梅花鹿CGI99基因RNAi慢病毒載體的構建及其對鹿茸干細胞增殖的影響

路曉 孫紅梅 褚文輝 張偉 李春義

（中國農業科學院特產研究所 特種經濟動物分子生物學國家重點實驗室，長春 130000）

梅花鹿CGI99基因RNAi慢病毒載體的構建及其對鹿茸干細胞增殖的影響

路曉 孫紅梅 褚文輝 張偉 李春義

（中國農業科學院特產研究所 特種經濟動物分子生物學國家重點實驗室，長春 130000）

利用慢病毒介導的基因沉默體系，對梅花鹿生茸區骨膜干細胞（AP）中CGI99基因進行RNA干擾，并初步研究該基因對細胞增殖的影響。設計出1條針對梅花鹿CGI99基因的shRNA序列與載體質粒 pLVTHM連接，之后與pSPAX2、pMD2.G質粒共轉染HEK 293t細胞，獲得重組慢病毒，感染AP細胞；通過熒光定量PCR檢測CGI99基因的下調水平；通過MTT實驗檢測CGI99基因沉默對AP細胞增殖影響。基因的表達水平大幅度下調，干擾效率達到70.8％；MTT實驗的數據曲線趨于一致。結果表明，成功構建了針對梅花鹿CGI99基因的RNAi載體并干擾了CGI99基因在AP細胞中的表達，且初步確定CGI99基因對AP細胞的增殖并無顯著影響。

鹿茸；RNAi；CGI99基因；鹿茸干細胞

鹿茸作為哺乳動物中唯一能夠完全再生的骨質性附屬器官，生長極其迅速，且成骨過程極易觀察。鹿茸生長頂端具有明顯的真皮層、間充質層、前成軟骨層、過渡層和軟骨層［1］，同時在生長高峰期細胞的生長速度可達到癌細胞的30倍，但其卻不發生癌變［2］。研究表明，鹿茸的再生是基于干細胞的過程，鹿茸干細胞具有補充維持鹿一生中每一個鹿茸再生循環所需的快速增殖細胞的能力。鹿生茸區骨膜細胞（antlerogenic periosteum，AP）為鹿茸發生的干細胞［3］，而且由于其可分化成皮膚、血管、神經、軟骨及骨等多種成分［4］，因此，鹿茸可作為一種研究骨快速生長、成骨過程以及干細胞生物學等的天然優秀模型。

CGI99基因（同名基因C14orf166）全長1 064 bp，核心編碼區738 bp，編碼分子量約26 kD的蛋白分子，該基因主要表達于細胞質，但在細胞核中也有表達［5］。本實驗室構建的SSH（Suppression Subtractive Hybridization）文庫篩選到了CGI99基因，通過原位雜交試驗發現該基因在鹿茸軟骨小梁中高度表達（未發表），而在鹿茸的其他部位則幾乎不表達（如血管），因此，推測其在鹿茸軟骨發育、成骨中具有重要的調節作用，如可能與參與軟骨發生的調控［6］。由于AP細胞可分化為軟骨，本實驗利用慢病毒介導的RNAi途徑，靶向沉默AP細胞中的CGI99基因［7］，并進一步探究CGI99基因沉默對AP細胞增殖的影響，旨在為繼續研究該基因的相關機制做好初步工作。

1　材料與方法

1.1材料

AP細胞、細胞株人胚腎細胞293t、載體質粒pLVTHM、包膜質粒pMD2.G、包裝質粒pSPAX2均由本實驗室保存；限制性內切酶Cla I、Mlu I 購自NEB公司；T4 DNA 連接酶、1 000 bp DNA Marker購自TaKaRa（大連）公司；感受態細胞DH5α購自全式金公司、小量質粒提取試劑盒購自Axygen公司；大量質粒DNA 提取試劑盒購自Promega公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自上海生工公司；DMEM、Trypsin 購自Life Tech公司；標準胎牛血清購自Gibco公司；SYBR GREEN 、X-tremeGENE HP購自Roche公司；ploybrene購自Santa Cruz Biotech公司，其他試劑均為國產或進口分析純。

1.2方法

1.2.1梅花鹿CGI99基因shRNA重組慢病毒載體的構建及鑒定 根據本課題組cDNA文庫中的CGI99基因序列（數據未發表），并根據The RNAi Consortium（TRC）RNAi靶位點篩選法則、Angela篩選法則及通過在線設計等方法比較多條備選序列，最終選擇了1條針對梅花鹿CGI99基因的高分RNAi靶序列。為確保該序列不會對梅花鹿其他基因造成影響，將靶序列在NCBI中進行同源性比對，另外在人類的基因組中進行相似的比對（包裝細胞為人胚腎293t），以確保靶序列不會對包裝細胞的相關基因產生RNAi效應。在RNAi序列兩端加上酶切位點、終止信號、內成環結構等，送公司合成。共設計2對shRNA序列（表1），其中S2為無意義鏈，作為陰性對照。合成的序列經退火后形成雙鏈Oligo DNA，與經Cla I、Mlu I雙酶切后的pLVTHM質粒連接，經DH5α感受態細胞轉化、擴增。挑選重組陽性克隆菌株，提取質粒后，按如下引物進行PCR鑒定［7］：上游5'-ctgggaaatcaccataaacg-3'，下游5'-ttattcccatgcgacggtat-3'。對鑒定為陽性的質粒進行測序鑒定（博仕生物有限公司）。測序正確后大量提取質粒，同時對pSPAX2和pMD2.G兩種質粒進行大量提取備用。

表1　shRNA序列

1.2.2重組慢病毒包裝 對293t 細胞進行實驗前的處理，當293t 細胞生長狀態合適時，使用1.5 mL opti-MEM 稀釋10 μg DNA（pLVTHM重組陽性質粒、pSPAX2與pMD2.G的質量比為4∶4∶2），同時添加20 μL X-tremeGENE HP轉染試劑，室溫下孵育25 min，將該混合溶液加到細胞培養皿中，輕搖培養皿以混勻。在37℃，CO2濃度為5％的培養箱中孵育12 h后，更換為完全培養基。繼續培養12 h后檢測綠色熒光蛋白（GFP）的表達情況，以此確定三質粒的轉染效率。收集細胞培養皿中轉染24 h的培養基，并用0.45 μm濾器過濾以棄去細胞碎片沉淀，然后經100 kD 超濾管濃縮后用1.5 mL EP管分裝，-80℃保存待用。

1.2.3重組慢病毒感染AP細胞 消化并重懸AP細胞，準確計數后，添加2.5×104個細胞于6孔板中央，添加2 mL完全培養基。12 h后進行重組慢病毒感染，棄去6孔板中培養基，替換為2 mL含有200 μL（滴度3.2×106TU/mL）慢病毒液及2 μL polybrene的混合液，12 h后更換為完全培養基，24 h后觀察AP細胞熒光蛋白GFP的表達情況。

1.2.4RT-PCR檢測AP細胞RNAi效率 取感染后的AP細胞，提取總RNA，酶標儀測定RNA濃度及純度后，反轉錄總RNA為cDNA，之后進行熒光定量PCR反應，選擇GAPDH作為內參基因，對結果進行校正，以未做任何處理的AP細胞作對照，反應條件如下：95℃預變性10 min；94℃變性15 s，55.4℃退火30 s，72℃延伸1 min，共40個循環；72℃ 5 min，4℃。

針對CGI99基因及GAPDH內參基因分別設計一對引物，見表2。

表2　CGI99基因及GAPDH內參基因引物序列

1.2.5MTT實驗檢測AP細胞增殖情況 消化感染AP-S1、S2細胞及不做任何處理的AP細胞（未進行慢病毒感染的，作為空白對照）并準確計數，將細胞濃度調整為2.5×104個/mL，取200 μL細胞懸液于96孔板中，使得每孔細胞數在5×103個左右，接種24、48、78、96和120 h后，每孔添加20 μL MTT試劑，繼續培養4 h后，停止培養，小心棄去上清后，加入150 μL DMSO溶解，搖床避光反應10 min后，利用酶標儀在490 nm處測定吸光度。以時間為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制細胞增殖曲線。

2　結果

2.1陽性重組質粒pLVTHM的PCR鑒定

PCR鑒定結果如圖1所示，1號泳道為空白質粒pLVTHM，作為陰性對照，其擴增片段十分接近Marker的100 bp條帶；2、3號泳道為陽性克隆，2種陽性重組質粒分別命名為pLVTHM-S1和pLVTHM-S2，擴增片段接近Marker的200 bp條帶。已知空白質粒pLVTHM 的擴增片段為85 bp，陽性重組質粒的擴增片段為141 bp，結果與實驗預期相符，即表明挑選的陽性克隆的確為實驗所需。測序結果最終確定陽性克隆中正確插入了所需的shRNA，即RNAi 靶位點序列。

圖1　重組質粒PCR鑒定結果

2.2重組慢病毒三質粒共轉染293t細胞效果檢測

在293t細胞中進行X-tremeGENE HP介導的pLVTHM陽性重組質粒、pSPAX2和pMD2.G三質粒共轉染，培養24 h后，在倒置熒光顯微鏡下可觀察到大量呈不規則狀態分布的GFP熒光（圖2-A）。在相同倍數的可見光下觀察，293t細胞形狀呈圓粒狀，細胞生長狀態良好，無死細胞（圖2-B），表明3種質粒共轉染293t細胞按預期進行，并得到慢病毒顆粒。

圖2　三質粒共轉染24 h后的293t細胞

2.3重組慢病毒對梅花鹿AP細胞的感染

用包裝成功的慢病毒感染AP細胞，48 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察。如圖3所示，感染慢病毒的AP細胞中有大量綠色熒光分布于視野，而可見光下的同一視野可看到AP細胞生長狀態良好。

圖3　重組慢病毒感染的AP細胞（48 h）

2.4感染效率的檢測

將未感染的AP細胞作為對照進行熒光定量RT-qPCR檢測，通過熔解曲線可知，GAPDH基因和CGI99基因均被特異性擴增。利用2-ΔΔCt分析方法進行數據分析，由圖4可知，與陰性對照AP相比，AP-S1的CGI99基因的表達水平大幅度下調，干擾效率達到70.8％，而AP-S2的CGI99基因的表達基本不變。因此可確定攜帶pLVTHM-S1的質粒能夠有效沉默CGI99基因的表達，本實驗獲得了可穩定傳代的低表達梅花鹿AP細胞系。

圖4　RT-PCR檢測CGI99基因的沉默水平

2.5CGI99下調對AP細胞分裂繁殖的影響

進行6 d的MTT實驗后，由圖5可知，AP-S1及AP-S2的增殖程度與空白對照AP相比，沒有顯著的變化（數據顯著水平P＞ 0.05），說明CGI99的下調對AP細胞的增殖沒有明顯影響，同時說明慢病毒感染對細胞增殖也沒有顯著影響。

圖5　MTT實驗生長曲線

3　討論

鹿茸作為哺乳動物中唯一可以再生的器官，在軟骨發生及骨生長方面的研究具有重要意義。除此之外，由于鹿茸具有可再生性、干細胞依賴性以及成骨過程明顯等諸多特性，是一種極具潛力的哺乳動物生物醫學模型［8］。在目前能找到的相關報道中，該基因多在腫瘤細胞增殖及轉移、流感病毒的復制以及腦組織發育等機體活動中起調控作用［9-13］。因此，研究CGI99基因的功能及作用機理就顯得極為重要。而目前研究得出的關于CGI99基因的結論多集中在病毒調控及蛋白質復合物相互作用中［14-18］，利用鹿茸這個獨特的模型研究CGI99基因在軟骨發生方面的功能研究目前還尚未見過報道。

RNAi技術作為一種研究基因功能的新工具，由于其實驗簡單、快速、重復性好等特點，越來越廣泛地應用在研究細胞信號傳導通路及基因病、癌癥的治療中［19-21］。本實驗通過RNAi途徑靶向沉默了CGI99基因在AP細胞中的表達，同時將鹿茸作為研究軟骨組織發生機制的模型，為研究該基因提供了一種有效途徑。而MTT實驗結果顯示CGI99基因的沉默對AP細胞的增殖并沒有顯著的影響，由此推斷該基因在細胞增殖方面或許沒有特異性的作用，而極有可能在細胞分化方面有著重要的作用。

本實驗建立了靶向沉默CGI99基因的技術平臺，為進一步在鹿茸或者其他模式動物中研究CGI99基因的功能及作用機理提供借鑒，但其在軟骨發生等方面影響的機理還有待于繼續研究。

4　結論

本實驗成功干擾了CGI99基因在AP細胞中的表達，構建了梅花鹿CGI99基因的RNAi慢病毒載體，并且初步驗證了CGI99基因的沉默對AP細胞的增殖沒有顯著影響。

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（責任編輯 李楠）

Construction of Lentiviral Vector for CGI99 RNAi and Its Effects on Antlerogenic Periosteum Cell Proliferation in Sika Deer

LU Xiao SUN Hong-mei CHU Wen-hui ZHANG Wei LI Chun-yi
（State Key Laboratory of Special Economical Animal Molecular Biology，Institute of Special Animal and Plant Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130000）

CGI99 of antlerogenic periosteum（AP）cells from Chinese sika deer was interfered using the lentivirus-mediated gene silencing system，and a preliminary study on the gene function on proliferation of AP cells was proceeded. One sequence shRNA targeting CGI99 of sika deer was designed，then reassembled into the lentiviral plasmids pLVTHM. Together with the plasmids pSPAX2 and pMD2.G，recombinant lentivirus was acquired by their co-transfection into HEK 293t cells，and then infected into AP cells. Detecting the down-regulating expression level of CGI99 mRNA in infected AP cells was conducted by RT-PCR，and the effect of silenced CGI99 on AP cell proliferation was assayed by MTT. The results showed that the expression level of CGI99 mRNA in cells that infected with recombinant lentivirus was obviously decreased，the interferential efficiency reached 70.8％；and the curves by MTT assay tended to be consistent. Therefore，we successfully constructed RNAi vector for CGI99 and interfered the expression of CGI99 in AP cells，and preliminarily confirmed that the CGI99 presented insignificant effect on the AP cells' proliferation.

deer antler；RNAi；CGI99；antlerogenic periosteum

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.018

2015-12-11

吉林省科技發展計劃項目（20140204010YY），吉林省自然科學基金項目（20140101139JC）

路曉，女，碩士研究生，研究方向：鹿茸生物學；E-mail：1234wuguipa@163.com

李春義，男，研究員，博士生導師，研究方向：鹿茸干細胞與哺乳動物器官再生、鹿茸生物學及其基因工程；E-mail：lichunyi1959@163.com