大鼠NKx6.1啟動(dòng)子克隆及特異性表達(dá)分析

王大瑋 汪蓓蕾 姚遠(yuǎn) 陳皓 張欣 郭剛 張瑞

（天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院內(nèi)分泌研究所 衛(wèi)生部激素與發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300070）

大鼠NKx6.1啟動(dòng)子克隆及特異性表達(dá)分析

王大瑋 汪蓓蕾 姚遠(yuǎn) 陳皓 張欣 郭剛 張瑞

（天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院內(nèi)分泌研究所 衛(wèi)生部激素與發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300070）

旨在構(gòu)建大鼠NKx6.l啟動(dòng)子的報(bào)告載體，驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子T3R對(duì)NKx6.l啟動(dòng)子的調(diào)控活性。用PCR擴(kuò)增大鼠腦組織NKx6.l的 5'上游啟動(dòng)子片段2.4 kb，應(yīng)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)該片段上潛在的轉(zhuǎn)錄因子T3R結(jié)合位點(diǎn)，根據(jù)不同的結(jié)合位點(diǎn)作系列截短，獲得3段長(zhǎng)度不等的啟動(dòng)子缺失片段，分別克隆到熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)質(zhì)粒（pGL3-Basic）上，構(gòu)建相應(yīng)的報(bào)告載體。將報(bào)告載體和T3R共轉(zhuǎn)染大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞（rat astrocytes，RA），并檢測(cè)報(bào)告基因熒光素酶的活性。結(jié)果顯示，成功構(gòu)建大鼠NKx6.l啟動(dòng)子報(bào)告載體，雙熒光素酶報(bào)告基因活性檢測(cè)表明T3R對(duì)NKx6.l啟動(dòng)子有明顯調(diào)控作用，其中-1 887 bp-1 507 bp活性最高，即存在關(guān)鍵順式調(diào)控元件。克隆并篩選出啟動(dòng)子核心區(qū)域，揭示了甲狀腺激素對(duì)大鼠NKx6.l的表達(dá)調(diào)控機(jī)制。

同源盒基因NKx6.l；甲狀腺激素；雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)；啟動(dòng)子活性

碘缺乏病（iodine deficiency disorders，IDD）的最大危害是導(dǎo)致不同程度的腦發(fā)育障礙，其具體的分子作用機(jī)制仍是當(dāng)前的主要研究方向。同源盒基因Nkx6.1作為一種反式作用因子，與神經(jīng)系統(tǒng)的分化與發(fā)育關(guān)系極為密切，對(duì)于甲狀腺特異基因的表達(dá)有重要的作用［1］。Nkx6.1在胚胎期可影響神經(jīng)元分化［2］，并在隨后的腦發(fā)育及成熟階段對(duì)髓鞘形成、神經(jīng)元軸突-膠質(zhì)細(xì)胞連接和維持髓鞘穩(wěn)定等產(chǎn)生影響［3］。研究表明，大鼠仔鼠Nkx6.l基因表達(dá)水平會(huì)因母體低碘膳食而發(fā)生顯著改變［4］。腦發(fā)育時(shí)期甲狀腺激素（thyroid hormone，TH）缺乏會(huì)導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要神經(jīng)細(xì)胞異常，并伴隨NKx6.l的低表達(dá)［5］。以上的研究事實(shí)可以初步表明甲狀腺激素可能通過(guò)影響NKx6.l的表達(dá)來(lái)進(jìn)一步影響腦部神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育與成熟，但甲狀腺激素影響NKx6.l表達(dá)的具體機(jī)制并沒(méi)有得到闡釋。甲狀腺激素的基因組功能是通過(guò)甲狀腺激素受體（TRs）介導(dǎo)完成的，它們結(jié)合形成 TH-TR 復(fù)合物，再輔與激活因子、抑制因子，直接調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄［6］。本實(shí)驗(yàn)以研究T3核受體（T3R）對(duì)NKx6.l啟動(dòng)子活性的影響為切入點(diǎn)，來(lái)揭示甲狀腺素對(duì)NKx6.l的調(diào)控機(jī)制，以期為進(jìn)一步研究同源盒基因NKx6.l在甲狀腺素缺乏導(dǎo)致腦發(fā)育遲滯過(guò)程中的分子作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種、載體和細(xì)胞 大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞、感受態(tài)大腸桿菌DH5α、pRL-SV40、pGL3-Basic質(zhì)粒為天津市內(nèi)分泌研究所保藏，pEASY-T3購(gòu)自北京全式金公司。

1.1.2試劑及耗材 Tissue DNA Kit購(gòu)自O(shè)MEGA，限制性內(nèi)切酶Kpn I和Bgl II購(gòu)自大連寶生物（TaKaRa），T4 DNA連接酶購(gòu)自Thermo，TransTaq DNA Polymerase High Fidelity和TransStart FastPfu DNA Polymerase購(gòu)自北京全式金公司，質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、DNA marker均購(gòu)自天根公司，雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega，Lipofectine 2000購(gòu)自Invitrogen。

1.1.3基因與引物 PCR引物根據(jù)UCSC和GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)應(yīng)用Primer Premier 5設(shè)計(jì)，由北京奧科鼎盛公司合成，目的基因測(cè)序由Invitrogen公司完成。引物序列見(jiàn)表1。

表1　引物序列表

1.2方法

1.2.1NKx6.l啟動(dòng)子截短載體構(gòu)建 提取大鼠腦組織基因組DNA，根據(jù)GenBank提供的大鼠NKx6.l基因（登錄號(hào)：NM031737）第一個(gè)外顯子的起始密碼子的5'上游3 000 bp序列，設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)Kpn I和Bgl II的上下游引物，并擴(kuò)增2 325 bp啟動(dòng)子片段。PCR反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃ 5min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 2.5 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸 10 min。PCR產(chǎn)物電泳，回收目的片段，克隆至pEASY-T3載體進(jìn)行酶切測(cè)序鑒定。測(cè)序正確的目的片段與pGL3-Basic熒光報(bào)告載體連接，命名為pGL3-2.3。利用JASPAR（http：//jaspar.genereg. net/）和alggen（http：//alggen.lsi.upc.es），對(duì)T3R潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，根據(jù)預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)，設(shè)計(jì)帶酶切位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增啟動(dòng)子截短片段，克隆到pGL3-Basic上，分別命名為pGL3-1.8、pGL3-1.5。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞用含有10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液（100 U/mL青霉素，100 U/mL鏈霉素），在37℃、含有5％ CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)貼壁培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前24 h，將大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞接種于24孔板，細(xì)胞匯合度達(dá)到60％-70％時(shí)轉(zhuǎn)染。按照Lipofectine 2000使用說(shuō)明書(shū)，將構(gòu)建的系列截短片段熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒和轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)載體以及pRL-SV40共轉(zhuǎn)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染36 h后收集細(xì)胞并進(jìn)行熒光素酶活性檢測(cè)。每個(gè)啟動(dòng)子做3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，每次3個(gè)重復(fù)。

1.2.3雙熒光素酶活性分析 轉(zhuǎn)染36 h的細(xì)胞，除去細(xì)胞培養(yǎng)基，用1×PBS洗滌1次，24孔板每孔加入100 μL 1×PLB，用槍頭刮下細(xì)胞，轉(zhuǎn)至離心管中，8 000×g離心1 min。樣品20 μL與Luciferase Assay Buffer II混合，立即用熒光發(fā)光計(jì)測(cè)量活性，然后再加入Stop ＆amp; Glo測(cè)量活性，熒光素酶檢測(cè)試劑LAR II和Stop ＆amp; Glo的進(jìn)樣體積均為50 μL，延遲時(shí)間2 s，檢測(cè)時(shí)間10 s；先后讀數(shù)分別為螢火蟲(chóng)熒光素酶活性和海腎螢光素酶活性，計(jì)算相對(duì)熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)均用x-±s表示，并經(jīng)方差分析檢驗(yàn)差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1大鼠NKx6.l啟動(dòng)子序列及生物信息學(xué)分析

本實(shí)驗(yàn)以大鼠腦組織基因組DNA為模板，通過(guò)PCR特異性擴(kuò)增了2 325 bp的NKx6.l基因5'端上游啟動(dòng)子片段。用生物信息學(xué)的方法分析預(yù)測(cè)序列上存在2個(gè)潛在的T3R轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（圖1）。

圖1　NKx6.1啟動(dòng)子克隆及生物信息學(xué)分析

2.2Nkx6.l啟動(dòng)子區(qū)系列截短片段的擴(kuò)增

根據(jù)預(yù)測(cè)的T3R結(jié)合位點(diǎn)，以測(cè)序正確的TA克隆為模板用對(duì)應(yīng)的引物對(duì)NKx6.1的5'端上游啟動(dòng)子序列進(jìn)行截短，獲得2 325 bp、1 887 bp和1 507 bp的片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析驗(yàn)證（圖2-A），PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期片段大小相符。

2.3NKx6.l重組報(bào)告載體的構(gòu)建

以限制性核酸內(nèi)切酶Kpn I和Bgl II對(duì)重組質(zhì)粒酶切可見(jiàn)約4 800 bp的載體片段和2 325 bp、1 887 bp，1 507 bp目的片段，與預(yù)期片段大小吻合，表明載體構(gòu)建正確（圖2-B）。

2.4報(bào)告基因活性和大鼠NKx6.l啟動(dòng)子核心調(diào)控區(qū)篩選

根據(jù)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)得T3R結(jié)合位點(diǎn)，以系列截短得方式進(jìn)行敲除，獲得了pGL3-2.3，pGL3-1.8，pGL3-1.5三個(gè)報(bào)告載體（圖3），與T3R表達(dá)載體及其對(duì)照共轉(zhuǎn)染大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，檢測(cè)報(bào)告載體熒光素酶活性，以篩選T3R對(duì)NKx6.l啟動(dòng)子的核心調(diào)控區(qū)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)T3R表達(dá)載體的對(duì)照pcDNA對(duì)熒光報(bào)告載體幾乎沒(méi)有激活作用，且pcDNA-T3R對(duì)空熒光報(bào)告載體pGL3-basic幾乎沒(méi)有激活作用。pcDNA-T3R對(duì)pGL3-basic-2.3與pGL3-basic-1.8的激活作用相當(dāng)，而對(duì)pGL3-basic-1.5的激活作用顯著下降（P＜0.05）（圖3）。提示1.5 kb-1.8 kb可能存在啟動(dòng)子核心調(diào)控區(qū)。

圖2　NKx6.1啟動(dòng)子的系列截短片段（A）及相應(yīng)的熒光素酶報(bào)告載體雙酶切鑒定（B）

圖3　大鼠NKx6.1啟動(dòng)子系列截短片段的雙熒光素酶活性檢測(cè)

3　討論

甲狀腺激素（thyroid hormone，TH）是哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中最重要的激素之一，大鼠妊娠兩周，腦組織即在TH的調(diào)節(jié)下開(kāi)始快速發(fā)育，一直延續(xù)到出生后一個(gè)月左右［7］。低碘造成的甲狀腺激素缺乏會(huì)對(duì)腦組織的正常發(fā)育產(chǎn)生影響［8］。同源盒基因Nkx6.l作為一種反式作用因子與神經(jīng)系統(tǒng)的分化與發(fā)育關(guān)系極為密切，對(duì)于甲狀腺特異基因的表達(dá)有重要作用［1］。研究表明低碘膳食會(huì)造成特定時(shí)期大鼠腦組織中NKx6.l的表達(dá)水平下降，并且適時(shí)的補(bǔ)充適量的甲狀腺激素可以改善甲狀腺激素水平低下?tīng)顟B(tài)，有利于促進(jìn)Nkx6.l在基因和蛋白水平接近于正常同期水平［9］。然而，甲狀腺激素對(duì)NKx6.1的表達(dá)調(diào)控機(jī)制卻沒(méi)有得到進(jìn)一步揭示。甲狀腺激素參與調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄主要是通過(guò)與甲狀腺激素受體結(jié)合形成復(fù)合物進(jìn)而調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄［10］，甲狀腺激素受體（TRs）是一種 DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，屬于配體依賴型核激素受體超家族［11-13］。甲狀腺激素在體內(nèi)的活性形式是T3［14］，相對(duì)應(yīng)的T3R是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，可能在NKx6.l的表達(dá)調(diào)控中起重要作用。體外研究NKx6.l的表達(dá)調(diào)控模型，選擇大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞（Astrocytes），因其作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的細(xì)胞，承擔(dān)著CNS發(fā)育和功能執(zhí)行等作用［15-19］。Astrocytes能夠控制突觸的數(shù)量，可以直接或者間接的調(diào)控突觸的活性，而且對(duì)突觸具有維持作用，此外大量的證據(jù)顯示阿爾茲海默癥與Astrocytes相關(guān)［20］。

4　結(jié)論

構(gòu)建了大鼠NKx6.l的啟動(dòng)子的報(bào)告載體，應(yīng)用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)了NKx6.l啟動(dòng)子上潛在的T3R結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告載體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這些潛在的結(jié)合位點(diǎn)在一定程度上能夠激活NKx6.l啟動(dòng)子。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning and Specific Expression Analysis of Rat NKx6.1 Promoter

WANG Da-wei WANG Bei-lei YAO Yuan CHEN Hao ZHANG Xin GUO Gang ZHANG Rui
（Key Laboratory of Hormones and Development（Ministry of Health），Institute of Endocrinology，Metabolic Disease Hospital of Tianjin Medical University，Tianjin 300070）

This work aims to construct the reporter vector of rat NKx6.1 promoter and verify the activity of transcription factor T3R in the regulation of NKx6.l promoter. We cloned a 2.4 kb 5' upstream promoter segment of NKx6.l from the brain tissue of rat by PCR and predicted the binding sites of potential transcription factor T3R in the segment via bioinformatics method. Three promoter-deficient segments with different lengths were obtained by promoter deletion analysis and then cloned into the expression plasmids of luciferase reporter gene（pGL3-Basic），and corresponding reporter vectors were constructed. The reporter vectors and T3R were co-transfected into rat astroytes，then the activities of the gene's luciferase were determined. Above results demonstrated that we successfully constructed the reporter vector of NKx6.l promoter，and the results of dual luciferase assay showed that T3R regulated significantly NKx6.l promoter，and the region of -1 887 bp-1 507 bp presented the highest activities，i.e.，contained the key cis-regulatory element. In conclusion，we cloned and screened the core promoter region and revealed the transcriptional regulation mechanism of thyroid hormones on NKx6.l in brain tissue of rat.

homeobox gene Nkx6.l；thyroid hormones；dual-luciferase reporter assay system；promoter activity

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.017

2015-10-30

王大瑋，男，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：grabbydowa@sina.com

張瑞，女，助理研究員，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)；E-mail：1683039118@qq.com