大口黑鱸潰瘍綜合征病毒MCP基因的原核表達(dá)及重組蛋白的免疫效果初步分析

馬冬梅鄧國成白俊杰江小燕曹婷婷蔡磊

（1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶魚類選育與養(yǎng)殖重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，廣州 510380；2. 淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430070）

大口黑鱸潰瘍綜合征病毒MCP基因的原核表達(dá)及重組蛋白的免疫效果初步分析

馬冬梅1，2鄧國成1白俊杰1，2江小燕1曹婷婷1蔡磊1

（1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶魚類選育與養(yǎng)殖重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，廣州 510380；2. 淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430070）

為了預(yù)防近年來流行于廣東省養(yǎng)殖大口黑鱸（Micropterus salmoides）中的病毒性潰瘍綜合征，以大口黑鱸潰瘍綜合征病毒（Largemouth bass ulcerative syndrome virus，以下簡稱 LBUSV）的主要衣殼蛋白（MCP）作為目標(biāo)抗原蛋白，將MCP基因開放閱讀框插入到pBV220載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，構(gòu)建重組表達(dá)MCP蛋白的工程菌。重組菌經(jīng)過42℃溫度誘導(dǎo)和SDSPAGE電泳，檢測到在分子量51 kD處有一條特異表達(dá)蛋白帶，重組蛋白約占重組菌體總蛋白的30％。重組MCP蛋白經(jīng)洗滌、純化、溶解、復(fù)性和透析后純度達(dá)90％以上。將純化后的重組蛋白與不完全弗氏佐劑混合、乳化后，免疫大口黑鱸，然后進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)，感染后20 d疫苗保護(hù)率最高達(dá)67.7％。結(jié)果表明，該病毒MCP蛋白具有一定的免疫原性，可以作為制作重組疫苗的候選蛋白。

大口黑鱸；潰瘍綜合征病毒；主要衣殼蛋白；原核表達(dá)；免疫效果

大口黑鱸（Micropterus salmoides）因具有生長快、養(yǎng)殖周期短、肉質(zhì)細(xì)致鮮美和容易起捕等特點(diǎn)，目前已成為中國重要的經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種［1，2］。根據(jù)中國《2014年漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒》統(tǒng)計(jì)，2013年中國大口黑鱸的產(chǎn)量約為34萬t。但從2008年起，每年6-10月期間，在廣東省的養(yǎng)殖大口黑鱸中都會流行病毒性潰瘍綜合征表現(xiàn)為皮膚和肌肉壞死潰爛，并伴有脾臟和腎臟變大等，病魚死亡率最高達(dá)60％，該病給養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［3，4］。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，該病毒性潰瘍綜合征是由一種虹彩病毒科（Iridoviridae）蛙病毒屬（Ranavirus）的病毒感染引起的［5］。目前，已對該病毒建立了快速的檢測方法［6-8］，但還沒有有效的治療手段。

魚類的虹彩病毒具有直徑120-300 nm 的二十面體衣殼結(jié)構(gòu)特征［9］，衣殼是包圍在病毒核酸外面的蛋白質(zhì)外殼，虹彩病毒的主要衣殼蛋白（major capsid protein，MCP）分子量約為50 kD，占病毒總蛋白的40％-45％［10］。衣殼蛋白具有保護(hù)病毒核酸和介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合的作用，一般具有該種病毒特異的表面抗原，可刺激宿主的機(jī)體產(chǎn)生病毒抗原免疫應(yīng)答［11，12］。疫苗免疫是預(yù)防魚類流行疾病發(fā)生的一種有效方法，傳統(tǒng)的魚用疫苗以獲取方法來分有活疫苗、滅活疫苗和化學(xué)疫苗［13］。新型的用基因工程疫苗（synthetic peptide vaccine）是利用DNA重組技術(shù)方法，將病毒的抗原基因片段定向插入載體，導(dǎo)入細(xì)菌、酵母菌或哺乳動物細(xì)胞等宿主中，使之重組表達(dá)，經(jīng)純化后而制得的疫苗［14，15］。基因工程疫苗具有制備容易、可大量生產(chǎn)、穩(wěn)定、易保存、副反應(yīng)少、使用安全等優(yōu)點(diǎn)，但存在免疫原性不足的缺點(diǎn)［13，14］。以魚類虹彩病毒MCP作為保護(hù)性抗原的基因工程疫苗已有大量的研究報(bào)道，但在實(shí)際應(yīng)用中還存在爭議，如在國內(nèi)外對虹彩病毒的研究中都有發(fā)現(xiàn)MCP是魚虹彩病毒的保護(hù)性抗原，具有一定的免疫保護(hù)效果［16，17］，但同時也有文獻(xiàn)報(bào)道MCP是一種無效抗原，盡管具有較強(qiáng)的免疫原性，但并不能介導(dǎo)有效地免疫保護(hù)［18，19］。

為了預(yù)防近年來流行的病毒性大口黑鱸潰瘍綜合征，本研究利用原核表達(dá)的方法，構(gòu)建重組表達(dá)該致病病毒MCP蛋白的重組工程菌。重組菌表達(dá)的重組蛋白經(jīng)過純化、復(fù)性和濃縮，與不完全弗氏佐劑混勻乳化后免疫大口黑鱸，并檢測LBUSV 的MCP蛋白免疫保護(hù)效果，旨在為該病毒病疫苗的開發(fā)提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

實(shí)驗(yàn)用大口黑鱸潰瘍綜合征病毒（Largemouth bass ulcerative syndrome virus，LBUSV）由珠江水產(chǎn)研究所生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室保存。感染實(shí)驗(yàn)用的大口黑鱸來自珠江水產(chǎn)研究所良種基地，平均體質(zhì)量約為50 g，經(jīng)PCR檢測LBUSV病毒［6］為陰性，認(rèn)為是健康魚用于實(shí)驗(yàn)。

1.2方法

1.2.1大口黑鱸潰瘍綜合征病毒MCP重組表達(dá)工程菌的構(gòu)建 根據(jù)LBUSV MCP基因的1 392 bp的ORF設(shè)計(jì)引物MCPEP1：5'-CGGAATTCATGTCTTCT GTTACGGGTTC-3'和MCPEP2：5'-CGCGGATCCTTA CAGGATGGGGAAACCCA-3'，PCR產(chǎn)物經(jīng)過純化后，用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切并插入pBV220原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)過篩選得到陽性克隆，在ABI 3730自動測序儀上進(jìn)行測序。

1.2.2MCP重組蛋白的表達(dá)和純化 將測序結(jié)果正確的陽性重組大腸桿菌接種在LB培養(yǎng)基中，37℃200 r/min 培養(yǎng)至OD600值達(dá)0.4-0.5時，將菌液快速升溫至42℃誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)，4 h后停止誘導(dǎo)，離心以收集細(xì)菌菌體，超聲波破碎后，12 000 r/min離心10 min分別取上清液和沉淀物，用12％ SDS-PAGE膠電泳、考馬斯亮藍(lán)染色，檢測。包涵體先用0.05 mol/L Tris-HCl（pH8.5）洗滌1次，含2 mo/L尿素的Tris-HCl（pH8.5）洗滌2次，再用含有4 mol/L 尿素的Tris-HCl（pH8.5）各洗滌1次，最后用8 mol/L 尿素溶解包涵體。將溶解后的蛋白溶液裝入透析袋進(jìn)行尿素梯度濃度透析以去除尿素，并用聚乙二醇6000濃縮后，用12％ SDS-PAGE電泳檢測，并用Bradford 法測定純化后的蛋白濃度［20］。

1.2.3免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn) 把健康的大口黑鱸隨機(jī)分為4組，每組35尾，其中3個實(shí)驗(yàn)組，1個對照組。將純化后的重組MCP蛋白與不完全弗氏佐劑混合并乳化后，實(shí)驗(yàn)魚腹腔注射進(jìn)行免疫，3個實(shí)驗(yàn)組的免疫劑量分別為每尾魚50 μg/200 μL、100 μg/200 μL和150 μg/200 μL，對照組腹腔注射0.05 mol/L Tris-HCl（pH8.5）。免疫后分別放入獨(dú)立已消毒的5 m3的水泥池中，實(shí)驗(yàn)過程中每天早晚各投喂一次飼料和吸污一次，水溫控制在28℃左右，免疫30 d后，實(shí)驗(yàn)組和對照組全部進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，每尾背鰭肌肉注射劑量為102.5LD50/0.2 mL，每天觀察記錄各組魚的死亡情況，20 d后計(jì)算免疫實(shí)驗(yàn)保護(hù)效率：

將發(fā)病的死魚進(jìn)行PCR檢測，以確定死亡原因。

2　結(jié)果

2.1MCP蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

對測序結(jié)果證明插入正確的重組工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，溫度誘導(dǎo)后的重組菌經(jīng)SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色后，在分子量約51 kD處檢測到一條特異表達(dá)蛋白帶，與預(yù)期蛋白大小一致，42℃溫度誘導(dǎo)4 h該工程菌特異表達(dá)的重組蛋白約占菌體總蛋白量的30％。將誘導(dǎo)后的重組菌超聲波破碎、離心后，分別取上清液和沉淀物進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果（圖1）表明，工程菌表達(dá)的重組蛋白帶主要是以包涵體的形式出現(xiàn)在沉淀物中，而上清液中基本無此特異條帶的出現(xiàn)。

圖1　SDS-PAGE檢測重組主要衣殼蛋白（MCP）的表達(dá)

2.2MCP蛋白的純化

將表達(dá)MCP蛋白的重組工程菌超聲波破碎、離心得到的沉淀即為包涵體，優(yōu)化洗滌方法，用尿素洗滌沉淀中的包涵體純化MCP蛋白，然后用8 mol/L尿素溶解包涵體，并透析復(fù)性濃縮。純化后的MCP蛋白占溶液中總蛋白濃度的90％（圖2）。用Bradford 法測定蛋白濃度，每升LB培養(yǎng)基可生產(chǎn)純化的重組MCP蛋白約86.7 mg。

圖2　SDS-PAGE檢測重組MCP蛋白的純化

圖3　累積死亡曲線

2.3MCP蛋白免疫保護(hù)效果

將純化后的MCP蛋白以3個不同的濃度與不完全弗氏佐劑乳化后免疫大口黑鱸，30 d后進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，檢測免疫保護(hù)效果。結(jié)果（圖3）表明，攻毒后第6天開始，除150 μg組外，各組均有魚開始發(fā)病死亡，而150 μg組是在攻毒后第7天開始出現(xiàn)發(fā)病死亡；第7-9天，除150 μg組外，各組死亡率加劇，對照組累積死亡率最高，達(dá)94.3％，50 μg組和100 μg組分別為73.5％和42.9％，而150 μg組是在攻后第10天出現(xiàn)死亡加劇，累積死亡率為29％；對照組在第10天累積死亡率達(dá)到100％，而100 μg組和150 μg組在第11天累積死亡率達(dá)到峰值，分別為57.1％和32.3％，50 μg組在第12天累積死亡率為85.3％，從第13天開始各組再無實(shí)驗(yàn)魚死亡。對照組與免疫組相比死亡速度最快、死亡率最高，免疫劑量達(dá)150 μg的實(shí)驗(yàn)組免疫效果最好，攻毒15 d，保護(hù)率達(dá)67.7％，比100 μg組（保護(hù)率42.9％）和50 μg組（保護(hù)率11.8％）的免疫效果顯著提高（表1）。以每尾魚50 g計(jì)算，MCP蛋白的免疫劑量要在3 μg/g魚以上才能達(dá)到較好的免疫效果。經(jīng)PCR檢測，攻毒后的發(fā)病魚均感染了LBUSV（圖4）。

表1　MCP蛋白免疫效果分析

圖4　PCR檢測發(fā)病魚電泳結(jié)果

3　討論

人類基因工程疫苗已有深入的研究和廣泛的應(yīng)用［21，22］，在魚類中重組蛋白疫苗的開發(fā)還一直處于研究階段，但也有多種漁用重組蛋白疫苗和DNA疫苗等新型疫苗得到研究和開發(fā)［23，24］，如IPNV重組VP2亞單位疫苗［25］、VHSV重組G蛋白亞單位和AHNV重組MCP重組［26］蛋白疫苗的研制和開發(fā)，魚類基因工程疫苗有著廣闊的發(fā)展前景，是魚類疫苗發(fā)展的重要方向［27］。選擇免疫原性好的目標(biāo)蛋白對于成功開發(fā)重組蛋白疫苗至關(guān)重要，病毒的衣殼蛋白因具有較強(qiáng)的抗原特性，成為魚類重組病毒蛋白疫苗開發(fā)和制備的首選優(yōu)良候選目標(biāo)蛋白。

關(guān)于重組虹彩病毒MCP疫苗免疫效果的研究結(jié)果很不一致，有的研究發(fā)現(xiàn)MCP是魚虹彩病毒的保護(hù)性抗原，具有一定的免疫保護(hù)效果，但有研究卻認(rèn)為MCP是一種無效抗原，盡管具有較強(qiáng)的免疫原性，但并不能介導(dǎo)有效的免疫保護(hù)［16-19］。本研究表明，大口黑鱸潰瘍綜合征病毒（LBUSV）的主要衣殼蛋白MCP作為免疫蛋白源對大口黑鱸進(jìn)行免疫具有一定的免疫效果。與本研究相似，重組虹彩病毒MCP疫苗的研究表明，將鱖傳染性脾腎壞死病毒重組MCP免疫鱖，再用該病毒攻毒后，每尾魚（體質(zhì)量40-50 g）注射50 μg重組MCP蛋白組免疫保護(hù)效率最高，達(dá)64.3％［29，30］。用重組大西洋鱈魚神經(jīng)壞死病毒（SJNNV）衣殼蛋白免疫大西洋鱈魚（平均體質(zhì)量約為2.2 g），攻毒后10 μg組比50 μg組免疫效果好，免疫保護(hù)效率最高達(dá)80％以上［31］。用赤點(diǎn)石斑魚神經(jīng)壞死病毒衣殼蛋白基因重組蛋白制備的疫苗免疫軍曹魚，經(jīng)過3次免疫和一次免疫，相對保護(hù)率最高分別為56％和54％，但濃度50 μg組的免疫效果比10 μg和100 μg的免疫效果好［32］。以上研究表明重組病毒衣殼蛋白的免疫保護(hù)效率約在50％-80％之間。與本研究結(jié)果相比，以LBUSV的主要衣殼蛋白MCP作為免疫蛋白源對大口黑鱸進(jìn)行免疫，每尾魚（平均體質(zhì)量約為50 g）注射150 μg MCP蛋白免疫1個月，免疫保護(hù)率為67.7％，約每克大口黑鱸需注射3 μg重組MCP蛋白即可產(chǎn)生免疫保護(hù)效果，免疫原蛋白需求量高于鱖傳染性脾腎壞死病毒重組MCP疫苗［29，31］，低于大西洋鱈魚重組神經(jīng)壞死病毒（SJNNV）重組MCP疫苗，免疫原蛋白需求量可能與魚的種類和魚的體質(zhì)量有關(guān)。

在用大腸桿菌表達(dá)重組MCP蛋白時，該研究首先選用的是pET-30c（+）（Novagen公司）載體構(gòu)建了MCP基因的表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)誘導(dǎo)后得到分子量約60 kD的帶組氨酸標(biāo)簽的重組表達(dá)蛋白，但在純化時，該蛋白不能與Ni親合純化柱結(jié)合，可能是由于蛋白在復(fù)性時發(fā)生了異構(gòu)化，組氨酸標(biāo)簽不能很好地暴露在蛋白表面，或形成了細(xì)小的沉淀［33］，所以未能與Ni親合純化柱有效結(jié)合。將MCP基因插入用pBV220載體，進(jìn)行溫度誘導(dǎo)得到了51 kD大小的重組蛋白，去掉了用pET-30c（+）載體表達(dá)的組氨酸標(biāo)簽，用傳統(tǒng)的尿素洗滌的方法得到了純化的MCP蛋白［34］，純度達(dá)90％。該方法與Ni親合純化柱相比也有操作簡單，成本低，純化速度快等優(yōu)點(diǎn)，更適合大量生產(chǎn)疫苗的需求。

4　結(jié)論

將大口黑鱸潰瘍綜合征病毒的MCP基因經(jīng)過改造后，插入到原核表達(dá)載體pBV220，構(gòu)建重組表達(dá)MCP蛋白的工程菌。工程菌經(jīng)過溫度誘導(dǎo)，表達(dá)的重組MCP蛋白經(jīng)過純化和復(fù)性后與不完全弗氏佐劑乳化后，免疫大口黑鱸，然后進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)，20 d后計(jì)算疫苗保護(hù)率最高達(dá)67.7％。結(jié)果表明，該病毒MCP蛋白具有一定的免疫原性，可以作為制作重組疫苗的候選蛋白。

［1］ 梁素嫻， 白俊杰， 葉星， 等. 養(yǎng)殖大口黑鱸的遺傳多樣性分析［J］. 大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2007， 22（4）：260-263.

［2］Bai JJ， Lutz-carrillo DJ， Quan YC， et al. Taxonomic status and genetic diversity of cultured largemouth bass Micropterus salmoides in China［J］. Aquaculture， 2008， 278：27-30.

［3］鄧國成， 謝駿， 李勝杰， 等. 大口黑鱸病毒性潰瘍病病原的分離和鑒定［J］. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)， 2009， 33（5）：871-877.

［4］鄧國成， 白俊杰， 李勝杰， 等. 大口黑鱸池塘養(yǎng)殖常見病害及其防治［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011， 18：102-103.

［5］Deng GC， Li SJ， Xie J， et al. Characterization of a ranavirus isolated from cultured largemouth bass（Micropterus salmoides）in China［J］. Aquaculture， 2011， 312：198-204.

［6］馬冬梅， 白俊杰， 鄧國成， 等. 大口黑鱸潰瘍綜合癥病毒MCP基因序列分析及PCR快速檢測方法的建立［J］. 中國水產(chǎn)科學(xué)，2010， 17（6）：1149-1156.

［7］馬冬梅， 白俊杰， 鄧國成， 等. 大口黑鱸潰瘍綜合癥病毒TaqMan-MGB探針熒光定量PCR檢測方法的建立［J］. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2011， 32（2）：99-102.

［8］王慶， 曾偉偉， 劉春， 等. 大口黑鱸虹彩病毒雙重PCR 檢測方法的建立［J］. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2013， 32（4）：106-110.

［9］Williams T. The iridoviruses［J］. Adv Virus Res， 1996， 46：345-412.

［10］ Chinchar VG， Essbauer S， He JG， et al. Family Iridoviridae［R］// Fauquet CM， Mayo MA， Maniloff J， et al. Virus taxonomy. Classification and nomeclature of viruses. Eighth report of the international committee on the taxonomy of viruses. San Diego：Academic Press， 2005：145-162.

［11］張奇亞， 桂建芳. 水生病毒學(xué)［M］. 北京：高等教育出版社，2008：12.

［12］Young RK， Jun-ichi H， Ho BJ， et al. Identification and determination of antigenic proteins of Koreanranavirus-1（KRV-1）using MALDI-TOF/TOF MS analysis［J］. Comp Immunol Microbiol Infect Dis， 2011， 34：237-245.

［13］ 張穎， 楊舸. 魚類疫苗的研究概況與進(jìn)展［J］. 西昌學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版， 2009， 23（1）：13-14.

［14］田園園， 葉星. 魚用基因工程疫苗研究進(jìn)展［J］. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)， 2012， 5：145-152.

［15］夏永娟， 黃威權(quán). 新型魚用疫苗的研究進(jìn)展［J］. 中國水產(chǎn)科學(xué)， 2001， 8（1）：86-88.

［16］Kim TJ， Jang EJ， Lee JI. Vaccination of rock bream， Oplegnathus fasciatus（Temminck and Schlegel）， using a recombinant major capsid protein of fish iridovirus［J］. J Fish Dis， 2008， 31：547-551.

［17］Nusbaum KE， Smith BF， Delnnocentes P， Bird RC. Protective immunity induced by DNA vaccination of channel catfish with early and late transcripts of the channel catfish herpesvirus（IHV-1）［J］. Vet Immunol Immunopathol， 2002， 84：151-168.

［18］Shimmoto H， Kawai K， Ikawa T， Oshima S. Protection of red sea bream Pagrus major against red sea bream iridovirus infection by vaccination with a recombinant viral protein［J］. Microbiol Immunol， 2010， 54（3）：135-142.

［19］Zhang M， Hu YH， Xiao ZZ， et al. Construction and analysis of experimental DNA vaccines against megalocytivirus［J］. Fish Shellfish Immunol， 2012， 33（5）：1192-1198.

［20］汪家政， 范明. 蛋白質(zhì)技術(shù)手冊［M］. 北京：科學(xué)出版社，2002：42-47.

［21］張婷婷. 特異性抗原融合蛋白結(jié)核病疫苗研究進(jìn)展［J］. 微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展， 2014， 42（1）；61-66.

［22］陳洪. 合成肽重組疫苗的抗病毒效力［J］. 國外醫(yī)學(xué)：預(yù)防.診斷. 治療用生物制品分冊， 2002， 25（5）：211-214.

［23］Van Muiswinkel WB， Nakao M. A short history of research on immunity to infectious diseases in fish［J］. Dev Comp Immunol，2014， 43（2）：130-50.

［24］Leong JC， Anderson E， Bootland LM， et al. Fish vaccine antigens produced or delivered by recombinant DNA technologies［J］. Dev Biol Stand， 1997， 90：267-277.

［25］Sommerset I， Skern R， Biering E， et al. Protection against Atlantic halibut nodavirus in turbot is induced by recombinant capsid protein vaccination but not following DNA vaccination［J］. Fish Shellfish Immunol， 2005， 18（1）：13-29.

［26］Lepal A， Siwickil AK， Terech-majewska E. Application of DNA vaccines in fish［J］. Polish J Veterin Sci， 2010， 13（1）：2l3-215.

［27］Salgado-miranda C， Loza-rubio E， Rojas-anaya E， et al. Viral vaccines for bony fish：past， present and future［J］. Expert Rev Vaccines， 2013， 12（5）：567-578.

［28］Mao J， Wang J， Chinchar G D， et al. Molecular characterization of a ranavirus isolated from largemouth bass Micropterus salmoides［J］. Dis Aquat Organ， 1999， 37（2）：107-114.

［29］張敏， 白俊杰， 勞海華， 等. 鱖傳染性脾腎壞死病毒主要衣殼蛋白基因的原核表達(dá)［J］. 中國病毒學(xué)， 2004， 19（2）：137-140.

［30］付小哲， 李寧求， 彭媛媛， 等. 鱖傳染性脾腎壞死病毒重組主衣殼蛋白免疫效果的初步驗(yàn)證［J］. 中國水產(chǎn)科學(xué)， 2009， 16 （3）：388-393.

［31］Husgar S， Grotmol S， Hjeltnes BK， et al. Immune response to a recombinant capsid protein of striped jack nervous necrosis virus （SJNNV）in turbot Scophthalmus maximus and Atlantic halibut Hippoglossu shippoglossus， and evaluation of a vaccine against SJNNV［J］. Dis Aquat Organ， 2001， 45：33-44.

［32］蘇友祿， 郭志勛， 馮娟， 等. 神經(jīng)壞死病毒 MCP 重組疫苗對軍曹魚稚魚的免疫保護(hù)［J］. 生物技術(shù)通報(bào)， 2009（S1）：228-241.

［33］龔曉亮， 朱家鴻. 細(xì)菌重組蛋白的表達(dá)及分離純化［J］. 國外醫(yī)學(xué)：預(yù)防. 診斷. 治療用生物制品分冊， 1991， 14（2）：49-52.

［34］龍英娜， 劉煥奇， 王明志. 重組包涵體的純化和復(fù)性［J］. 黑龍江畜牧獸醫(yī)， 2008， 4：70-72.

（責(zé)任編輯 李楠）

Prokaryotic Expression of MCP Gene from Largemouth Bass Ulcerative Syndrome Virus and the Immune Effect Analysis of Recombinant Protein

MA Dong-mei1，2DENG Guo-cheng1BAI Jun-jie1，2JIANG Xiao-yan1CAO Ting-ting1CAI Lei1
（1. Key Laboratory of Tropical ＆amp; Subtropical Fishery Resource Application ＆amp; Cultivation（Ministry of Agriculture），Pearl River Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Guangzhou 510380；2. Freshwater Aquaculture Collaborative Innovation Center of Hubei Province，Wuhan 430070）

For preventing the outbreak of viral ulcerative syndrome in largemouth bass（Micropterus salmoides）in Guangdong province，the ORF of major capsid protein（MCP）gene，as target antigen protein gene，from largemouth bass ulcerative syndrome virus（LBUSV）was inserted in vector pBV220，then transformed into Escherichia coli DH5α，and the recombinant engineering bacterium for expressing MCP was constructed. Following 42℃ temperature inducement and SDS-PAGE analysis，the recombinant bacterium was detected to produce a special expression protein with molecular weight about 51 kD，and the proportion of recombinant MCP protein was nearly 30％ of total bacterial protein. After washed，purified，dissolved，renatured and dialyzed，the purity of the recombinant protein reached over 90％. The purified protein was mixed and emulsified with incomplete Freund's adjuvant，then was injected in largemouth bass as vaccine. The immunized fish were challenged with LBUSV，and the highest relative percentage of survival reached 67.7％ after 20 days. The results indicate that the MCP of LBUSV has the immunogenicity and can be selected as candidate protein for recombinant vaccine.

largemouth bass（Micropterus salmoides）；ulcerative syndrome virus；major capsid protein；prokaryotic expression；immune effect

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.021

2015-11-04

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31001107），“948”計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2011-G12），國家科技支撐計(jì)劃（2012BAD26B03），廣東省省級科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015A020209035）

馬冬梅，女，博士，副研究員，研究方向：魚類遺傳育種；E-mail：madongmei2003@163.com

白俊杰，男，研究員，研究方向：水產(chǎn)動物遺傳育種及生物技術(shù)；E-mail：jjbai@163.net