大蒜半胱氨酸合成酶的mRNA表達及生物信息學分析

郭天璐張歡歡杜建中郝曜山王亦學孫毅

（1. 山西大學生物工程學院，太原 030006；2. 山西省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心，太原 030031）

大蒜半胱氨酸合成酶的mRNA表達及生物信息學分析

郭天璐1張歡歡2杜建中2郝曜山2王亦學2孫毅2

（1. 山西大學生物工程學院，太原 030006；2. 山西省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心，太原 030031）

半胱氨酸合成酶的產(chǎn)物半胱氨酸是植物中含硫氨基酸的重要來源，大蒜中含硫氨基酸豐富，研究大蒜半胱氨酸合成酶的性質及生物學功能以明確其在大蒜硫代謝中的作用。利用生物信息學技術分析從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得的3個大蒜的半胱氨酸合成酶基因（AsGCS2、AsGCS3和AsGCS4）的開放閱讀框，預測其蛋白序列、分子量大小、蛋白質特性、亞細胞定位、系統(tǒng)進化等特征；通過熒光定量PCR分析了3個半胱氨酸合成酶的組織表達特性。結果顯示，AsGCS2、AsGCS3和AsGCS4的開放態(tài)讀碼框長度分別為1 152 bp、1 296 bp和1 236 bp；其編碼蛋白的理論相對分子量分別為40.6 kD、34.1 kD和36.1 kD。AsGCS2被亞細胞定位于葉綠體中，而AsGCS3和AsGCS4均被定位于細胞質中。氨基酸比對結果表明，AsGCS2與AsGCS3相似度為70％，與AsGCS4相似度為59％；而AsGCS3與AsGCS4相似度為68％。進化分析圖表明，AsGCS2屬于Bsas2亞家族，AsGCS3屬于Bsas1亞家族，AsGCS4屬于Bsas6亞家族。熒光定量PCR結果表明，大蒜不同CSase的組織特異性是不同的，AsGCS2在葉中表達量最高，ASGCS3在根中表達量最高，而ASGCS4在葉和根中都有較高的表達量。3個半胱氨酸合成酶基因分別屬于不同的Bsas亞家族，它們的組織表達特性也不相同，它們在大蒜不同組織中的半胱氨酸合成途徑中起作用。

大蒜；半胱氨酸合成酶；熒光定量PCR

大蒜（Allium sativum）是百合科蔥屬的多年生草本植物，自古以來一直是食藥兩用的食品，其中蒜素（Allicin）被認為有較強的抗微生物活性［1］。此外，大蒜中還含有20多種含硫化合物，而這些含硫化合物的生成都離不開半胱氨酸。半胱氨酸是蛋白及谷胱甘肽中的重要成分，也是甲硫氨酸與植物含硫化合物的硫供體，是蒜氨酸合成的必要成分。半胱氨酸生物合成是由絲氨酸乙酰轉移酶（Serine acetyltransferase，SATase）和半胱氨酸合成酶（Cysteine synthase，CSase）完成［2］。半胱氨酸合成酶也稱作O-乙酰絲氨酸硫解酶（O-acetylserine（thiol）lyase，OAS），催化O-乙酰絲氨酸和硫化氫合成半胱氨酸。在半胱氨酸合成酶的催化下H2S與O-乙酰絲氨酸反應生成Cys，且半胱氨酸合成酶能與絲氨酸乙酰轉移酶形成復合物［3，4］。半胱氨酸合成酶屬于β-取代丙氨酸合成酶家族（β-substituted alanine synthases family，Bsas）需要磷酸吡哆醛作為輔酶［5］。目前，從許多植物中都克隆到了半胱氨酸合成酶，分別位于細胞質、線粒體、葉綠體這些亞細胞結構中［6］。半胱氨酸合成酶基因的表達受到氮、硫、光照及重金屬等環(huán)境因素調(diào)節(jié)［7-9］。過表達半胱氨酸合成酶的煙草，由于提高了體內(nèi)半胱氨酸及谷胱甘肽的含量，增加了其對重金屬、氧化、除草劑等逆境的耐受性［10-13］。

本研究從NCBI 數(shù)據(jù)庫檢索到3個大蒜的半胱氨酸合成酶基因，通過生物信息學軟件分析這些基因的性質，通過熒光定量PCR分別檢測其在不同組織部位的相對表達量，旨在為大蒜半胱氨酸合成酶的生物功能研究及應用提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

山東金鄉(xiāng)白皮大蒜，購買自當?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場。

1.2方法

1.2.1序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建 在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索到3條大蒜CSase的cDNA序列。利用ExPASy網(wǎng)站的Translate工具將大蒜CSase的cDNA翻譯成氨基酸序列；利用ExPASy服務器ProtParam、ProtScale工具預測CSase蛋白的親疏水性和理化性質；利用TMHMM工具分析了CSase蛋白的跨膜結構域；利用SignalP4.1 預測CSase蛋白的信號肽；利用PSORT 預測ScCBF1的亞細胞定位；并在PSIpred網(wǎng)站上預測CSase的二級結構（表1）。利用ClustalX與其他物種的CSase氨基酸序列進行多序列比對；利用MEGA5.1（Neighbor-Joining）構建系統(tǒng)進化樹。

表1　生物信息學研究的數(shù)據(jù)庫及軟件網(wǎng)址

1.2.2大蒜CSase和Alliinase的mRNA表達特性 用Primer Primer5在獲得的cDNA序列中選擇合適的區(qū)域，設計大蒜CSase的mRNA表達引物及Alliinase的mRNA的表達引物（表2）。

表2　大蒜CSase及Alliinase研究中使用的引物

將大蒜種植于花盆中，取發(fā)芽后7 d大蒜的根、莖、葉的組織。每3株的組織混合為一個重復，每個樣品取3次重復。所有的材料用75％酒精擦拭表面后液氮速凍，于-70℃冰箱保存。采用RNAiso （TaKaRa）提取以上材料的總RNA，經(jīng) BioPhotometer plus核酸蛋白儀（Eppendorf）定量后，取2 μg總RNA作為模板用Reverse TranscriptaseM-MLV（RNase H-）（TaKaRa）反轉錄合成cDNA第一鏈。

以上述的反轉錄的cDNA（5×稀釋）為模板，以EF1a作為內(nèi)參基因（表2），在ABI公司的7300 Real-time PCR儀完成定量PCR擴增。每個樣品設置3次重復。SYBR Green試劑盒采用TransGen公司的TransStart Green qPCR SuperMix UDG，擴增程序為：50℃ 2 min；95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 45 s，40個循環(huán)。結果采用2-ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)。

2　結果

2.1生物信息學分析

通過NCBI數(shù)據(jù)庫獲得3個大蒜CSase基因，分別是AsGCS2（GenBank：AY766093）AsGCS3（Gen-Bank：AY766094）、AsGCS4（GenBank：AY766095），對其進行生物信息學分析，結果見表3。

表3　大蒜CSase生物信息學分析結果

2.1.1AsGCS2生物信息學分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得大蒜的AsGCS2的cDNA序列長度為1 424 bp，其中ORF長度為1 152 bp（36-1 187 bp），其對應的多肽為383個氨基酸。Protparam分析表明，AsGCS2理論的分子質量為40.6 kD，理論的等電點為8.73，不穩(wěn)定系數(shù)為35.74，表明其為相對穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為92.27，總平均疏水性為0.019，表明該蛋白可能是一種疏水蛋白。

利用TMHMM在線分析，結果表明該蛋白未發(fā)現(xiàn)跨膜結構域，因此AsGCS2不是跨膜蛋白。利用SignalP4.1Server在線軟件對大蒜的AsGCS2蛋白信號肽進行預測分析結果表明，該蛋白N端不存在任何信號肽序列，是非分泌蛋白。利用PSORT在線軟件分析得知AsGCS2定位于葉綠體中。在PSIpred網(wǎng)站上預測AsGCS2的二級結構，發(fā)現(xiàn)AsGCS2包含12個α螺旋，10個β折疊。

2.1.2AsGCS3生物信息學分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得大蒜AsGCS3的cDNA序列長度為1 296 bp，其中ORF長度為972 bp（125-1 096 bp），其對應的多肽為323個氨基酸。Protparam分析表明，AsGCS3理論的分子質量為34.1 kD，理論的等電點為5.80，不穩(wěn)定系數(shù)為29.98，表明其為相對穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為103.9，總平均疏水性為0.12，表明該蛋白可能是一種疏水蛋白。

利用TMHMM在線分析，結果表明該蛋白未發(fā)現(xiàn)任何的跨膜結構域，表明AsGCS3也不是跨膜蛋白。利用SignalP4.1Server在線軟件對大蒜的AsGCS3蛋白的信號肽進行預測分析，結果表明該蛋白N端不存在信號肽序列，同樣是非分泌蛋白。利用PSORT在線軟件分析得知AsGCS3定位于細胞質中。在PSIpred網(wǎng)站上預測AsGCS3的二級結構，發(fā)現(xiàn)AsGCS3包含11個α螺旋，10個β折疊。

2.1.3AsGCS4生物信息學分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫獲得大蒜AsGCS4的cDNA序列長度為1 236 bp，其中ORF長度為1 020 bp（60-1 079 bp），其對應的多肽為343個氨基酸。Protparam分析表明，AsGCS4理論的分子質量為36.1 kD，理論的等電點為5.30，不穩(wěn)定系數(shù)為36.4，表明其為相對穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為89.76，總平均疏水性為-0.071，表明該蛋白可能是一種親水蛋白。

利用TMHMM在線分析，結果表明AsGCS4蛋白未發(fā)現(xiàn)任何的跨膜結構域，表明此蛋白不是跨膜蛋白。利用SignalP4.1Server在線軟件對大蒜的AsGCS4蛋白的信號肽進行預測分析結果表明，AsGCS4蛋白N端不存在信號肽序列，同樣也是非分泌蛋白。利用PSORT在線軟件分析得知AsGCS4定位于細胞質中。利用PSIpred網(wǎng)站軟件預測AsGCS4的二級結構，發(fā)現(xiàn)AsGCS4包含10個α螺旋，11個β折疊。

2.2蛋白多序列比對及系統(tǒng)進化樹分析

用GeneDoc將從NCBI數(shù)據(jù)庫中找到的3個半胱氨酸合成酶基因：AsGCS2、AsGCS3、AsGCS4進行比對發(fā)現(xiàn)，AsGCS2與AsGCS3相似性為70％，與AsGCS4相似性為59％，而AsGCS3與AsGCS4相似性為68％，說明它們之間具有很高的保守性。Saito等［14］在1993年已經(jīng)證明賴氨酸是與輔酶磷酸吡哆醛連接的重要位點。如圖1所示，第98-116位氨基酸是半胱氨酸合成酶的PLP連接位點，并具有保守序列KXEXXXPXXSVKDR（方框部分），其中活性位點中心的第二個賴氨酸殘基（Lys109）連接PLP（圖1圓圈標注），酶活性位點的19個氨基酸殘基在植物中高度保守。

圖1　大蒜CSase氨基酸序列比對結果

本實驗通過將已知亞細胞定位的其他物種的半胱氨酸合成酶基因進行序列比對后，用ClustalX、MEGA5.1（Neighbor-Joining）構建系統(tǒng)進化樹。結果（圖2）顯示，按照它們亞細胞定位的不同大體可以分為6個亞家族，我們所研究的AsGCS2屬于Bsas2（葉綠體CSase），AsGCS3屬于Bsas1（細胞質CSase），AsGCS4位于細胞質，但是屬于Bsas6，一個功能未知的亞家族。

2.3CSase（AsGCS2、AsGCS3、AsGCS4）和Alliinase（AsALL）基因的組織特異性表達

通過對大蒜萌發(fā)時期根、假莖、葉組織的mRNA表達水平進行Real-time PCR分析可以看出（圖3），大蒜不同的組織部位CSase的表達程度是不同的，AsGCS2在葉部位表達量達到最高，AsGCS3表達量最高的部位為根，AsGCS4在葉和根中都有較高的表達量。總體而言CSase在根部都有較高的表達量，假莖部表達量較低，與之相反，AsALL在根部表達量較低。

3　討論

半胱氨酸合成酶屬于Bsas家族，基于一級結構及亞細胞定位，Hatzfeld將其分成6個亞家族：Bsas1，細胞質CSase；Bsas2，葉綠體CSase；Bsas3，線粒體CAS；以及未定位的Bsas4，Bsas5 和Bsas6［6］。Bsas1、Bsas2主要的活性都是合成Cys［15］。Bsas3類的β-氰丙氨酸合成酶（β-Cyanoalanine synthase，β-CAS）催化氫氰酸與L-半胱氨酸結合生成β-氰丙氨酸，具有使氰化物脫毒的功能，且都需要磷酸吡哆醛（pyridoxal 5'-phosphate，PLP）作為輔基。其序列及結構與半胱氨酸合成酶相似，定位于線粒體中［16］。有些Bsas3中的β-CAS具有合成半胱氨酸與β-氰丙氨酸的雙重功能［16-18］。Bsas4的Case活性很低，沒有CAS活性［6］。CSase-like 蛋白At5g28030被證明具有半胱氨酸脫硫酶的活性［19］。Bsas5的酶具有S-硫胱氨酸合成酶（S-sulfocysteine synthase）活性，沒有半胱氨酸合成酶活性［20］。Bsas6的酶定位于細胞質中，但其功能尚不清楚。AsGCS4與Bsas6的酶序列相近，但與所有已知的半胱氨酸合成酶的差異較大，也可能屬于一個新的Bsas亞家族Bsas7，由于缺乏相關功能研究結果與AsGCS4相關序列的支持，暫時將AsGCS4歸入Bsas6中。

圖2　Bsas家族的系統(tǒng)進化分析

半胱氨酸是合成蒜氨酸及蒜素的重要前體，為了研究哪個半胱氨酸合成酶與蒜氨酸及蒜素合成有關，比較了3種CSase酶與蒜氨酸酶在大蒜不同組織部位的表達，未發(fā)現(xiàn)與蒜氨酸酶表達完全吻合的基因在葉與根中表達量均較高。蒜氨酸酶在葉和假莖中表達較高，半胱氨酸合成酶的表達模式與其均不相同，可能大蒜中還存在其他未知的半胱氨酸合成酶，擬南芥中有至少8個CSase-like蛋白，玉米與水稻中有5個CSase-like蛋白。

半胱氨酸合成酶催化半胱氨酸合成，其產(chǎn)物半胱氨酸對無機硫的同化起中心作用，為甲硫氨酸、谷胱甘肽及植物中的多種含硫次級代謝物的生物合成提供唯一的硫化物供體［21］。半胱氨酸合成酶的表達受到氮、硫、鹽等非生物脅迫的調(diào)節(jié)，過量表達半胱氨酸合成酶能夠增加植物體內(nèi)谷胱甘肽含量，提高植物對逆境的抵抗力［22］。半胱氨酸在植物免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用，擬南芥OAS-Al的突變體導致對致病菌的免疫力下降［23］。由于半胱氨酸的重要作用，植物中的半胱氨酸合成酶是冗余的，OAS-TL A，OAS-TL B貢獻了半胱氨酸合成酶活性的絕大部分，半胱氨酸合成酶對花粉發(fā)育具有重要作用，OAS-TL A，OAS-TL B，OAS-TL C全部缺失的花粉發(fā)育受到影響［24］。這些研究表明半胱氨酸合成酶在植物抗逆，抗損傷以及免疫調(diào)節(jié)方面具有重要作用。大蒜中半胱氨酸、谷胱甘肽等含硫化合物的組分遠高于其他植物，因此，研究其半胱氨酸合成酶的表達及生物學功能具有重要意義。

圖3　CSase（AsGCS2、AsGCS3、AsGCS4）和Alliinase基因的不同組織特異性表達

4　結論

AsGCS2屬于Bsas2葉綠體CSase亞家族，亞細胞定位于葉綠體，在葉中表達量最高；AsGCS3屬于Bsas1線粒體CAS亞家族，亞細胞定位于細胞質，在根中表達量最高；AsGCS4屬于Bsas6亞家族，亞細胞定位于細胞質，在葉和根中都有較高的表達量。除此之外，它們在大蒜不同組織中的半胱氨酸合成途徑中起作用。

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（責任編輯 馬鑫）

mRNA Expression and Bioinformatics Analysis of Cysteine Synthase in Allium sativum

GUO Tian-lu1ZHANG Huan-huan2DU Jian-zhong2HAO Yao-shan2WANG Yi-xue2SUN Yi2
（1. College of Bio-engineering，Shanxi University，Taiyuan 030006；2. Research Center of Biotechnology，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Taiyuan 030031）

The cysteine synthesized by cysteine synthase is an important source of amino acids containing sulfur in plants. The amino acid with sulfur in garlic is abundant，thus we studied the properties and biological functions of garlic cysteine synthase in order to clarify its role in the metabolism of garlic. Three cysteine synthase genes of garlic，AsGCS2，AsGCS3 and AsGCS4 were found from NCBI database，and then bioinformatics analysis and RT-PCR were conducted. The lengths of their open reading frames were 1 152 bp，1 296 bp，and 1 236 bp，respectively. The theoretical relative molecular weights of their encoded enzymes were 40.6 kD，34.1 kD，and 36.1 kD，respectively. By subcellular localization，AsGCS2 was localized in the chloroplasts，while AsGCS3 and AsGCS4 were localized in the cytoplasm. The results of the amino acid sequence alignment revealed that the similarity of AsGCS2 with AsGCS3 was 70％，and that with AsGCS4 was 59％，while it was 68％ between AsGCS3 and AsGCS4. Phylogenetic analysis showed that AsGCS2 belonged to Bsas2，AsGCS3 belonged to Bsas1，but AsGCS4 was different from all known cysteine synthases，possibly belonging to Bsas6. RT-PCR expression analysis indicated that the expression levels of CSase varied in various tissues. The expression level of AsGCS2 was the highest in the leaves，the highest expression of AsGCS3 was in the root，and AsGCS4 expressed highly in both leaves and roots. In conclusion，3 cysteine synthase gene AsGCS2，AsGCS3，and AsGCS4 belong to the different subfamilies of Bsas，their tissue expression characteristics were not the same，and they play a role in different tissues of garlic in cysteine biosynthesis.

Allium sativum；cysteine synthase；qRT-PCR

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.015

2015-10-21

轉基因生物新品種培育重大專項（2014ZX08003001-002-003）

郭天璐，女，碩士研究生，研究方向：植物轉基因技術；E-mail：421489192@qq.com

孫毅，男，博士，研究方向：植物轉基因技術；E-mail：sunyi692003@163.com張歡歡，男，碩士，研究方向：轉基因抗蟲技術；E-mail：frank.red@163.com