一株玉米根際多功能促生菌的篩選鑒定及效應研究

萬兵兵劉曄吳越張東艷王國文姜瑛

（1. 河南農業大學資源與環境學院，鄭州 450000；2. 南京農業大學資源與環境科學學院，南京 210095；3. 山東省土壤肥料總站，濟南 250100）

一株玉米根際多功能促生菌的篩選鑒定及效應研究

萬兵兵1，2劉曄1吳越3張東艷1王國文1姜瑛1

（1. 河南農業大學資源與環境學院，鄭州 450000；2. 南京農業大學資源與環境科學學院，南京 210095；3. 山東省土壤肥料總站，濟南 250100）

從鄭州市砂質潮土中分離純化出5株玉米根際促生菌，通過測定其固氮酶活性、解磷能力、解鉀能力以及吲哚乙酸（IAA）合成量，篩選出能夠制作高效微生物肥料的活性菌劑。搖瓶結果表明，菌株YM4具有較高的固氮酶活性，溶解無機磷、鉀的能力較強，合成IAA的能力最強。其中固氮酶活性達到15.53 nmol C2H4/（h·mL），對磷酸三鈣、難溶性硅酸鉀的溶磷量和溶鉀量分別達到128.90 mg/L和17.40 mg/L，IAA的合成量為37.18 mg/L。經形態觀察、部分生理生化特征測定及 16S rDNA 的保守序列鑒定，確定該菌株為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）。盆栽試驗結果表明，與對照組相比，接種該菌株的盆栽土壤中IAA、礦質氮、速效磷、速效鉀含量分別提高了136.36％、42.1％、67.41％和14.29％；植株根系形態也發生了顯著變化，其中根系總長、總面積、總體積、根尖總數分別增加了172.24％、141.73％、112.14％和104.53％；植株鮮重、株高、SPAD值及氮、磷、鉀含量分別提高了130.07％、150.65％、151.56％、120.99％、166.33％和138.21％。該菌株具有高效固氮、解磷、解鉀及合成IAA的能力，在農業生產的開發利用中具有較大應用潛力。

根際促生菌；固氮；解磷；解鉀；IAA

玉米生產在我國農業生產和發展中處于至關重要的地位［1］，隨著物質水平和科學技術的提高，玉米不再僅僅發揮作為食物原料的作用，在淀粉、制糖、榨油、釀酒，醫藥等領域的用途日益廣泛［2］。而我國人均土地比較匱乏，玉米種植面積已很難擴大，當前的玉米生產已遠遠不能滿足人們的需求，因此，在我國，提高玉米的單位產量是當務之急［1］。施用化肥、提高土壤養分含量是解決這一問題的主要途徑，而長期、大量工業化肥的施用不僅會增加農業投入成本，還會使土壤肥力下降、有害物質累積、破壞土壤微生態環境，甚至會造成水體富營養化，危害生態安全［3，4］。

微生物菌劑通過活性微生物的生命活動，能夠溶解土壤固定的無機磷、鉀，促進吲哚乙酸（IAA）的合成，提高氮的固定量，促進作物的生長，提高產品的質量，是一種新型的生態制劑［5-7］。而植物根際中含有大量的微生物，其中大部分為植物根際促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR），能夠用于微生物菌劑制作［7，8］，自1978年被Kloepper和Schroth首次提出至今，PGPR已被廣泛應用于農業生產中［9］。目前，微生物菌劑的發展研究主要是針對蔬菜、水果、茶和藥用植物等經濟作物，對糧食作物上的研究比較少［10］，基于此，作者擬從玉米根際土壤中篩選出多功能植物促生菌，對菌株進行篩選鑒定以及對應用效果進行研究，為PGPR在玉米生產上的應用提供理論依據。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1供試土壤 采自鄭州市農業部華北小麥玉米輪作營養與施肥科學觀測試驗站 0-20 cm表層土壤，理化性質見表1。

表1　供試土壤（砂質潮土）基本性質

1.1.2培養基配制 LB培養基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉 10.0 g，蒸餾水1 L，pH7.0-7.2。無機鹽培養基：硫酸銨2.0 g，磷酸二氫鈉0.5 g，磷酸氫二鉀0.5 g，七水硫酸鎂0.2 g，二氯化鈣0.1 g，蒸餾水1 L，pH7.0。Ashby無氮培養基：甘露醇10.0 g，磷酸氫二鉀0.2 g，七水硫酸鎂0.2 g，氯化鉀0.2 g，二水硫酸銨0.2 g，碳酸鈣5.0 g，pH7.2。無機磷培養基：磷酸三鈣5.0 g，葡萄糖10.0 g，硫酸銨0.5 g，氯化鈉0.3 g，七水合硫酸鎂0.3 g，氯化鉀0.3 g，蒸餾水1 L，pH7.0-7.2。液態解鉀細菌培養基：蔗糖10.0 g，酵母膏0.5 g，硫酸銨1.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，七水硫酸鎂0.5 g，碳酸鈣1.0 g，鉀長石粉1.0 g，蒸餾水1 L。121℃滅菌20 min。

1.2方法

1.2.1供試土壤基本理化性狀的測定方法 供試土壤理化性質和盆栽植株各指標的測定方法參考《土壤農化分析》（第3版）［11］，重鉻酸鉀容量法——外加熱法測定土壤有機質；半微量開氏法測定土壤全氮；還原蒸餾法測定土壤礦質氮；HClO4-H2SO4消煮-鉬銻抗比色法測定土壤全磷；0.5 mol/L NaHCO3法測定土壤速效磷；NaOH熔融-火焰光度法測定土壤全鉀；NaHCO3浸提-火焰光度法測定速效鉀；鉬黃比色法測定植株全磷；火焰光度法測定植株全鉀。

1.2.2菌株的篩選

1.2.2.1菌株的分離純化 從鄭州市農業部華北小麥玉米輪作營養與施肥科學觀測試驗站玉米試驗大田中選出一株長勢較好的玉米，去其地上部分，用手輕輕抖落根系上的土壤，裝入無菌袋中，帶回實驗室。在實驗室內，將根系懸浮于無菌水中，形成根際土壤懸浮液，按照微生物10倍梯度稀釋法操作，將懸浮液稀釋至10-6，將不同濃度的懸浮液涂布在LB平板上，30℃倒置培養1 d，分離純化出根際不同菌株，置4℃條件下保存備用［12］。

1.2.2.2溶磷能力測定 在無菌操作臺中，將分離的菌株分別接種于盛有30 mL無機磷培養基的150 mL三角瓶，放置于搖床中，設置搖床溫度為30℃，轉速180 r/min。培養3 d，4℃下用10 mL的離心管將培養液10 000 r/min離心，10 min后，取出離心管，轉移出上清液，用鉬藍比色法測定有效磷含量。

1.2.2.3溶鉀能力測定 在無菌操作臺中，將分離的菌株分別接種于盛有30 mL液態解鉀細菌培養基的150 mL三角瓶，放置于搖床中，設置搖床溫度為30℃，轉速180 r/min。培養3 d，用10 mL的離心管將培養液10 000 r/min離心，10 min后，取出離心管，轉移出上清液，用火焰分光光度計測定鉀的含量。

1.2.2.4固氮能力測定 將已純化的固氮菌分別接入無氮液體培養基中，培養24 h后用離心法收集菌細胞，在收集到的菌細胞中加入45 mL無菌水和5 mL無氮液體培養基，形成50 mL固氮菌懸浮液（每毫升約107個菌細胞）作為待接種菌液。

1.2.2.5固氮酶活性采用乙炔還原法測定 將上述菌株接種在裝有2 mL無氮液體培養基的青霉素小瓶中，30℃下培養18-24 h；將棉塞換為反口膠塞密封，用密封性好的注射器先從培養有菌的青霉素小瓶抽取0.5 mL空氣，再注入0.5 mL C2H2，用膠布密封針眼；繼續培養24 h后，取100 μL氣樣在氣相色譜儀上測定C2H4峰值，標準氣C2H4濃度為130 mg/L。

采用美國HP公司生產的HP6890型氣相色譜儀，其工作條件設置為：氫火焰離子化檢測器，溫度250℃，H2流量30 mL/min，壓力20 kPa；色譜柱為毛細管，柱長15.0 m，內徑320 μm，爐溫30℃；載氣N2，流量30 mL/min，壓力20 kPa；空氣流量250 mL/min；前進樣口溫度250℃，壓力20 kPa。乙炔還原活性［ARA（nmol C2H4/h·mL）］，計算方法為：

1.2.2.6IAA分泌細菌的測定

（1）定性測定：將分離純化后的細菌接種于含有 L-色氨酸（80 mg/L）的LB液體培養基，每一菌株3個重復，搖床培養（30℃，180 r/min）1 d后，取50 μL菌懸液滴于白色陶瓷板上，同時加入等體積的Salkowski比色液（50 mL 35％ HClO4+ 1 mL 0.5 mol/L FeCl3）［13］，并以加入50 μL未接菌的 LB 液體培養基與等體積比色液的混合溶液為對照。將白色陶瓷板于室溫避光放置 30 min 后觀察，顏色變粉紅者為陽性，表示能夠分泌IAA，顏色越深表示分泌的強度越大，不變色為陰性，表示不能分泌IAA。

（2）定量測定：對初篩獲得的能分泌IAA的細菌進行定量測定，培養條件同上。首先用分光光度法測定菌懸液的OD600值，然后將菌懸液以10 000 r/min 離心10 min取上清液加入等體積Salkowski比色液，避光靜置 30 min，測定其 OD530值［14］。對照標準曲線計算單位體積發酵液中 IAA 的含量。標準曲線的繪制采用分析純的 IAA 梯度稀釋制備。

（3）IAA標準曲線配置：精確稱取32.8 mg的IAA于100 mL容量瓶中，用甲醇定容（該溶液含IAA 328 μg/mL）。再用甲醇依次稀釋1倍，連續進行4次，配成5份濃度依次相差1倍的標準溶液，比色時也是等量的標準溶液加等量的比色液。

1.2.3菌株形態、生理生化指標的測定及分子鑒定

1.2.3.1菌落形態觀察 將篩選的菌株接種到LB平板上，30℃培養24 h，觀察菌落的大小、形狀、顏色、光澤度、黏稠度、隆起形狀、透明度、邊緣特征及有無芽孢等［15］。

1.2.3.2生理生化指標的測定 依據《細菌系統鑒定手冊》［16］、《伯杰細菌鑒定手冊》（第8版）［17］，對該菌株進行好氧性、過氧化氫酶 、甲基紅、乙酞甲基甲醇、淀粉水解、硝酸鹽還原、檸檬酸鹽利用試驗。

1.2.3.3分子鑒定 將菌株用 LB 液體培養基培養至對數生長期，離心收集菌體，采用 SDS-CTAB法提取總基因組 DNA［18］，采用16S rDNA通用引物 27f（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492r（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進行16S rDNA的PCR擴增。PCR 反應條件：94℃預變性30 s；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸60 s，35個循環。將PCR 產物進行1.5％的瓊脂糖凝膠電泳［19］。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳后回收純化測序（北京美億美生物技術有限公司），根據獲得的16S rDNA序列在GenBank中Blast 搜索同源序列，通過 MEGA5.0 軟件，建立系統發育。

1.2.4盆栽試驗 種子催芽：品種選用鄭單958，經20％雙氧水表面消毒20 min，無菌水沖洗多次，置于無菌培養皿中，25℃，催芽2 d，選取發芽較好，長勢一致的玉米種芽備用。

移栽處理：每盆裝土700 g，將備用的玉米種芽移栽入盆缽中，每盆移栽一株玉米種芽，加入適量、等量的無菌水，使盆栽含水量達到最大田間持水量的60％，設置接菌處理與對照處理，每個處理6個重復。接菌處理接種YM4菌劑，接種量為108CFU/g，對照盆栽中加入等量的無菌水，所有處理均不施用肥料，每天定量噴施無菌水，保持土壤含水量。

溫室保持20℃，培養一個月，測定玉米的SPAD值、株高、鮮重、全氮、磷、鉀含量及土壤中IAA、礦質態氮及速效磷、鉀含量，并用根系掃描儀（LA1600+scanner，Canada）掃描獲得根系圖像，用根系分析軟件（Winrhizo2003b，Canada）掃描根系圖像，獲取根系部分指標的二維形態參數。

2　結果

2.1菌株的篩選結果及其固氮酶活性、磷鉀溶解及IAA合成能力

圖1　接種菌株YM4對有效磷（A）、有效鉀（B）、固氮酶活性（C）及IAA（D）合成的影響

從玉米根際土壤中共篩選出5株植物促生菌，分別編號為YM1、YM2、YM3、YM4和YM5。經液態搖瓶試驗，結果（圖1）表明，菌株YM4的固氮能力最強，接種菌株YM4的培養基中固氮酶活性達到15.53 nmol C2H4/（h·mL），固氮能力顯著高于其他4株菌株；各菌株溶解無機磷、鉀的能力差異達到顯著水平，其中YM2、YM4對無機磷的轉化量分別達到119.48 mg/L和126.9 mg/L，轉化量顯著高于其他3株菌株，菌株YM1和YM4的解鉀效果最顯著，對難溶性鉀的轉化量分別高達16.65 mg/L和17.4 mg/L；對于IAA的合成能力，菌株YM2、YM4、YM5的合成量均高于28 mg/L，顯著高于YM1和YM3的合成量。綜合以上結果，篩選出菌株YM4為高效的固氮、解磷、解鉀及合成IAA的多功能促生菌。

2.2YM4的菌落形態、生理生化及 16S rDNA分子學鑒定

經平板劃線、革蘭氏染色，觀察菌株培養特征及形態特征，可見YM4菌落小，乳白色，不透明，表面粗糙，邊緣粗糙，不規則桿狀排列，產芽孢（圖2）。生理生化指標見表2。

圖2　菌株YM4的菌落圖

表2　YM4菌株的生理生化特性

利用BLAST對該菌株進行16S rDNA的測序與16個核苷酸序列進行同源性比較，發現菌株YM4 與Bacillus pumilus（AY876289）同源性為95％，運用MEGA 5.0軟件構建菌株YM4的16S rDNA系統發育樹，如圖3所示。并參考該菌株生理生化特征，將菌株YM4分類命名為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus），將其序列上傳至NCBI，獲得登錄號為KP743131。

2.3盆栽試驗結果

在植物根際促生菌促生效應的研究中，促生菌株的實際應用效果尤為重要。因此，本研究通過玉米盆栽試驗對其促生效果進行驗證。如表3所示，與對照相比，接種菌株YM4處理土壤中的IAA、礦質態氮、速效磷含量分別提高了136.36％、42.1％和67.41％，且差異達到極顯著水平，速效鉀含量也增加了14.29％，差異顯著。由此可見，接種菌株YM4對土壤的養分條件進行了優化，可為玉米的良好生長提供幫助。

圖3　YM4菌株16S rRNA基因序列系統發育樹

表3　接種菌株YM4對土壤指標的影響

對盆栽玉米植株根系掃描分析結果（表4）表明，與對照相比，接種過YM4菌液的玉米根系的總長、總面積、總體積以及根尖總數均發生了極顯著變化，其中根長增加了172.2％，根表面積增加了141.7％，根總體積增加了121.1％，根尖也增加了104.5％。土壤中養分的良好供應加上發達的根系，使地上部植株長勢更好。如表5所示，與對照組相比，玉米植株的鮮重、株高、干重分別提高了130.07％、50.65％、120.08％，SPAD（Soil and Plant Analyzer接菌植株的生長狀況均優于對照。Development）值和植株氮、磷、鉀含量也分別提高了51.56％、20.99％、66.33％和38.21％，差異均達到極顯著水平。這說明接種促生菌YM4可以促進玉米根系生長發育，且能夠促進植株地上部的生長，

表4　接種菌株YM4對玉米根系的影響

表5　接種菌株YM4對玉米植株的影響

3　討論

芽孢桿菌是土壤微生態的優勢種群之一，能形成具有較強抗逆能力的芽孢，有益于其在生物有機肥的生產利用及土壤微生態環境中的生存與定殖［20］，在土壤中接種一些PGPR能夠促進土壤中閉蓄態P的溶解釋放，增加土壤中礦質態N、有效P、K的含量，提高養分利用率，有利于植物體對N、P、K的吸收利用［21］，促進植物體地上、地下部的生長發育，如Nosheen等［22］研究發現根際促生菌Azospirillum brasilense和 Azotobacter vinelandii與化學肥料混合施用，能夠促進根系的生長，顯著增加葉面積指數，提高葉綠素含量，替代當前化肥施用量的50％，而不影響當季植物的生長；Habibi等［23］的研究發現從玉米根際土壤中分離出的短小芽孢桿菌能夠顯著地促進水稻的生長。除了能夠促進植株的生長，土壤中PGPR還能夠促進根系的生長，并通過產生植物促生激素如IAA等改變根系的結構，增加根系的根長、根表面積、根總體積、根尖數，如Shrestha等［24］發現實驗室菌株KLF01、KLC02 及KPD03溫室實驗中，能夠產生吲哚乙酸、鐵載體和增溶磷酸鹽，對辣椒的定殖根具有積極的作用，并能夠抑制辣椒的植物細菌性斑點的發生；Yadav等［25］發現也有類似的效果，在鷹嘴豆的溫室試驗中接種根際N-2固氮菌能夠顯著地增加結莢的數目，干物質重及對N、P的吸收，還能夠通過產生植物激素（IAA）刺激根際固氮菌在寄主植株內的生長，從而促進鷹嘴豆的生長，增加鷹嘴豆的產量，趙青云等［26］篩選出的B. subtilis Y-IVI能夠產生鐵載體，吲哚乙酸等促生類物質促進甜瓜和香草蘭的生長。

盆栽試驗結果表明，玉米根際多功能促生菌YM4的促生效應與以上PGPR試驗具有類似的效果。接種菌株YM4能夠提高礦質態N和速效P、K的有效性，增加玉米植株的株高、鮮重、干重和植物體氮磷鉀含量。一般來說，株高是形態指標，它的提高能夠很好地反映出玉米植株具有較好的長勢［27］；植株鮮重、干重等地上生物量的高低反映玉米光合產物積累的大小，是植物生產力的度量［28］；植株氮磷鉀含量則反映出玉米植株的營養狀況［29］。除此之外，實驗中，土壤中IAA含量的極顯著增加對玉米植株根系生長具有重要意義，IAA是植物生長激素的一種，能促進植物生長，特別是促進根系的生長［30］。正如實驗中，接菌植株較對照具有更發達的根系，結合根系形態與養分吸收的關系（肥長苗，瘦長根），從而打破這種關系，既使根得以良好生長，防止植物倒伏，又能將養分運輸到地上部，使地上部長勢良好。氮元素對與植物的葉片顏色影響較大，葉綠素計測量的SPAD值與植物的葉綠素成正比關系，通常使用SPAD值來進行判斷氮肥的施用量［31］，玉米SPAD值與干物質重量具有顯著線性相關關系，在一定程度上能夠預測干物質重量和玉米的產量［32］。接種菌株YM4能夠極顯著地提高SPAD值，說明菌株YM4能夠促進玉米對氮素的吸收利用，與干物質重量的提高保持一致，對后期產量的提高可能具有一定的積極影響。

4　結論

本研究從玉米根際土壤中篩選分離出根際促生菌YM4，結合該菌株的菌落形態及部分生理生化指標，運用基因序列比對方法確定該菌株為短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus），GenBank登錄號為KP743131，搖瓶試驗結果表明該菌株具有較強的固氮解磷解鉀及合成IAA的能力，是一株高效的多功能植物促生菌。盆栽試驗結果表明，該菌株能夠增加土壤中有效態氮磷鉀的含量，提高土壤中IAA含量，從而促進玉米幼苗根系的生長，提高玉米幼苗植株中磷、鉀的含量及葉片SPAD值，該菌株具有玉米專用微生物菌劑的應用潛力。

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（責任編輯 馬鑫）

Screening and Identification of Maize Growth-promoting Rhizobacteria and Its Promoting Effects on Maize

WAN Bing-bing1，2LIU Ye1WU Yue3ZHANG Dong-yan1WANG Guo-wen1JIANG Ying1
（1. College of Resources and Environment，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450000；2. College of Resources and Environment Science，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095；3. Soil and Fertilizer Station of Shandong Province，Ji'nan 250100）

Five maize plant growth-promoting rhizobacteria（PGPR）strains designated as YM1，YM2，YM3，YM4，and YM5 respectively were isolated and purified from the sandy soil. Based on their nitrogenase activity，ability of dissolving phosphorus and potassium，and indole acetic acid（IAA）synthetic quantity，the active microbial inoculum was screened for producing efficient microbial fertilizer. The results of shake flask culture indicated that strain YM4 was observed to have a stronger ability of dissolving phosphorus and potassium，and higher nitrogenase activity accompanied with the strongest synthetic quantity of IAA than other strains. Its nitrogenase activity reached 15.53 nmol C2H4/（h·mL），the transformation amounts of tricalcium phosphate and potassium silicate were 128.90 mg/L，17.40 mg/L respectively，and the synthetic quantity of IAA was 37.18 mg/L. YM4 was identified as Bacillus pumilus based on morphological observation，physiological and biochemical characteristics test and the conserved sequence analysis of 16S rDNA. Compared to the control treatment，pot experiment results suggested that the concentrations of IAA，available nitrogen，phosphorous，and potassium in the potting soil inoculated with YM4 significantly increased by 136.36％，42.1％，67.41％，and 14.29％，respectively；moreover，the morphologies of plant roots changedsignificantly，i.e.，the root length，surface area，root volumes and root tips of maize increased by 172.24％，141.73％，112.14％，and 104.53％，respectively；additionally，the average wet weight，the height of maize，SPAD value increased by 130.07％，150.65％，and 151.56％ and the total N，P，K content of maize significantly increased by 120.99％，166.33％ and 138.21％ respectively. We may conclude that YM4 possess the abilities of efficiently fixing nitrogen，solubilizing phosphorus and potassium，and synthetizing IAA，thus has great application potential in the development and utilization of agricultural production.

plant growth-promoting rhizobacteria；nitrogen fixation；phosphate-solubilizing activity；potassium-solubilizing activity；IAA

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.025

2016-02-02

國家自然科學基金項目（41401274），河南省教育廳項目（15A210012，14B210025），“十二五”農村領域國家科技計劃課題（2012BAD05B0207），鄭州市民生進步科技工程項目（131PCXTD613），河南省科技攻關計劃（國際科技合作）項目（162102410031）

萬兵兵，男，碩士研究生，研究方向：土壤生態學；E-mail：15136200211@163.com

姜瑛，女，博士，研究方向：土壤生態學；E-mail：JY27486@163.com