大腸桿菌中生物藥物的生產現狀及展望

蔡東梅 龔國利

（陜西科技大學食品與生物工程學院，西安 710021）

大腸桿菌中生物藥物的生產現狀及展望

蔡東梅 龔國利

（陜西科技大學食品與生物工程學院，西安 710021）

大腸桿菌是表達藥用異源蛋白的首選微生物，此宿主目前已生產約30％被批準的藥用蛋白。大腸桿菌具有生長迅速、產率高、效益大及易擴大培養的優勢，促使它成為生物技術行業中蛋白大規模生產常選擇的表達宿主。但大腸桿菌中密碼子偏好性的存在及糖基化、磷酸化和蛋白水解加工等翻譯后修飾的缺乏會限制其生產較復雜的重組生物藥物。綜述了大腸桿菌表達系統中幾項滿足生物技術產業需求的相關創新技術，介紹如何利用相關技術進步使大腸桿菌糖基化異源蛋白和表達包括全長糖基化抗體在內的復雜蛋白的過程，并對存在的問題及其研究前景進行展望，旨在為幫助大腸桿菌順利生產更復雜的藥用糖基化蛋白。

大腸桿菌；生物制藥學；密碼子偏好性；分子伴侶

藥物的發現及發展需要表達大量正確折疊的重組蛋白。這些藥用重組蛋白普遍用于治療各種疾病，也常作為篩選新藥物的靶蛋白。大腸桿菌具有生長速度快、基因操作方便和重組蛋白合成速度快等優點，使它成為表達多種重組蛋白最令人滿意的宿主之一［1，2］。在少數情況下，它能達到非常高的表達水平，其表達量能上升到細胞總蛋白的30％。大腸桿菌是第一個用來生產生物藥物的表達載體，它的發展促使了1982年用于糖尿病治療的人胰島素得到相關監督部門的批準。1994年牛生長激素（bGH）的批準為生產源自大腸桿菌的藥用異源蛋白設立了新標準（表1）。引人矚目的一點是胰島素和牛生長激素都需要氧化蛋白折疊，此外，胰島素是一種異質二聚體，重組胰島素和生長激素的成功獲得突出了基于大腸桿菌生產的多功能性和有效性。然而，由于大腸桿菌外源基因中存在大量會導致翻譯錯誤的稀有密碼子。這些錯誤若在藥用蛋白使用的情況下，即便低水平表達都能導致人體不良的免疫反應，蛋白翻譯中存在的細胞錯誤也可能影響其三級結構，從而間接影響重組蛋白生物活性。為了在大腸桿菌中獲得經合適折疊加工且具有生物活性的藥用蛋白，這篇綜述中，我們將關注關鍵生化參數“理想調制”的內容，包括大腸桿菌中密碼子偏好性、蛋白質翻譯、分子伴侶及翻譯后修飾。

表1　大腸桿菌生產的生物藥物歸納表

1　大腸桿菌中密碼子偏好性

細胞質中同源氨基酰化tRNA的水平可以顯示大腸桿菌中密碼子偏好性。較多的密碼子在基因組中能普遍存在，也能高水平地進行表達。稀有密碼子在基因組中也能經常遇到，其表達水平較低，在大腸桿菌中稀有的密碼子在真核生物的基因組中卻是豐富存在的。含有稀有密碼子的外源基因表達時會出現翻譯錯誤，這是由于在相關位點上存在核糖體衰減，在這些位點上氨基酸和稀有密碼子tRNA耦合，這種現象不能避免［3］。此外，由于外源基因上稀有密碼子存在而導致的翻譯錯誤可能包括氨基酸替代、翻譯的移碼突變或提前終止等［4，5］。Kane等［6］發現在框架內，稀有AGA密碼子中兩個氨基酸會存在跳躍現象。蛋白質的質量很大程度上被密碼子的偏嗜性影響，這是由于賴氨酸并入了AGA密碼子處的精氨酸［7］。因此，如果蛋白的質量由于翻譯錯誤存在瑕疵，即使處于非常高的水平，重組蛋白的表達也是無用的。在大腸桿菌中問題最多的稀有密碼子是AGA、AGG、CGG、CGA、CGG（精氨酸）、AUA（異亮氨酸）、GGA（甘氨酸）、CUA（亮氨酸）、CCC（脯氨酸）和AAG（賴氨酸）［8］。已經有記錄表明，稀有精氨酸密碼子AGG和AGA，在大腸桿菌中分別出現的頻率為0.14％和0.21％［9］。

現有幾種方法可以用來避免大腸桿菌中密碼子的偏嗜性。一種方法是基于密碼子偏好性去合成全基因組，這是目前首選的能改善大腸桿菌中外源蛋白表達的方法［10］，但這一方法全基因合成的花費較高。另一種方法是利用外源基因序列的定點誘變產生密碼子，然而，這一方法昂貴且隨機性強，因為無論何時總有幾個核苷酸需要被修正。第三種策略則通過大腸桿菌菌株與能編碼tRNA的質粒進行共轉化，最終同源得到稀有密碼子［11］。通過增加限制性tRNA的拷貝數，大腸桿菌就能匹配外源基因中密碼子的偏好性頻率。幾種商業化質粒，如pRARE，現在已被用于大腸桿菌中稀有tRNA的共表達。另外，這些質粒中包含p15A復制起始位點，該復制起始位點可以維護存在Cole1復制起始位點的大腸桿菌菌株。幾種可用的商業化菌株如BL21 （DE3）Codonplus-RIL，BL21（DE3）codonPlus-RP 和Rosetta（DE3），這些菌株的質粒含有編碼tRNA為稀有密碼子的基因序列［12］。這一方法在提高重組人干擾素的生產上已有應用。含有人類干擾素-α2a基因和argU基因的質粒能編碼稀有tRNA為精氨酸（AGG/AGA），大腸桿菌BL21（DE3）的共轉化會導致IFN-α2a和重組蛋白具有更高水平的表達，這些蛋白可占總蛋白的25％［13］。在另一項研究中發現在替換稀有精氨酸密碼子為更常使用的密碼子后，人干擾素2 b的產量會增加9.5-11.5倍［14］。含有pRARE質粒的大腸桿菌Rosetta（DE3）菌株也被用來表達不同的人源蛋白，研究表明實驗的68種蛋白中的35種其重組蛋白產量都能急劇增加［15，16］。

2　蛋白質翻譯

大腸桿菌中有效的翻譯起始位點需要一個核糖體結合位點（RBS），核糖體起始位點包括Shine-Dalgarno（SD）序列和翻譯起始密碼子［5］。Shine-Dalgarno（SD）序列一般位于起始密碼子AUG上游的第7-9個核苷酸［17］。當翻譯起始位點從含有共識（Shine-Dalgarno，SD）序列AAGGAGG的mRNA開始時會更有效，核糖體結合位點的二級結構對于翻譯起始非常關鍵，而翻譯效率通過大量存在的胸腺嘧啶和腺嘌呤會進一步增加［18］。翻譯起始位點的效率同樣也受到起始密碼子后核苷酸的影響，并發現腺嘌呤在高度表達的基因中會普遍存在［19］。故翻譯起始會受到各種因素的影響，包括共識的SD序列，起始密碼子的核苷酸上游，核糖體結合位點的二級結構在內［20］。阻止核糖體連接的mRNA的二級結構在很大程度上可能會影響蛋白表達［21］。同樣也觀察到單一堿基的變化會破壞靠近SD區域的二級結構，也會導致RNA噬菌體MS2外殼蛋白表達水平發生500倍的改變。Seo和Park等［22］已開發一種極有效和簡單的方法去設計5'-非翻譯區（5' UTR），這能用于大腸桿菌中的可調表達，因為含有SD和AU序列的5' UTR在蛋白翻譯中發揮顯著的作用，重裝蛋白的表達水平能被5' UTR區域中簡單變化所操縱。研究發現，mRNA中的二級結構能被RNA解旋酶破壞，如大腸桿菌的DEAD蛋白質。

研究表明，從T7啟動子起始時，DEAD蛋白質的表達會將β-半乳糖苷酶表達量增加30倍，但在lac啟動子起始時，表達水平卻沒有顯著增加［23］。然而當DEAD蛋白質不表達時，從T7啟動子起始的β-半乳糖苷酶的表達與lac啟動子相比，雖然最終轉錄率增加10倍，但表達量卻減少10倍［24，25］。所以DEAD-box蛋白質在穩定mRNA時發揮了重要作用，因此DEAD-box蛋白質能被用以改善伴有疑似問題mRNA二級結構的基因表達。

在細菌基因組中，UAA是使用最頻繁的終止密碼子；其次是UGA和UAG。在翻譯過程中，閱讀終端密碼子中的一個錯誤會延長蛋白合成，直到mRNA中另一個終止密碼子出現。連讀會導致含有額外C末端氨基酸的肽的合成，在人IFN-α2b中若用UGA替換UAA，蛋白表達水平會增加2倍［26］。研究表明，轉錄終止子能通過在mRNA的3'末端產生莖環結構使mRNA穩定。在大腸桿菌中，終止密碼子UAA更為普遍地用于翻譯終止。通過增加連續終止密碼子或使用一個延長的UAAU終止密碼子，翻譯終止的效率能得到改善［27］。蛋白合成過程中的翻譯錯誤能導致框架遷移突變、過早截斷、更低的表達量和氨基酸的錯誤摻入，會對大腸桿菌中重組蛋白質量產生不利影響，而高水平表達和正確的表觀分子質量卻不能保證重組蛋白的翻譯完整［28，29］。

3　優化蛋白折疊的分子伴侶

使用大腸桿菌宿主進行生物藥物生產時遇到的一個主要問題是：異源蛋白質主要以不溶性聚集物包涵體的形式進行積累。而從這些包涵體中提取重組蛋白是一個冗長、繁瑣的過程，需要一系列變性和復性步驟才能獲得可溶并正確折疊的重組蛋白。一種改善大腸桿菌中蛋白質溶解度的策略是使用分子伴侶。在蛋白質合成過程中，通過分子伴侶和新生多肽鏈的相互作用阻止折疊過程中的聚集。一些分子伴侶能阻止蛋白聚集，而一些能促進折疊錯誤的蛋白重新折疊和溶解［30］。在大腸桿菌中應用最廣泛和重要的細胞質伴侶是DnaK、DnaJ、GrpE、GroEL和GroES和觸發因素（表2），這些伴侶能單獨及組合使用，用以改善大腸桿菌中蛋白質的溶解度［31，32］。改善蛋白質再折疊的最有效并已廣泛使用的伴侶組合是GroEL-GroES和DnaK-DnaJGrpE［33-35］。另外觀察到DnaK-DnaJ-GrpE能協助未折疊蛋白的釋放，GroEL-GroES能阻止肽的降解，觸發因素與GroEL合作能改善GroEL和底物的結合，從而促進蛋白的折疊［36］。其他的伴侶如ClpB（Hsp 100），與DnaK組合后能增溶蛋白并防止其聚集［37］。其他熱休克蛋白，如IpbA和IpbB，也能阻止熱變性蛋白聚集。為了改善大腸桿菌中重組異源蛋白的生產，應該分析分子伴侶的不同組合，從而確定最有效的組合方式。研究表明，Skp和FkpA伴侶的共表達會增加大腸桿菌中抗體片段的溶解度［38］。相關信息表明GroEL-GroES的共表達會導致65％的抗B型利鈉肽單鏈抗體（scFV）能以可溶形式存在，這一組合的可溶產量會比無伴侶時高2.4倍［39］。

表2　在大腸桿菌中用來改善蛋白溶解度的分子伴侶種類

另一種策略為通過降低生長溫度來提高重組蛋白的溶解度［40］。在較低溫度下生長會降低蛋白合成速度，也會阻止胞漿中折疊中間體的聚集。此外，它也能通過阻止分子內和分子間的疏水性改為相互作用去減少包涵體的形成，從而減少蛋白的聚集［41］。此方法已有效地提高了干擾素α-2、人生長激素及Fab片段等藥用蛋白的溶解度［42，43］。為便于大腸桿菌中可溶重組蛋白的生產，也可優化表達載體、啟動子及表達宿主的選擇，融合標簽的應用、蛋白合成速度、培養基組成、誘導濃度和時間等參數［44-46］。研究表明，異源蛋白分泌到大腸桿菌的周質中可能會提供一個生產復雜藥用蛋白的機會。因為周質中的Dsb蛋白家族會幫助形成二硫鍵和氧化周質環境，從而促進異源蛋白的正確折疊。除此之外，周質中含有的極少宿主蛋白和低蛋白水解活性物質有利于下游加工，最終能獲得高收益的藥用蛋白。通過周質分泌，各種藥用蛋白已經被研制成功，如商業化Fab片段、Leucentis和Cimza，以及一些全長無糖基化的抗體和scFvs［47］。OmpA、LamB、PhoA、STII、PelB 和木聚糖酶等分泌信號已被用于靶向大腸桿菌周質中的異源蛋白。Yim等［48］利用木聚糖酶信號肽去獲得了高水平表達的粒細胞集落刺激因子（G-CSF），其在大腸桿菌周質中的產量能達4.2 g/L。另一個研究報道使用LamB信號肽后胰島素樣生長因子I（IGF）在周質中能高水平表達，其產量能達4.3 g/L［49］。除了信號肽，周質分泌的效率也依賴于大腸桿菌菌株、啟動子強度和生長溫度。在一些情況下，一些周質伴侶如二硫鍵氧化酶（DsbA）、異構酶（DsbC）和肽基異構酶的共表達能提高大腸桿菌中異源蛋白的產量。Reilly等［50］報道DsbA和DsbC的過表達能改善周質中全長抗體重輕鏈的組裝效率，也能增加產量從0.1-1.05 g/L。另一個研究報道：當anti-CD20 scFv和周質伴侶Skp共表達時，anti-CD20 scF的產量隨著改進的抗原結合親和力而增加［51］。Lee等［52］報道了大腸桿菌中一種全長IgG有效表達系統的發展，研究表明5' UTR序列的修飾和DsbC折疊酶的共表達會導致重輕鏈具有極高的表達水平，并且IgG組件在周質中也被顯著改善。在高度優化的條件下，最終制備出全組裝和功能上活躍的IgG，其產量高達362 mg/mL。這些研究清楚地表明，未來通過合適的工程加工，大腸桿菌宿主最終能高效及省時生產藥用克隆抗體。

4　翻譯后修飾

生物技術專家多會在藥用蛋白大規模生產中選擇大腸桿菌。然而，若大腸桿菌中沒有翻譯后修飾（PTMs）過程，就會限制其生產重組生物藥物。糖基化、磷酸化等翻譯后修飾對于蛋白的功能活性非常關鍵，但由于缺乏PTM細胞機器，在大腸桿菌中這些修飾過程不能發生［53，54］。蛋白質的N-連接糖基化是真核生物中最重要的翻譯后修飾方式之一。Wacker等［55］在微生物空腸彎曲菌中發現了一種新的N-連接糖基化途徑，也將功能活躍的N-連接糖基化途徑成功地轉入大腸桿菌中。空腸彎曲菌含有pgl基因簇，這一基因簇在各種糖蛋白的合成中會涉及到。通過向大腸桿菌中成功轉入pgl途徑，大腸桿菌生產了各種糖基化蛋白。雖然細菌的N-聚糖結構與真核生物中不一樣，但把空腸彎曲菌的糖基化途徑轉入大腸桿菌的分子工程已經為在大腸桿菌中表達糖化蛋白鋪平了道路［56，57］。Valderrama-Rincon等［56］已經成功在大腸桿菌中設計了真核的糖基化途徑，包括酵母尿苷、二磷酸-N-乙酰葡糖胺轉移酶Alg13和 Alg14、甘露糖Alg1 和 Alg2，以及從空腸彎曲菌中得到的寡糖PglB在內的4種真核糖基轉移酶，在大腸桿菌中共表達用來合成能成功轉移到靶向真核蛋白中天冬酰胺殘基上的聚糖。這一方法也可用來開發針對多種細菌病原體的糖綴合物疫苗，與目前基于化學物質的疫苗生產方法相比，這種替代方法更高效和方便。目前，使用這一技術開發的痢疾桿菌O1復合糖疫苗已經成功通過I期臨床試驗。初步的療效和安全性研究已經證明糖綴合物疫苗雖然安全，但能引起強烈的免疫反應。最終利用空腸彎曲桿菌N-連接糖基化體系生產出同時能針對革蘭氏陰性和陽性病原體的糖綴合物疫苗［28，58-61］。

5　展望

目前雖然生產重組蛋白的酵母、哺乳動物細胞系和轉基因動植物中存在不同的表達系統，但是改善大腸桿菌表達系統的相關技術仍在不斷出現。大腸桿菌系統中遺傳操作方便、基因組充分表征、宿主菌株種類多、成本較低、表達水平高等優點促使優化大腸桿菌中異源蛋白的生產。但偏置密碼子偏好性、蛋白質溶解度、mRNA穩定性和二級結構等限制因素會妨礙大腸桿菌系統過表達異源基因。因為異源蛋白中稀有密碼子存在而出現的翻譯錯誤會導致氨基酸取代或移碼突變，最終出現不期待的產品，所以重組蛋白密碼子偏好性在確定其表達水平上起著關鍵作用。在基因組中替換稀有密碼子為常見密碼子能加強大腸桿菌中治療蛋白的表達。同樣，稀有密碼子的tRNA編碼基因的共表達能夠增加大腸桿菌中治療蛋白的表達水平。此外，異源蛋白的周質分泌會帶來折疊和溶解度適當、純化方便、蛋白高產量等優點。在大腸桿菌周質中已生產被批準的治療用抗體片段，表明此方法在商業上可行。最近一系列研究已表明大腸桿菌菌株能針對每種藥用蛋白進行特異性改造，從而獲得高產量和高質量的產品，最終會為人類的健康作出卓越的貢獻。

［1］Rodriguez V， Asenjo JA， Andrews BA. Design and implementation of a high yield production system for recombinant expression of peptides［J］. Microbial Cell Fact， 2014， 13（18）：1-10.

［2］Sahdev S， Khattar SK， Saini KS. Production of active eukaryotic proteins through bacterial expression systems：A review of the existing biotechnology strategies［J］. Mol Cell Biochem， 2008， 307 （1-2）：249-264.

［3］McNulty DE， Claffee BA， Huddleston MJ， et al. Mistranslational errors associated with the rare arginine codon CGG in Escherichia coli［J］. Protein Expr Purif， 2003， 27（2）：365-374.

［4］Kane JF. Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli［J］. Curr Opin Biotechnol， 1995， 6（5）：494-500.

［5］Sorensen HP， Laursen BS， Mortensen KK. Bacterial translation initiation-mechanism and regulation［J］. Dev Biophys Biochem，2002， 2：243-270.

［6］Kane JF， Violand BN， Curran DF， et al. Novel in-frame two codon translational hop during synthesis of bovine placental lactogen in a recombinant strain of Escherichia coli［J］. Nucleic Acids Res，1992， 20（24）：6707-6712.

［7］Calderone TL， Stevens RD， Oas TG. High-level misincorporation of lysine for arginine at AGA codons in a fusion protein expressed in Escherichia coli［J］. J Mol Biol， 1996， 262（4）：407-412.

［8］Yarian C， Marszalek M， Sochacka E， et al. Modified nucleoside dependent Watson-Crick and wobble codon binding by tRNALysUUUspecies［J］. Biochemistry， 2000， 39（44）：13390-13395.

［9］Kane JF. Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli［J］. Curr Opin Biotechnol， 1995， 6（5）：494-500.

［10］Redwan EM. Optimal gene sequence for optimal protein expression in Escherichia coli：principle requirements［J］. Arab JBiotechnol， 2006， 11（1）：493-510.

［11］ Dieci G， et al. tRNA assisted overproduction of eukaryotic ribosomal proteins［J］. Protein Expr Purif， 2000， 3：346-354.

［12］El-Baky NA， Redwan EM. Therapeutic alpha-interferons protein：structure， production， and biosimilar PREP［J］. Biochem Biotechnol， 2015， 45（2）：109-127.

［13］Jeong W， Shin HC. Supply of the argU gene product allows highlevel expression of recombinant human interferon-alpha-2a in Escherichia coli［J］. Biotechnol Lett， 1998， 20（1）：19-22.

［14］Valente CA， Prazeres DMF， Cabral JMS， et al. Translation feature of human alpha 2b interferon production in Escherichia coli［J］. Appl Environ Microbiol， 2004， 70（8）：5033-5036.

［15］Ferrer-Miralles N， Villaverde A. Bacterial cell factories for recombinant protein production；expanding the catalogue［J］. Microb Cell Fact， 2013， 12（1）：113.

［16］Tegel H， Tourle S， Ottosson J， et al. Increased levels of recombinant human proteins with the Escherichia coli strain Rosetta（DE3）［J］. Protein Expr Purif， 2010， 69（2）：159-167.

［17］Ringquist S， Shinedling S， Barrick D， et al. Translation initiation in Escherichia coli：sequences within the ribosome-binding site［J］. Mol Microbiol， 1992， 6（9）：1219-1229.

［18］Laursen BS， Sorensen HP， Mortensen KK， et al. Initiation of protein synthesis in bacteria［J］. Mol Biol Rev， 2005， 1：101-123.

［19］Stenstrom C， Jin H， Major L， et al. Codon bias at the 3'-side of the initiation codon is correlated with translation initiation efficiency in Escherichia coli［J］. Gene， 2001， 263（1-2）：273-284.

［20］Sprengart ML， Porter AG. Functional importance of RNA interactions in selection of translation initiation codons［J］. Mol Microbiol， 1997， 24（1）：19-28.

［21］Etchegaray JP， Inouye M. Translational enhancement by an element example of molecular misreading in Alzheimer disease［J］. Trends Neurosci， 1999， 21：331-335.

［22］Seo SW， Yang JS， Cho HS， et al. Predictive combinatorial design of mRNA translation initiation regions for systematic optimization of gene expression levels［J］. Sci Rep， 2014， 4（3）：2231-2236.

［23］Iost I， Dreyfus M. mRNA can be stabilized by DEAD-box proteins［J］. Nature， 1994， 372（6502）：193-196.

［24］Iost I， Bizebard T， Dreyus M. Functions of DEAD-box proteins in bacteria：current knowledge and pending questions［J］. Biochim Biophys Acta， 2013， 1829（8）：866-877.

［25］Chen R. Bacterial expression systems for recombinant protein production：E. coli and beyond［J］. Biotechnol Adv， 2012， 30（5）：1102-1107.

［26］Sanchez JC， Padron G， Santana H， et al. Elimination of an HuIFN alpha 2b readthrough species， produced in Escherichia coli， by replacing its natural translation stop signal［J］. J Biotechnol，1998， 63（3）：179-186.

［27］ Poole ES， Brown CM， et al. The identity of the base following the stop codon determines the efficiency of in vivo translational termination in Escherichia coli［J］. EMBO J， 1995， 1：151-158.

［28］Fisher AC， Haitjema CH， Guarino C， et al. Production of secretory andextracellular N-Linked glycoproteins in Escherichia coli［J］. Appl Environ Microbiol， 2011， 77（3）：871-881.

［29］Overton TW. Recombinant protein production in bacterial hosts［J］. Drug Discovery Today， 2014， 19（5）：590-601.

［30］Carrio MM， Villaverde A. Role of molecular chaperones in inclusion body formation［J］. FEBS Lett， 2003， 537（1-3）：215-221.

［31］Cui SS， Lin XZ， Shen JH. Effect of co-expression of molecular chaperones on heterologous soluble expression of the cold-active lipase Lip-948［J］. Protein Expres Purif， 2011， 2：166-172.

［32］ Ronez F， Arbault P， et al. Co-expression of the small heat shock protein， Lo18， with b-glucosidase in Escherichia coli improves solubilization and reveals various associations with overproduced heterologous protein， GroEL/ES［J］. Biotechnol Lett， 2012， 5：935-939.

［33］Jhamb K， Sahoo DK. Production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli：Effects of process conditions and chaperone co-expression on cell growth and production of xylanase［J］. Bioresource Technol， 2012， 123（4）：135-143.

［34］Yan X， Hu S， Guan YX， et al. Co-expression of chaperonin GroEL/ GroES markedly enhanced soluble and functional expression of recombinant human interferon-gamma in Escherichia coli［J］. Appl Microbiolb Biotechnol， 2012， 93（3）：1065-1074.

［35］Voulgaridou GP， Mantso T， Chlichlia K， et al. Efficient E. coli expression strategies for production of soluble human crystalline ALDH3A1［J］. PLoS One， 2013， 8（2）：65.

［36］ Folwarczna J， Moravec T， et al. Efficient expression of human papillomavirus 16 E7 oncoprotein fused to C-terminus of tobacco mosaic virus（TMV）coat protein using molecular chaperones in Escherichia coli［J］. Protein Expres Purif， 2012， 1：152-157.

［37］Nausch H， et al. Recombinant production of human interleukin 6 in Escherichia coli［J］. PLoS One， 2013， 1：570-579.

［38］Ow DS W， Lim DYX， Nissom PM， et al. Co-expression of Skp and FkpA chaperones improves cell viability and alters the global expression of stress response genes during scFvD1. 3 production［J］. Microb Cell Fact， 2010， 9（8）：1-14.

［39］ Maeng BH， Nam DH， Kim YH. Coexpression of molecular chaperones to enhance functional expression of anti-BNPscFv in the cytoplasm of Escherichia coli for the detection of B-type natriuretic peptide［J］. Word J Microbiol Biotechnol， 2011， 6：1391-1398.

［40］Khattar SK， Kundu PK， Gulati P， et al. Optimization and enhanced soluble production of biologically active recombinant human p38 mitogen-activated-protein kinase（MAPK）in Escherichia coli［J］. Protein Peptide Lett， 2007， 14（8）：756-760.

［41］Fahnert B， Lilie H， Neubauer P. Inclusion bodies：formation and utilization［J］. Adv Biochem Eng Biotechnol， 2004， 89：93-142.

［42］Jensen EB， Carlsen S. Production of recombinant human growth hormone in Escherichia coli：Expression of different precursors and physiological effects of glucose， acetate and salts［J］. Biotechnol Bioeng， 1990， 36（1）：1-11.

［43］Vasina JA， Baneyx F. Expression of aggregation prone recombinant proteins at low temperatures：a comparative study of the Escherichia coli cspA and tac promoters systems［J］. Protein Expr Purif， 1997， 9（2）：211-218.

［44］Lebendiker M， Danieli T. Production of prone-to-aggregate proteins［J］. FEBS Lett， 2014， 588（2）：236-46.

［45］Papaneophytou CP， Kontopidis G. Statistical approaches to maximize recombinant protein expression in Escherichia coli：a general review［J］. Protein Expr Purif， 2014， 94（2）：22-32.

［46］Feng Y， Xu Q， Yang T， et al. A novel self-cleavage system for production of soluble recombinant protein in Escherichia coli［J］. Protein Expr Purif， 2014， 99（4）：64-69.

［47］Jung ST， Kang TH， Kelton W， et al. Bypassing glycosylation：engineering aglycosylated full-length IgG antibodies for human therapy［J］. Curr Opin Biotechnol， 2011， 22（6）：858-867.

［48］ Yim S， et al. High-level secretory production of human granulocytescolony stimulating factor by fed-batch culture of recombinant Escherichia coli［J］. Bioprocess Biosyst Eng， 2001， 4：249-254.

［49］Joly JC， et al. Overexpression of Escherichia coli oxidoreductases increases recombinant insulin-like growth factor-I accumulation［J］. Proc Natl Acad Sci USA， 1998， 6：2773-2777.

［50］Reilly DE， Yansura DG. Production of monoclonal antibodies in E. coli［M］//Shire SJ， Gombotz W， Bechtold-Peters K， et al. Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing. New York：Springer， 2010：295-308.

［51］Mavrangelos C， Thiel M， Adamson PJ， et al. Increased yield and activity of soluble single-chain antibody fragments by combing high-level expression and the Skp periplasmic chaperonin［J］. Protein Expr Purif， 2001， 23（2）：289-295.

［52］Lee YJ， Lee DH， Jeong KJ. Enhanced production of human fulllength immunoglobulin G1 in the periplasm of Escherichia coli［J］. Appl Microbiol Biotechnol， 2014， 98（3）：1237-1246.

［53］Jenkins N. Modification of therapeutic proteins：challenges and prospects［J］. Cytotechnol， 2007， 53（1-3）：121-125.

［54］Walsh G， Jefferis R. Post-translational modifications in the contex of therapeutic proteins［J］. Nat Biotechnol， 2006， 24（10）：1241-1252.

［55］Wacker M， Linton D， Hitchen PG， et al. N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli［J］. Science， 2002， 298（5599）：1790-1793.

［56］Valderrama-Rincon JD， Fisher AC， Merritt JH， et al. An engineered eukaryotic protein glycosylation pathway in Escherichia coli［J］. Nat Chem Biol， 2012， 8（5）：434-436.

［57］Ollis AA， Zhang S. Engineered oligosaccharyltransferases with greatly relaxed acceptor-site specificity［J］. Nat Chem Biol，2014， 10（10）：816-822.

［58］Merritt JH， Ollis AA， Fisher AC， et al. Glycans-by-design：engineering bacteria for the biosynthesis of complex glycans and glycoconjugates［J］. Biotechnol Bioeng， 2013， 6：1550-1564.

［59］Guccui J， Wren B. Hijacking bacterial glycosylation for the production of glycoconjugates， from vaccines to humanized glycoproteins［J］. J Pharm Pharmacol， 2015， 67（3）：338-350.

［60］Ihssen J， Kowarik M， et al. Production of glycoprotein vaccines in Escherichia coli［J］. Microb Cell Fact， 2010， 9（1）：98-102.

［61］Wetter M， Kowarik M， Steffen M， et al. Engineering， conjugation，and immunogenicity assessment of Escherichia coli O121 O antigen for its potential use as a typhoid vaccine component［J］. Glycoconj J， 2013， 30（5）：511-522.

（責任編輯 狄艷紅）

The Current Status and Future Perspectives of Production of Biopharmaceuticals in Escherichia coli

CAI Dong-mei GONG Guo-li
（School of Food and Biological Engineering，Shaanxi University of Science and Technology，Xi'an 710021）

Escherichia coli is the most preferred microorganism to express heterologous protein for therapeutic use，as around 30％ of the approved therapeutic proteins are currently being produced using it as a host. Due to its rapid growth，high yield，cost-effectiveness，and easy scale-up process，E. coli is chosen as an expression host in biotech industry for large-scale production of proteins. However，codon preference in E. coli and absences of post-translational modifications，such as glycosylation，phosphorylation and proteolytic processing limit its use for the production of slightly complex recombinant biopharmaceuticals. On purpose of helping E. coli to produce more complex and also glycosylated proteins for therapeutic use，this review summarizes the several novel technological advancements meeting the requirements of biotech industry，mainly focusing on the process of E. coli glycosylating heterologous proteins and expressing complex proteins including fulllength glycosylated antibodies via those advancements. Further potential problems and prospects of futures researches are also discussed.

Escherichia coli；biopharmaceuticals；codon preference；molecular chaperones

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.007

2015-12-05

蔡東梅，女，碩士研究生，研究方向：中藥生物技術；E-mail：caidongmei328@163.com

龔國利，男，博士，教授，研究方向：應用微生物技術；E-mail：gongguoli@sust.edu.cn