大豆GmAP1基因的功能初探

宋拉拉張曉玫陳福祿傅永福趙德剛

（1. 貴州大學農(nóng)業(yè)生物工程研究院 生命科學學院山地植物資源保護與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點實驗室，貴陽 550025；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所 國家農(nóng)作物基因資源與遺傳改良重大科學工程 農(nóng)業(yè)部北京大豆生物學重點實驗室，北京 100081）

大豆GmAP1基因的功能初探

宋拉拉1張曉玫2陳福祿2傅永福2趙德剛1

（1. 貴州大學農(nóng)業(yè)生物工程研究院 生命科學學院山地植物資源保護與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點實驗室，貴陽 550025；
2. 中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所 國家農(nóng)作物基因資源與遺傳改良重大科學工程 農(nóng)業(yè)部北京大豆生物學重點實驗室，北京 100081）

以大豆天隆1號為材料，根據(jù)Glycine max Wm82.a2.v1中大豆基因組的預測序列，克隆出一個APl同源基因，命名為GmAPl。該基因編碼區(qū)CDS長度為711 bp，編碼一個含236個氨基酸的蛋白質(zhì)。對蛋白質(zhì)序列的結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示GmAP1蛋白符合MADS-box基因家族特征。為了初步分析GmAPl的功能，利用實時定量RT-PCR分析GmAPl在不同花器官中表達，并且在擬南芥中過表達該基因。在不同花器官中，GmAPl表達量不同，在花萼中表達量較高；花瓣次之。GmAPl過表達植株表現(xiàn)出早花、植株矮小以及花器官（花瓣、雄蕊和雌蕊）數(shù)量增多等表型。結(jié)果表明，大豆的GmAPl是一個功能保守的APl基因，在花的發(fā)生和花器官發(fā)育中起著重要作用。

開花；花萼；GmAPl；MADS基因；大豆

植物開花是植物生長發(fā)育的一個重要過程［1］。植物響應并整合環(huán)境和內(nèi)源信號，產(chǎn)生相應的反應信號，然后以網(wǎng)絡應答的方式將新信號傳遞給開花整合因子，再由其促進開花基因LEAFY（LFY）和APETALAl（APl）表達，最終促使植物開花［2，3］。APl對控制植物花分生組織特性與花器官形成具有重要的作用［4，5］，屬于MADS-box基因家族［6，7］。在大豆［8］、蘋果［9］、百合［10］、櫻桃［11］、建蘭［12］和楊樹［13］等多種植物中已分別克隆出APl同源基因。異位表達各種植物的APl基因，均促進擬南芥或煙草開花，且此性狀可遺傳到子代［14］。

大豆（Glycine max）起源于中國，是植物性蛋白的主要來源和重要的工業(yè)原料［15］。大豆開花影響籽粒產(chǎn)量，對高產(chǎn)育種具有重要作用［16］。傳統(tǒng)方法通過人工調(diào)控（控制光照、改變溫度、使用激素等）花期，而轉(zhuǎn)基因技術(shù)較多集中于大豆抗病蟲害、抗逆性及大豆油分等方面研究［17］，應用轉(zhuǎn)基因控制大豆開花從而提高產(chǎn)量方面研究較少。采用分子遺傳學和分子生物學改良品種，將促進開花的APl基因?qū)攵倘照罩参镏校淖冎参镩_花對短日照的依賴，促進開花，提高產(chǎn)量，可加快育種進程。大豆基因組具有多拷貝特征，APl同源基因有4個拷貝［18］，本研究以其中一個APETALl（GmAPl）同源基因為目標，利用植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)入到擬南芥中，對其功能進行初步分析，探討其功能與大豆花發(fā)育的關(guān)系，為進一步研究大豆花發(fā)育的分子機理提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

實驗中植物材料為大豆品種天隆1號，種植于中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所人工氣候室（16 h光照，8 h黑暗，25℃），開花期取花蕾，提取RNA，用于基因克隆，分別取花蕾的花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊，提取RNA，用于表達分析。擬南芥（Arabidopsis thaliana）為Columbia（Col-0）生態(tài)型背景。擬南芥突變體apl.3由中國科學院植物研究所孟征研究員惠贈。大腸桿菌DH5α，農(nóng)桿菌GV3101，載體Fu76-35S、Fu28和Fu39-2［19］均由本實驗室保存?zhèn)溆谩嶒炈玫母弑Ｕ鍰NA聚合酶，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，瓊脂糖凝膠回收試劑盒分別購自TaKaRa公司、博邁德生物公司和天根生物技術(shù)公司。實驗用引物由華大科技公司合成，序列測定由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成。

1.2方法

1.2.1APl克隆及表達載體構(gòu)建 根據(jù)Phytozome數(shù)據(jù)庫中Glycine max Wm82.a2.v1預測基因序列，設計引物（表1）擴增GmAPl基因的編碼序列，根據(jù)北京全式金生物技術(shù)有限公司RNA提取試劑盒提取天隆1號RNA，反轉(zhuǎn)錄反應總體積10 μL：5× PrimeScript Buffer 2 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL，Oligo dT Primer 0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL，總RNA 1 μL（500 ng/μL）用RNase Free H2O補足至10 μL。通過37℃ 15 min，85℃ 5 s，完成反轉(zhuǎn)錄反應。PCR體系：2×PrimeSTAR GC Buffer 25 μL，dNTP Mixture 4 μL，正反向引物各1 μL（10 μmol/L），模板5 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μL，用滅菌水補足至50 μL。PCR反應程序為：94℃ 3 min；98℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min/kb，循環(huán)35次；72℃ 7 min。用1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。回收PCR產(chǎn)物，與Fu28載體連接；連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆，通過菌落PCR鑒定陽性克隆。陽性克隆委托北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序，序列測序正確的質(zhì)粒通過LR反應到表達載體Fu39-2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆，通過菌落PCR鑒定陽性克隆。陽性克隆委托北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序，最后轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，農(nóng)桿菌花浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥。

表1　本研究所用引物序列

1.2.2實時定量RT-PCR 在轉(zhuǎn)錄本序列設計實時定量PCR特異引物（表1），擴增長度113 bp。PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取單克隆，通過菌落PCR鑒定陽性克隆，委托北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序，序列與擴增序列完全匹配。實時定量PCR的反應體系：SYBP Premix Ex Taq 7.5 μL，ROX reference Dye 0.3 μL，正反引物各1.5 μL（2 μmol/L），cDNA 1.5 μL（RNA 325 ng），用超純水補足15 μL。生物重復3次。實時定量PCR反應程序：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。以ACTll為內(nèi)參基因，超純水作模板為陰性對照，采用2-△△Ct法計算相對表達量。

2　結(jié)果

2.1GmAPl編碼蛋白聚類分析及其序列特征

分析表明GmAPl（基因序列號：Glyma08g36380）編碼236個氨基酸（圖1），其中包含MADS-box結(jié)構(gòu)域和K-box結(jié)構(gòu)域（圖2），屬于MADS-box基因家族成員。經(jīng)Blast進行同源序列比對，GmAPl氨基酸序列與豇豆（Vigna unguiculata）、百脈根（Lotus japonicus）、雞豆（Cicer arietinum）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、豌豆（Pisum sativum）、紅豆（Vigna angularis）和大棗（Ziziphus jujuba）等物種中的APl或APl-like的同源性達到80％以上（圖3）。其中MADS-box結(jié)構(gòu)域和K-box結(jié)構(gòu)域高度保守，C-末端以CF結(jié)尾，而不是以法尼基轉(zhuǎn)移酶的識別位點CFAA結(jié)尾。

圖1　GmAP1編碼區(qū)的核酸序列及編碼的氨基酸序列

圖2　GmAP1與其他AP1同源基因氨基酸序列比對

2.2大豆GmAPl cDNA全長的獲得

以擬南芥APETALAl（APl）基因為參照，根據(jù)Phytozome數(shù)據(jù)庫中大豆基因組Glycine max Wm82.a2.v1序列預測的GmAPl基因序列設計引物，以大豆cDNA為模板進行PCR擴增，得到750 bp左右的特異條帶（圖4）。測序結(jié)果表明該片段長度為711 bp，與Glycine max Wm82.a2.v1中的預測基因序列相同，且和已報道APl同源基因的同源性較高，表明該片段是大豆的APl同源基因。

圖3　GmAP1與其他AP1同源基因的聚類分析

圖4　GmAP1 CDS全長擴增產(chǎn)物

2.3GmAPl表達分析

利用實時定量RT-PCR（Real time-PCR）的方法檢測GmAPl在大豆不同花器官的表達情況。結(jié)果（圖5）表明，在大豆不同花器官中GmAPl的表達有顯著差異。GmAPl在萼片中表達量較高，在花瓣中表達量次之，在雄蕊和心皮中也有少量表達量。

2.4花浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥

為進一步分析GmAPl的功能，將由35S啟動GmAPl基因的載體轉(zhuǎn)化擬南芥，獲得轉(zhuǎn)基因植株，觀察p35S∷GmAPl轉(zhuǎn)基因植株和野生型表型。結(jié)果（圖6）顯示，在長日條件下（16 h光照，8 h黑暗），p35S∷GmAPl轉(zhuǎn)基因植株比野生型植株早花，p35S∷GmAPl轉(zhuǎn)基因植株在播種后13-15 d就開花，此時蓮座葉數(shù)僅為兩片，且株型小，花數(shù)量少；而野生型在播種后22-24 d才開花，蓮座葉數(shù)為9-11片。p35S∷GmAPl轉(zhuǎn)基因植株與野生型的花型不同，擬南芥野生型花有4個花萼，4個花瓣，6個雄蕊，1個雌蕊，而p35S∷GmAPl轉(zhuǎn)基因植株花有4個花萼，8個花瓣，10雄蕊和2個雌蕊（圖7）。

圖5　GmAP1在大豆不同花器官中的表達

圖6　GmAP1過表達對植株開花的影響

圖7　異位表達GmAP1轉(zhuǎn)基因擬南芥表型分析

3　討論

本研究成功克隆得到大豆APl同源基因GmAPl，其氨基酸序列與許多物種中APl同源基因編碼的氨基酸序列同源性達80％以上，并與豇豆（Vigna unguiculata）、百脈根（Lotus japonicus）、雞豆（Cicer arietinum）、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、豌豆（Pisum sativum）等豆科植物在一個分支上。GmAPl的MADS-box和K結(jié)構(gòu)域相對比較保守，這些結(jié)果表明，大豆GmAPl屬于MADS-box家族基因。但是，GmAP1蛋白C-末端以CF結(jié)尾，而不是以法尼基轉(zhuǎn)移酶的識別位點CFAA結(jié)尾。

APl基因?qū)儆贏類基因［20］，調(diào)控花萼和花瓣的發(fā)育［21-23］。實時定量RT-PCR分析表明，GmAPl在大豆不同花器官中表達量不同，在花萼和花瓣中表達量相對于雄蕊和雌蕊較高。在擬南芥中，APl同源基因作為花分生組織決定基因，在花原基發(fā)育早期階段發(fā)揮作用［6，24］；作為花器官特異基因，決定花器官起始和發(fā)育［4，5］。不同物種的APl同源基因異位表達均早花，但花器官結(jié)構(gòu)的改變卻不相同。在煙草中過表達大豆Jackson品種的APl-like基因（Glyma16g13070.1），表現(xiàn)出早花，植株矮小，正常花瓣處出現(xiàn)了雄蕊狀的花瓣［8］。蘋果中APl-like基因MdMADS5過表達使擬南芥早花，花序較短，花蕾不同，尤其是花萼［9］。在煙草和擬南芥中過表達樺樹PsnAPl-l和PsnAPl-2基因，表現(xiàn)出早花，植株矮小，融合終端花，花畸形［25］。本研究在擬南芥中過表達大豆天隆1號品種的GmAPl基因，植株表現(xiàn)出早花，植株矮小，花數(shù)量少，花器官（花瓣、雄蕊和雌蕊）數(shù)增多。因此，GmAPl基因?qū)Υ蠖归_花時間及花器官的形成可能有重要作用。

大豆APl基因是多拷貝基因［18］，Chi等［8］在煙草中過表達大豆Jackson品種的APl-like基因，表現(xiàn)出早花，植株矮小，正常花瓣處出現(xiàn)了雄蕊狀的花瓣。本研究以另一個APl同源基因為目標，對該基因進行表達分析，以及在擬南芥中過表達該基因進行初步的功能分析，與Chi等早花結(jié)果一致，但花器官結(jié)構(gòu)的改變不同。結(jié)果說明，大豆中不同GmAPl基因拷貝的功能并不完全相同，它們在進化過程中發(fā)生了功能的分化。對這兩個GmAPl基因進行比較研究分析，將進一步解析它們在功能上的協(xié)作與特化機制。

4　結(jié)論

本研究克隆獲得大豆天隆1號GmAPl基因，并證實該基因參與大豆開花時間以及花器官形態(tài)建成的調(diào)控。

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（責任編輯 馬鑫）

Functional Analysis of Soybean GmAP1

SONG La-la1ZHANG Xiao-mei2CHEN Fu-lu2FU Yong-Fu2ZHAO De-gang1
（1. The Key Lab of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region，Ministry of Education，Institute of Agrobioengineering and College of Life Sciences，Guizhou University，Guiyang 550025；2. MOA Key Lab of Soybean Biology（Beijing），National Key Facility of Crop Gene Resource and Genetic Improvement，Institute of Crop Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

The full length GmAPl gene，a homologous gene of APl，was cloned from the soybean cultivar Tianlong 1 based on the putative sequence of soybean genome in Glycine max Wm82.a2.v1 database. GmAPl was 711 bp in length and encoded a protein of 236 amino acids. The structure analysis of protein sequence showed that GmAP1 protein characterized as MADs-box gene family. To analyze the function of GmAPl，the expression patterns of GmAPl in different floral organs were analyzed by RT-PCR，and GmAPl was overexpressed in Arabidopsis. The results showed that GmAPl differently expressed in different floral organs with the highest level in sepals，following by the petals. Transgenic Arabidopsis plants displayed phenotypes of early flowering，dwarf，and increasing number of sepals，petals，and stamens. The result indicated that GmAPl was one of APl homologous genes in soybean with conserved function and played an important role in flowering and floral organ development morphogenesis.

flowering；sepals；GmAPl；MADS gene；soybean

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.013

2015-12-21

國家自然科學基金項目（31371703），轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項（2014ZX08004-005）

宋拉拉，女，碩士研究生，研究方向：植物發(fā)育分子生物學；E-mail：lalasong163@163.com

傅永福，男，研究員，博士生導師，研究方向：植物發(fā)育生物學；E-mail：fuyongfu@caas.cn趙德剛，男，教授，博士生導師，研究方向：植物基因工程；E-mail：dgzhao@gzu.edu.cn