功能性單鏈抗體片段的篩選［7，11］。通過刪除PCR片段的終止密碼子產生真核PRM復合物，產生的PRM復合物隨后通過抗原包被的磁珠進行捕獲，mRNA通過RT-PCR無需解離核糖體復合物就可得到相應的DNA。而特異的復合物可以從突變文庫中進行富集，改進的ARM展示還可在mRNA中引入突變，用于體外蛋白質定向進化和酶的篩選［12］。

圖1　核糖體展示原理

轉化效率限制了基于細胞系統的文庫多樣性，核糖體展示相對噬菌體和細胞表面展示有很多優勢。較大的文庫可以通過每個循環進行篩選，PCR產物可以直接用作模板，避免克隆過程，很容易就可得到巨大多樣性的PCR文庫，展示文庫的大小僅取決于反應中的功能性核糖體的數量，可以高達1014/mL［7］。因此，更大的文庫給核糖體展示提供一個絕佳的機會，可用于選擇稀有的序列和高親和性結合位點。利用PCR方法還可在選擇后將更多的多樣性引入DNA庫中，這就提供了一個有效的蛋白質進化途徑。此外，無細胞系統可以表達有毒的、對蛋白酶敏感或不穩定的蛋白，這些都是細菌表達系統通常達不到的［13］。真核無細胞系統也可進行翻譯后修飾，擴展了展示功能相關蛋白的可能性。此外，核糖體展示還能將修飾的氨基酸，如化學標記的或是非天然氨基酸引入蛋白質的特定位置［14］。

2　PURE核糖體展示技術

核糖體展示技術雖然已出現一段時間，但是傳統的展示技術存在一定的缺陷。核糖體展示中一些內在組分的存在，如無細胞蛋白合成系統中細胞提取液中的核酸酶等，會減弱mRNA-核糖體-蛋白質三聚體的穩定性，影響實驗結果。Kanamori等［15］開發了一種高效可控的核糖體展示系統，即基于重組元件的蛋白合成系統PURE（protein synthesis using recombinant elements）。該系統中的mRNA-核糖體-蛋白質三聚體高度穩定，核酸酶和其他抑制因子的活性在這個系統中非常低，篩選到的mRNA可以輕易被反轉錄成cDNA。PURE系統已應用到抗體工程中，如利用該系統進行表位定位和抗體親和力成熟度研究等。這些研究結果均表明PURE系統比傳統核糖體展示方法更高效。

高效穩定的三聚體對核糖體展示至關重要，PURE系統不同于以往傳統的基于細胞提取物的無細胞翻譯系統，因為它含有明確的組分，主要包含轉錄、翻譯和能量再生的必需因子，而其他與蛋白合成過程不相關的物質，包括氨基酸代謝酶、能量消耗因子和核酸酶、蛋白酶等的含量則很少等。這種優勢使科研人員能夠繞過蛋白質合成反應過程中的障礙，在一個可重復、可靠的系統中進行核糖體展示實驗。此外，在細胞中形成的mRNA-核糖體-蛋白質三聚體復合物有細胞毒性，因此，原核和真核生物對于停滯的核糖體通常都有相應的補救系統，如在E. coli中，tmRNA（ssrA）和SmpB蛋白介導的反式翻譯系統能在合成不完整的蛋白加上標簽，使核糖體從RNA上滑落，且新合成的帶標簽的蛋白也會被SmpB等蛋白降解。基于大腸桿菌S30提取物的核糖體展示也含有這樣的停滯核糖體補救系統，該系統的存在不利于PRM復合物的穩定，因此需要添加ssrA的反義寡核苷酸以抑制反式翻譯系統的活性。但PURE系統組分中并不含有SmpB蛋白，因而其PRM復合體更加穩定。此外，這個系統的另一個優點是其中的組分可以根據實驗目的進行調整，如釋放因子、tRNA或者是非天然的氨基酸等。利用PURE系統無釋放因子的mRNA終止密碼子可以很容易地形成穩定的mRNA-核糖體-蛋白質三聚體。

3　IVC技術用于密碼子抑制tRNA的篩選

篩選和擴增是蛋白質和核酸定向進化的常用工具，篩選和鑒定需要催化劑和產物在一個獨立的區域中配對。體內篩選使用活細胞，而體外篩選與體內選擇相比更簡單、更容易操作，同時可以解決細胞毒性的問題，可從豐富、多樣的文庫開始進行。Griffiths和Tawfik 設計了一個體外劃分技術 IVC（in vitro compartmentalization），用于體外生物催化劑等生物大分子的進化，催化劑在一個區劃的油包水乳液中與催化劑產物配對［16］，該技術已經成功用于如核酶和普通酶等生物催化劑的改進中［17，18］。

Ogawa等［19］利用IVC技術結合通讀核糖體展示原理提出了體外抑制tRNA選擇的概念。他們使用區劃油包水乳液微胞中的雙鏈DNA作為模板庫（圖2），模板包含轉錄和翻譯的觸發器，一個琥珀終止密碼子和另一個轉錄觸發器用于反密碼子或反密碼子環隨機絲氨酸tRNA基因。轉錄生成兩種類型的RNA：tRNA和可翻譯的mRNA（mRNA-tRNA）。當tRNA 抑制mRNA終止密碼子UAG的時候，完整的蛋白質翻譯后仍附著在mRNA上，其中利用的即是通讀核糖體展示技術。通過這種方式，有活性的抑制tRNA能夠被選擇出來并讀出它們的序列。經過充分的改進后，這種方法可以成為一個很好的體外tRNA進化工具。

圖2　IVC通讀核糖體展示擴增循環

4　單鏈可變片段篩選

抗獨特型抗體是臨床前和臨床開發過程中的免疫原性和藥代動力學實驗發展的關鍵試劑。Chin等［20］將噬菌體展示和核糖體展示結合起來，用以分離單克隆抗獨特型抗體。抗獨特型抗體通過噬菌體展示的scFv文庫進行富集，利用生化表位競爭測試鑒定中和IgE 結合的抗獨特型抗體。采用隨機點突變的方法在核糖體展示中使噬菌體衍生的抗獨特型抗體迅速親和成熟。通過2輪篩選使抗獨特型抗體的中和活性提高近20倍，并保持了對病人抗體的特異性，可用于抗藥抗體和藥代動力學分析中，實現了快速生產抗IgE 的抗獨特型抗體。

此外，開發高親和性、強特異性的試劑對于監測環境中的毒素和激素十分重要。Zhao等［21］利用核糖體展示，在非免疫小鼠的脾細胞的文庫中篩選抗雙酚A的scFv片段。研究揭示出核糖體展示可以從非免疫天然文庫中分離出小分子的結合劑，而無需任何體內步驟，可高效快速的產生重組抗體。Luo等［22］構建了抗殺螟松單鏈可變片段的cDNA文庫，通過核糖體展示篩選特異性scFv，用于快速精確檢測食品樣本中的殺螟松，顯示出核糖體展示在殺蟲劑抗體片段篩選方面的潛力。

在疾病治療和診斷方面，核糖體展示技術也有一定的應用。Chen等［23］利用核糖體展示技術進行乙肝病毒HCV外殼E2連接肽的功能篩選。他們利用核糖體展示技術親和篩選，篩選到的PE2D肽對HCV E2蛋白顯示出高特異性和親和性，可阻斷E2結合到干細胞上，抑制乙肝病毒HCV的侵入，可作為潛在的抗病毒藥物。Zhao等［24］同樣利用核糖體展示技術，從人的單鏈可變片段scFv基因文庫中篩選抗狂犬病病毒的抗體片段。其他一些課題組也相繼利用核糖體展示技術對單鏈可變片段進行了篩選［25，26］。此外，核糖體展示技術已發展成為一個新的免疫檢測策略［27，28］，對于藥物免疫檢測發展具有重要意義。

5　酶的定向進化

核糖體展示在體外酶的進化應用中受到酶的范圍和催化效率的限制。核糖體展示用于酶活的篩選只有在三聚體完整情況下可行，酶分子催化的反應產物連接到mRNA 上，否則基因型-表型的關聯將會消失。最有效的進化酶的方式是利用定向選擇壓力作用于酶的各個方面，如底物結合、產物形成和速率加速等，表型和基因型相關的篩選結果將被保留下來。到目前為止體外方法中只有IVC方法最佳，在油包水乳液中，油分散了液滴，阻止基因、體外合成蛋白及反應產物形成交叉污染，因此能夠保持表型和基因型的關聯。

研究人員在酶與底物間的自由分子間相互作用的條件下進行酶催化活性的篩選［29］。突變文庫中，不穩定的mRNA-核糖體-蛋白質三聚體復合物以油包水乳液的方式被區劃在體外，每一個液滴平均含有不超過一個單一的復合物。之后復合體在液滴中分解，釋放的酶分子酶學特性在選擇性壓力下自由地與底物作用，提供了一個高效選擇催化活性的機會。定向進化是用于蛋白質在特定應用中進行定制化的一種手段，雖然已經取得一定的成果，但是其潛力才剛開始展現出來。未來生成定制蛋白的發展，在很大程度上依賴于改進現有的進化方法和新方法的出現。而經過改進的區劃核糖體展示則可被用于酶活性的篩選中，可在單分子水平下篩選任何一種酶。

6　展望

雖然早在20年以前就開始有關于核糖體展示技術的報道，但是這項技術并沒有像噬菌體展示技術一樣被廣泛應用，原因是在細胞提取液中準備穩定的三聚體復合物比較困難，而無細胞蛋白合成系統中含有許多抑制因子抑制了有效的核糖體展示。最近發展出的PURE系統作為無細胞蛋白合成系統，可以使目的基因通過核糖體展示技術分離得到。同時正是由于如文庫多樣性豐富這類優于噬菌體展示的特點，使得核糖體展示技術有更加廣闊的應用前景。未來隨著技術的發展，核糖體展示技術除了進行選擇目的蛋白或抗體外，也可以用于生產篩選的蛋白。體外展示篩選表位候選物時經常會遇到假陽性的情況，而核糖體展示篩選到的肽可直接進行合成，通過Western blot進行分析，這樣就不需過表達和純化步驟。通過PCR擴增DNA加入到展示系統中，可以對大量的肽同時進行研究。因此，未來利用簡單、高效的核糖體展示策略就可以完成低成本、高通量的表位篩選工作。

除了生物學領域的研究外，在化學生物學和材料化學領域中核糖體展示技術還將更多的被用于肽適配體的篩選，從由親水氨基酸組成的導電聚合物文庫中進行篩選，結合的適配體通過石英晶體微量天平進行測定，進而進行圓二色性解析其二級結構。為構建新型功能材料，還可以將不同種類的成分結合到一起。目前，研究人員已開始設計可結合有機和無機材料的分子，這些分子的篩選多使用體外選擇技術，肽適配體則用于不同種類的非生物材料的篩選，如金屬氧化物、金屬、量子點和合成聚合物等［30，31］。Li等［32］使用核糖體展示技術，從隨機文庫中篩選導電聚合物3-己基噻吩-2，5-二基（P3HT）的肽適配體。P3HT屬于半導體聚合物家族，常用于太陽能電池、晶體管和傳感器中。核糖體展示可成功用于親水肽適配體的篩選，而這些肽均顯示出了特異的親和活性，親水氨基酸組成的肽對于疏水聚合物具有非常好的結合能力。通過核糖體展示得到的肽適配體未來也會用于生物傳感器的制備中，如單壁碳于碳納米管的篩選［33］。可以預見的是改進的核糖體展示技術將會有更加廣泛的應用前景，將從蛋白質的篩選擴展到小分子篩選中。

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（責任編輯 馬鑫）

Current Progress on Ribosome Display

GUO Yuan
（Vocational and Technical College，Inner Mongolia Agricultural University，Baotou 014109）

Ribosome display is a cell-free system for the selection of proteins and peptides from large libraries. It uses the principle of coupling the translated proteins（phenotypes）and their corresponding mRNA（genotypes）to ribosome and the stable protein-ribosomemRNA complexes are formed. Then，the functional proteins and the corresponding encoding mRNAs are obtained by the simultaneous affinity separation of ligands，and they are converted and amplified as DNA for further expressions of related proteins，as well as selection of antibody and protein libraries，in vitro modification of proteins. It may display very large libraries while it is not limited by bacterial transformation. It is also suitable for screening the toxic，proteolytically sensitive，and unstable proteins，and allows the incorporation of modifying amino acids at defined loci. In this paper，research progress on ribosome display systems and their applications in the selection and evolution of proteins are reviewed.

ribosome display；antibody；selection；protein evolution

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.004

2015-10-15

郭園，女，講師，研究方向：微生物與免疫；E-mail：guoyuan_2003@163.com