鴨脂肪間充質干細胞分離培養與生物學特性

劉雪婷元虹懿張明海關偉軍

（1. 東北林業大學，哈爾濱 150040；2. 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193）

鴨脂肪間充質干細胞分離培養與生物學特性

劉雪婷1，2元虹懿1，2張明海1關偉軍2

（1. 東北林業大學，哈爾濱 150040；2. 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193）

建立禽類脂肪來源的間充質干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）體外培養體系，探索其生物學特性和多分化潛能。通過酶消化法分離18日齡鴨胚ADSCs，繪制生長曲線，通過RT-PCR、免疫熒光和流式細胞術陽性率檢測對ADSCs進行鑒定，誘導ADSCs向成骨細胞和脂肪細胞分化。結果表明，鴨胚胎ADSCs體外增殖能力良好；陽性表達CD29，CD44，CD105，表達率分別為95.39％、94.53％和98.19％；經體外誘導后可分化為成骨細胞和脂肪細胞。研究認為在適宜的培養條件下，體外培養的ADSCs能夠穩定增殖并具有多分化潛能，可作為組織工程的種子細胞進行保存。

脂肪間充質干細胞；分離培養；體外誘導分化；多分化潛能；生物學特性

干細胞分為胚胎干細胞［1］、成體干細胞和誘導多能干細胞，均具有自我更新能力和多潛能性。干細胞廣泛應用于臨床治療，為器官衰竭、組織創傷、先天性結構異常等疾病的治療提供了新方法。然而這些治療具有潛在的局限性，包括倫理學問題［2］、器官短缺、供體損傷、過敏反應和排斥反應等。成體干細胞在具有同樣性質的前提下，不涉及倫理道德問題，免疫原性低且易于獲取，因此具有更為廣泛的應用前景［3］。

間充質干細胞（MSCs）為來源于中胚層的非造血干細胞，免疫原性低，不涉及倫理道德問題，是目前為止最具成體干細胞多潛能特征的一類細胞，存在于多種結締組織和器官中。間充質干細胞是一類具有骨形成能力和造血功能的細胞群，來源廣泛。從皮膚［4］、骨骼肌［5］、臍帶［6］、骨膜［7］、外周血［8］、滑膜［9］、周細胞［10］、乳牙［11］等組織中分離出的干細胞具有與骨髓間充質干細胞相似的生物學特性。但由于組織有限、不易獲取或獲取的細胞數量低、體外大量增殖困難等條件的限制，使其治療應用受到限制。

2011年Zuk等［12］首次從脂肪組織中分離出一種具有多分化潛能的干細胞，將其命名為脂肪來源的間充質干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）。盡管ADSCs來自于中胚層，但是具有多胚層分化和多系分化的潛能，在一定條件下能夠分化成各胚層特定的體細胞。ADSCs能夠分化成脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞、肌細胞、牙周細胞［13］、心肌細胞、血管內皮細胞和肌腱細胞［14］等中胚層細胞。

相比較而言，ADSCs來源廣泛、取材方便、對供區創傷小、易于獲得大量細胞、免疫原性低、具有自我更新和多分化潛能，是目前干細胞應用的理想種子細胞。目前，針對ADSCs的研究，大部分集中于鼠、兔、人或其他哺乳動物［15］，對禽類物種的研究很少見。本研究對18日胚齡鴨的ADSCs進行分離培養，對自我更新能力和多分化潛能進行研究，針對表面標記物的表達進行鑒定，旨在為ADSCs的體外培養及生物學特性研究提供新思路。

1　材料與方法

1.1材料

18日齡北京鴨鴨胚由中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所家禽實驗基地提供。

DMEM/F12、胎牛血清、B27、胰蛋白酶為美國Gibco公司產品，Ⅰ型膠原酶、DMSO、TritonX-100、L-谷氨酰胺、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、吲哚美辛、胰島素、油紅O、β甘油磷酸鈉、維生素C、茜素紅、5-氮雜胞苷、臺盼藍為美國Sigma公司產品，bFGF為英國Peprotech公司產品，BSA、山羊血清、山羊抗兔FITC標記二抗為中國北京中杉金橋生物技術有限公司產品，CD29、CD44、CD105、Mhc、 cTnT、GATA為美國Abcame公司產品，多聚甲醛為北京化工廠產品，Trizol為美國Invitrogen公司產品，反轉錄試劑盒TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver. 3.0為中國大連寶生物工程有限公司產品。其他試劑均為國產分析純試劑。

1.2方法

1.2.1ADSCs的分離培養 無菌取18日齡鴨胚腹股溝處及腹部皮下脂肪組織，于含1％青鏈霉素的預冷PBS中漂洗5-8遍后剪碎成糊狀，0.1％膠原酶Ι 37℃消化1 h，消化液的量以浸沒組織為宜。為了使組織與消化液反應充分，消化過程中可適當晃動平皿［16］。用200目細胞篩過濾，收集濾液于15 mL離心管中，室溫下1 200 r/min離心10 min。棄去液體層，用完全培養基［10％FBS，1％B27（Gbico），10 ng/mL bFGF（Peprotech），2 mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM/F-12］重懸細胞沉淀后，以3×104/cm2濃度接種于直徑60 mm的細胞培養皿中，37℃、5％CO2培養。隔日換液。

當細胞生長至80％-90％融合時，棄去培養基，PBS漂洗2次，0.25％胰蛋白酶37℃消化，大量細胞回縮變圓時，以完全培養基反復吹打細胞，視細胞密度進行1∶2或1∶3比例進行傳代。傳代過程中，觀察細胞形態并拍照，每3 d更換一次培養基。通常3-4代后，細胞被純化。

1.2.2生長曲線 常規法消化收集生長狀態良好的P2、P5、P8代細胞，以1.0×104細胞/mL的密度接種于24孔板。每天隨機選取3個孔進行消化計數，每孔計數3次，臺盼藍染色測定細胞活率。以細胞數為縱坐標，培養時間為橫坐標，繪制生長曲線［17］。根據生長曲線計算細胞群體增倍時間（Population doubling time，PDT）。計算公式為：

其中，t：培養終止時間；t0：培養起始時間；Nt：培養終止細胞數；N0：培養起始細胞數。

1.2.3ADSCs的RT-PCR檢測 應用RT-PCR技術檢測ADSCs的CD29、CD44和CD105基因的表達，引物由生工生物工程股份有限公司設計合成（表1）。Trizol法提取第3代ADSCs總RNA，反轉錄成cDNA后進行PCR擴增。PCR反應體系40 μL：ddH2O 14 μL，2×dNTP Mixture 20 μL，上下游引物各2 μL，cDNA 2 μL。PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環；72℃延伸5 min，產物4℃保存。產物進行質量濃度為20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射儀檢測目的基因的表達情況。

表1　RT-PCR引物序列

1.2.4ADSCs表面標記的免疫熒光檢測 取第3 代ADSCs，當細胞融合至50％-60％時，用PBS漂洗3遍，每次5 min，4％多聚甲醛室溫條件下固定15 min，預冷PBS漂洗3次。0.25％Triton X-100通透20 min后，10％山羊血清室溫（中杉金橋）封閉30 min，然后加入抗體CD29（1∶100稀釋），CD44 （1∶100），CD105（1∶100）4℃孵育過夜。棄一抗，PBS漂洗3次然后加入FITC標記的山羊抗兔二抗（1∶100 中杉金橋），室溫避光孵育1 h。避光PBS漂洗3次。最后，用1 μg/mL DAPI孵育30 min 后PBS漂洗3次［18］。于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5ADSCs表面標記的陽性率鑒定 當細胞融合至80％-90％時，常規法消化收集細胞，1 500 r/min離心10 min。棄上清，PBS洗滌沉淀后用預冷的70％乙醇重懸細胞，4℃過夜。1 200 r/min離心10 min后，棄去上清并用PBS洗滌沉淀。0.25％ Triton X-100通透15 min后，PBS漂洗，10％山羊血清（中杉金橋）封閉1 h后，1 200 r/min離心10 min，棄上清。加入抗體CD29（1∶100稀釋），CD44（1∶100），CD105（1∶100）4℃孵育過夜，對照組加入PBS。棄去一抗和對照組的PBS，PBS漂洗后加入FITC標記的山羊抗兔二抗（1∶100，中杉金橋），室溫避光孵育1 h。棄掉二抗，PBS漂洗后稀釋，經80 μm細胞篩處理后上機檢測。選擇參數后，即可畫圖選擇分析區域，排除氣泡上樣分析后，可收集數據［19］。

1.2.6ADSCs的誘導分化及鑒定

1.2.6.1ADSCs的成脂誘導分化及鑒定 細胞生長達到50％-60％融合時，應用成脂誘導液（DMEM/ DF12+10％ FBS+1 μmol/L地塞米松+0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤+200 μmol/L吲哚美辛+10 mg/L胰島素）誘導ADSCs分化，對照組用全培養基繼續培養。

3周后應用油紅O染色法［20］。觀察脂滴，拍照。利用RT-PCR方法檢測脂肪細胞特異性基因脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）和過氧化物酶體增殖因子活化受體-γ（peroxisome proliferato-activated receptor γ，PPAR-γ）的表達情況。

1.2.6.2ADSCs的成骨誘導分化及鑒定 細胞生長達到50％-60％融合時，應用成骨誘導液（DMEM/ DF12+10％FBS+10-7M地塞米松 + 10-2M β-甘油磷酸+ 50 mg/L Vc）誘導ADSCs分化。對照組用完全培養基培養。

3周后應用茜素紅染色法［20］。鏡檢，拍照。利用RT-PCR方法檢測成骨細胞特異性基因骨橋蛋白（Osteopontin）和Ⅰ型膠原（Collagen type Ⅰ）的表達情況。

2　結果

2.1ADSCs的分離培養與形態學觀察

接種24 h后，大部分細胞貼于培養皿底部并向周圍延伸，可見部分多角形、三角形、扁平狀細胞，其中混有大量卵圓形的血細胞（圖1-A）。多次換液后血細胞被祛除，剩余細胞呈現典型的成纖維狀。傳代后，細胞生長迅速，隨著傳代次數增加，細胞逐漸被純化，細胞形成致密單層，呈旋渦狀走勢。連續代次之間細胞保持穩定的形態，沒有明顯差別（圖1-B-D）。10代后，細胞增殖速度減慢，開始出現衰老現象（圖1-E）。傳至13代時，細胞衰老明顯，空泡化加劇、核固縮（圖1-F）。隨著培養時間的延長，部分細胞會從培養皿上脫落。

圖 1 ADSCs形態特征（40×）

2.2ADSCs生長曲線

分別計數P2、P5、P8代ADSCs的增殖情況并繪制生長曲線（圖2）。ADSCs的增殖過程經歷了潛伏期、對數期、平臺期，生長曲線成典型的“S”形。ADSCs潛伏期約為24 h，培養36 h后，細胞進入對數生長期，群體增倍時間（PDT）約為36 h，接種第7天細胞生長速度減慢，進入平臺期。表明體外培養ADSCs具有良好的自我更新和增殖能力，易于體外擴增培養。

圖 2 ADSCs生長曲線

2.3ADSCs表面標記的檢測

由于體內環境和體外培養條件下，ADSCs均表達CD29、CD44和CD105這3種標記基因［21］，因此本實驗針對這3種基因進行檢測。RT-PCR結果（圖3-A）顯示分離培養的ADSCs陽性表達3種標記基因。對P4代ADSCs進行免疫熒光檢測（圖3-B）和陽性率分析（圖3-C），結果表明ADSCs陽性表達CD29、CD44和CD105，其陽性率分別為95.39％、94.53％和98.19％。

2.4ADSCs成脂誘導分化及鑒定

成脂誘導過程中，對照組ADSCs未見形態的改變，無脂滴形成（圖4-A）。誘導組成脂分化7 d部分細胞由長梭型變為扁圓形，出現少量脂滴。隨著誘導時間的延長，脂滴排列緊密且相互融合，體積增大，折光性增強。14 d后，可見大量脂滴環狀排列，一些大脂滴幾乎占據整個細胞（圖4-B）。誘導21 d時進行油紅O染色，可見對照組不著色，誘導組細胞內脂滴被染成紅色（圖4-C）。RT-PCR檢測僅誘導組細胞表達LPL和PPAR-γ（圖4-D）。

圖 3 ADSCs表面標記的檢測

圖4　ADSCs成脂誘導分化及鑒定

2.5ADSCs成骨誘導分化及鑒定

成骨誘導過程中，對照組細胞形態未見改變，未形成鈣結節（圖5-A）。誘導組培養10 d后（圖5-B），部分細胞變成卵圓形，細胞聚集形成結節，折光性增強。14 d時，結節狀細胞增多，鈣鹽沉積增加。培養21 d時，茜素紅染色發現，對照組無著色情況，誘導組結節呈現明亮的紅色（圖5-C）。RT-PCR結果（圖5-D）顯示僅誘導組細胞能夠表達成骨細胞特異性基因Osteopontin和Collagen type I。

圖5　ADSCs成骨誘導分化及鑒定

3　討論

脂肪間充質干細胞來源廣泛，取材方便，易于獲得大量細胞，免疫原性低，具有自我更新和多分化潛能，是目前干細胞應用的理想種子細胞。依據脂肪的分布部位和功能特點，可將其分為兩類：一類為白色脂肪組織，分布于皮下及臟器周圍，主要參與脂肪代謝和能量代謝等生理活動；另一類為棕色脂肪組織，主要分布于新生動物的肩胛部，當生物體受寒冷刺激時，可氧化分解進而散發熱能。但是目前針對于ADSCs的研究，主要集中于哺乳動物，關于禽類脂肪干細胞的研究較少。本實驗成功分離了18日齡鴨胚的脂肪間充質干細胞，并驗證了其自我更新能力和多分化潛能。用0.1％的Ⅰ型膠原酶37℃消化60 min，細胞增殖分化能力良好。ADSCs的增殖擴散能力受供體年齡，脂肪組織類型（白色/棕色脂肪組織）和位置（皮下/內臟）有關。通常供體年齡越小，ADSCs增殖能力和黏附性就越好，隨著細胞代次的增高，增殖能力也逐漸降低［21］。通過對人ADSCs長期體外培養發現，人ADSCs的衰老水平很低，傳至P10代時只有不到5％的細胞表現出衰老現象［12］。初代ADSCs中混雜著許多血細胞，通過多次換液和傳代可去除，體外培養至13代。本實驗ADSCs的生長曲線呈“S”型，從培養36 h開始進入指數生長期，第8天達到高峰，隨后逐漸降低。

目前脂肪干細胞主要從形態學、細胞表面標記、功能等方面進行鑒定。形態學研究表明傳至第3代的ADSCs多呈成長梭形，且按一定方向排列［22，23］。關于脂肪間充質干細胞特異性表面標記，目前說法尚不統一，因此，本實驗選擇了體內環境和體外培養條件下ADSCs均會表達的幾種間充質干細胞標記物。本實驗選擇了CD29、CD44、CD105 這3種細胞表面標記進行了檢測。CD29在胚胎形成、止血、組織修復、惡性腫瘤細胞轉移和免疫反應過程中具有細胞黏附與識別的作用［24］。CD44是一種細胞表面的糖蛋白，在腫瘤細胞侵襲轉移中起促進作用，主要參與異質性黏附，即腫瘤細胞與宿主細胞和宿主基質的黏附［25］。CD105是轉化生長因子β （TGF-β）的受體蛋白，可調節細胞增殖［26］。本實驗用RT-PCR、流式陽性率和免疫熒光檢測第3代 ADSCs CD29、CD44和CD105的表達，結果證實實驗提取的細胞為ADSCs。雖然ADSCs來源于中胚層，但是具有多胚層分化和多系分化的潛能，在一定條件下能夠分化成各胚層特定的體細胞。本實驗選擇脂肪分化前期的標記基因LPL和脂肪分化中期的標記基因PPAR-γ［27］為標記，采用條件培養基成功地將ADSCs誘導為脂肪細胞和成骨細胞，從而證實了ADSCs的多分化潛能。

然而，盡管ADSCs在體外具有多分化潛能，利用干細胞移植進行細胞治療仍然存在許多安全問題和技術問題。因此還需要進一步深入研究，使ADSCs有望成為細胞治療和組織工程應用的優秀種子細胞。

4　結論

本實驗成功分離了18日齡鴨胚的脂肪間充質干細胞，通過體外培養及誘導分化鑒定證明了體外培養的ADSCs具有自我更新能力和多分化潛能。

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（責任編輯 李楠）

Isolation and Biological Characterization of Duck Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells

LIU Xue-ting1，2YUAN Hong-yi1，2ZHANG Ming-hai1GUAN Wei-jun2
（1. Northeast Forestry University，Harbin 150040；2. Institute of Animal Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193）

This study aims to establish in vitro culture system for the poultry adipose-derived stem cells（ADSCs），to study the biological characteristics and the multi-differentiation potential. Enzyme digestion method was applied to separate Beijing duck 18-dayold embryos ADSCs and to draw the growth curve. ADSCs were identified by RT-PCR，immunofluorescence and flow cytometric analysis. Our results suggested that the ADSCs had solid proliferative activity and were positive for CD29，CD44 and CD105，the rate of CD29+，CD44+，and CD105+ ADSCs was 95.39％，94.53％，98.19％，respectively. ADSCs differentiated into adipocytes and osteoblasts by induced differentiation in vitro. In summary，under appropriate experimental circumstances，Beijing duck embryo ADSCs have a strong self-renewing ability and multi-differentiation potential in vitro，and it can be an ideal type of seed cell for cellular transplantation therapy.

adipose-derived stem cells；isolation；in vitro directional differentiation；multi-differentiation potential；the biological characteristics

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.019

2015-11-02

國家自然科學基金項目（31472099），中國農業科學院科技創新工程項目（cxgc-ias-01）

劉雪婷，女，碩士研究生，研究方向：野生動物生態學、保護與管理學；E-mail：esselxt@126.com

張明海，男，教授，博士生導師，研究方向：野生動物生態學、保護與管理學；E-mail：zhangminghai2004@126.com