一種浸礦混合菌種的篩選、鑒定及浸礦的研究

聶毅磊 陳宏 羅立津 賈緯 陳星偉

（福建省微生物研究所 福建省新藥（微生物）篩選重點實驗室，福州 350007）

一種浸礦混合菌種的篩選、鑒定及浸礦的研究

聶毅磊 陳宏 羅立津 賈緯 陳星偉

（福建省微生物研究所 福建省新藥（微生物）篩選重點實驗室，福州 350007）

旨在從某低品位硫化銅礦酸性礦坑水中分離獲得浸礦效果優良的細菌，同時對細菌的浸礦行為進行初步的研究。采集福建某低品位硫化銅礦酸性礦坑水樣品，9K培養基富集獲得混合菌種FIM-201304。利用9K固體平板，從混合菌FIM-201304中分離獲得優勢浸礦菌D-1。應用高通量Illumina Miseq測序技術分析混合菌FIM-201304 的群落結構。通過表型特征和16S rRNA基因序列分析鑒定菌株D-1。采用搖瓶培養對比研究混合菌和單菌對低品位硫化銅礦和低品位硫化鎳礦的浸出效果。結果顯示，高通量測序技術分析結果表明，混合菌FIM-201304 的優勢菌是嗜酸氧化亞鐵硫桿菌（Acidithiobacillus ferrooxidans，A. f errooxidans）（豐度占比85.02％）、銅綠色假單胞菌（Pseudomonas sp.）（豐度占比10.07％）、嗜酸異養菌（Acidiphilium acidophilum，A.acidophilum）（豐度占比1.30％）和鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas sp.）（豐度占比1.21％）。表型特征和16S rRNA 基因序列分析確定菌株D-1屬于氧化亞鐵硫桿菌。搖瓶實驗結果表明，浸出反應20 d后，接種混合菌的浸出體系中銅、鎳浸出率分別為65％和56％，相同條件下，接種單菌的浸出體系中銅、鎳的浸出率為41％和36％，接種混合菌的浸出體系比接種單菌的浸出體系中銅、鎳浸出率分別提高了24％和20％。混合菌對礦石的浸出效果顯著優于單菌。異養菌促進了自養菌對礦石中金屬元素的浸出。

嗜酸氧化亞鐵硫桿菌；生物浸出；混合菌；高通量測序；16S rRNA 基因

生物濕法冶金是利用微生物對礦石進行直接、間接或者兩者共同作用浸出礦石中有用金屬的一種工藝。與傳統冶金技術相比，生物冶金具有成本低、工藝簡單、對環境友好等優點，尤其對于采用傳統的冶金方法難以處理的低品位礦石、原礦和尾礦等，生物冶金更顯其獨特之處［1-5］。生物冶金的核心技術是篩選獲得高效、適應能力強、選擇性好的微生物菌種。

嗜酸氧化亞鐵硫桿菌（Acidithiobacillus ferrooxidans，A. ferrooxidans）被認為是酸性環境中浸礦的主導菌種。但該類微生物生長緩慢，這也是導致生物浸出周期長和浸出效率低的主要原因［6］。研究表明，浸礦微生物的一些代謝產物對其自身的生長具有抑制作用［7，8］。若浸礦體系中含有以有機底物作為能源物質的異養菌，例如嗜酸異養菌（Acidiphilium acidophilum，A. acidophilum），可以在一定程度上解除代謝產物對自養菌的抑制作用，有利于主要自養浸礦菌的生長，充分發揮其浸礦作用，提高浸出率［9，10］。像這種兩類或多類微生物在浸礦過程中相互作用，更好地進行單類種群不能完成或不能高效完成的物質轉化，增強各自的生長代謝活動，從而提高金屬浸出速率和浸出率的微生物作用機制稱為協同作用［11］。微生物協同作用在生物冶金中發揮著重要的作用［12，13］。

本研究從福建某低品位硫化銅礦酸性礦坑水樣品中富集到一種浸礦混合菌種FIM-201301和一株嗜酸氧化亞鐵硫桿菌D-1，分析混合菌種的優勢菌，旨在為開發利用以氧化亞鐵硫桿菌為主的浸礦混合菌種的應用及豐富浸礦微生物協同作用奠定理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1培養基 9K液體培養基：A液：（NH4）2SO43.0 g，K2HPO40.5 g，KCl 0.1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，Ca（NO3）20.01 g，800 mL去離子水溶解，H2SO4調節pH至2.0，121℃高壓滅菌 20 min；B液：FeSO4·7H2O 44.78 g，去離子水200 mL溶解，H2SO4調節pH至2.0，孔徑為0.22 μm的濾膜過濾除菌。將滅菌后的A液與B液混勻后分裝待用。

9K固體培養基：A液：（NH4）2SO41.5 g，KCl 0.1 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，Ca（NO3）20.01 g，KSCN 15.4 g，450 mL去離子水溶解，H2SO4調節pH至3.0，121℃高壓滅菌20 min；B液：FeSO4·7H2O 22.5 g，去離子水50 mL溶解，H2SO4調節pH至2.0，孔徑為0.22 μm的濾膜過濾除菌；C液：瓊脂糖 10 g，500 mL去離子水溶解，121℃高壓滅菌20 min。

待A液和C液冷卻到60-70℃時將A液、B液和C液混合均勻，迅速倒入培養皿中，每個培養皿中倒入10-15 mL，冷卻凝固后即成固體平板。

1.1.2礦石樣 實驗所用硫化銅礦石經過縮分、篩分、破碎與磨碎等流程，礦樣的粒度＜0.075 mm，主要礦物成分為黃銅礦、斑銅礦、黃鐵礦和方鉛礦，銅品位為0.47％。試樣化學組成成分見表1。

表1　硫化銅礦石化學組成分析結果

所用低品位硫化鎳礦為礦樣，礦樣的粒度＜0.075 mm，主要礦物成份為鎳磁黃鐵礦、鎳黃鐵礦和黃銅礦。鎳品位為0.73％。試樣化學組成成分見表2。

表2　硫化鎳礦石化學組成分析結果

1.1.3主要試劑和儀器 所用化學試劑均為分析純。ZHWY-3112B搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）。Miseq/E250高通量測序平臺（美國Illumina公司）。PCR擴增儀（S1000，Bio-Rad公司）。電泳儀（6003EN，上海申能博彩生物科技有限公司）。WFX-120原子吸收分光光度計（北京瑞利分析儀器有限公司）。HH-4恒溫水浴鍋（上海江星儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1樣品采集 細菌樣品采自福建某銅礦礦山酸性礦坑水，取樣時礦坑水溫度27℃，pH≈2.6。將礦坑水移至滅菌容器，容器上方留有一定的空氣，加入少量滅菌的硫酸亞鐵。置于-20℃冰箱保存。

1.2.2菌種分離 將10 mL采集的原始細菌樣品加入到盛有200 mL 9K液體培養基的三角瓶中，30℃，180 r/min 恒溫振蕩培養，直至培養液的顏色呈棕紅色，獲得第一代富集培養物。將第一代富集培養物轉代培養，方法同上，振蕩培養，但細菌接種量要逐代減少。轉代培養10次左右，獲得最終的富集培養物，此時，鏡檢觀察有大量運動細菌存在。取0.2 mL富集培養物劃線培養于9K固體培養基上，30℃培養，挑取優勢單菌落接入9K液體培養基中恒溫振蕩培養，至培養液的顏色呈棕紅色，再劃線于平板固體培養，重復上述操作3次，分離到一株具有Fe2+氧化活性的嗜酸性細菌。將純化菌株保存于9K固體培養基中，待用。

1.2.3菌群總DNA的提取、擴增 取培養72 h的富集培養物，過濾去除黃鉀鐵礬，8 000 r/min離心15 min，傾去上清液，收集菌體，用TENP緩沖液（50 mmol/L Tris，20 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，0.01 g/mL PVP，pH10）洗滌至基本無色，再用PBS緩沖液（8 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4，溶于1 L水中，pH7.4）洗滌菌體2次，去除腐殖質；采用CTAB/NaCl法［14］提取菌群基因組DNA。步驟如下：腐殖質去除后的富集培養物中加入500 mL TE溶液（pH8.0），懸浮，加入60 μL 10％十二烷基硫酸鈉（SDS）和6 μL 10 mg/mL蛋白酶K，混勻，60℃水浴1 h，加2.5 mL 5 mol/L NaCl 和2 mL CTAB/NaCl溶液，65℃水浴10 min，以等體積的苯酚/氯仿/異戊醇、氯仿/異戊醇、各抽提1次，異丙醇沉淀DNA，DNA溶于50 μL TE中，-20℃保存備用。利用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA完整性。采用16S rRNA基因的通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R （5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）對提取的DNA進行PCR擴增。將擴增后的DNA產物送至上海銳翌生物科技有限公司采用高通量Illumina MiSeq測序技術分析微生物群落結構。

1.2.4菌群高通量Illumina MiSeq測序技術分析

1.2.4.1測序與數據處理過濾 對16S rRNA基因V3-V4區序列進行測序，對rawreads按照以下標準進行過濾拼接，得到Long reads：（1）將ambiguous bases＞6的reads過濾掉；（2）將平均質量Q＜25的reads過濾掉；（3）對所有reads切除正反向引物序列；（4）將進行以上三步處理后的序列長度小于200 bp的reads過濾掉。

1.2.4.2OTU聚類 為便于下游物種多樣性分析，將Tags聚類為OTU（Operational Taxonomic Units）。首先把拼接的Tags中的singletons（對應reads只有一條的序列）過濾掉，利用usearch在0.97相似度下進行聚類，對聚類后的序列進行嵌合體過濾后，得到用于物種分類的OTU。

1.2.4.3物種注釋 從各個OTU中挑選出一條序列，作為該OTU的代表序列。將該代表序列，用RDP方法，與已知物種的16S數據庫（GreenGenes，http：//greengenes.lbl.gov）進行比對，從而對每個OTU進行物種歸類。歸類后，根據每個OTU中序列的條數，得到OTU豐度表。

1.2.4.4Profiling 在門、綱、目、科、屬水平，將每個注釋上的物種或OTU在不同樣品中的序列數整理在一張表格，形成profiling柱狀圖及統計表。

1.2.4.5單個樣品復雜度分析 利用QIIME軟件計算樣品的Alpha多樣性值，并利用已測得的16S rRNA序列中已知的各種OTU的相對比例，來計算抽取n個（n小于測得reads序列總數）reads時各Alpha指數的期望值，然后根據一組n值（一般為一組小于總序列數的等差數列）與其相對應的Alpha指數的期望值做出稀釋曲線。

1.2.5純菌株DNA提取、擴增和分析 取培養至對數生長期的菌液，離心收集菌體，同上述方法提取菌株基因組DNA和對提取的DNA進行PCR 擴增。將擴增后的DNA產物送至上海生物工程有限公司進行測序。用BLAST軟件與NCBI的GenBank數據庫收錄的的16S rRNA序列進行比對分析。

1.2.6浸礦實驗 將分離獲得的浸礦混合菌種和單菌分別接入9K培養基中，30℃，180 r/min培養至對數生長期。菌液在8 000 r/min下離心10 min，棄上清液得到沉淀，用pH2.0預先滅過菌的硫酸溶液洗滌沉淀，離心棄除上清液，如此反復操作3次，以達到去除菌液中Fe3+的目的，得到無鐵細胞懸液，在生物顯微鏡下進行計數，調整細胞濃度為1×109cell/mL。取9K培養基（不含Fe2+）180 mL置于500 mL錐形瓶中，稱取20 g礦樣放入錐形瓶中，硫酸調節礦漿pH值，控制初始pH值在1.8-2.0。加入浸礦菌（單菌和混合菌）（5％接種量），30℃，180 r/min震蕩培養。每個條件均包括3組平行實驗，并設無菌空白對照。浸出過程中的酸耗通過10 mol/L的硫酸補充，蒸發損失的水分通過添加蒸餾水補充。浸出20 d后用原子吸收光譜測定浸出液中的目標金屬元素濃度。

2　結果

2.1富集、分離培養

利用9K培養基從酸性礦坑水中獲得最終的富集培養物，將該富集培養物命名為FIM-201304。從固體平板分離獲得一株具有Fe2 +氧化活性的菌株，命名為D-1。光學顯微鏡觀察（圖1）表明，分離純化的菌株D-1具有嗜酸氧化亞鐵硫桿菌的特征，個體形狀為桿狀，兩端鈍圓，以單個、雙個或幾個成短鏈狀存在。

圖1　菌株D-1結晶紫染色形態（100×）

2.2菌群的群落結構分析

2.2.1數據統計 通過Illumina平臺（Miseq）進行Paired-end測序，下機數據經過數據過濾去除低質量reads，數據產出詳細統計結果見表3。

表3　樣品測序數據統計

2.2.2OTU 聚類 將序列完全一樣的HQ reads歸為一種tag，并統計每條tag對應的豐度（即reads數目），然后將tags根據其豐度大小進行排序，考慮到singletons可能由于測序錯誤造成，故將其中的singletons（對應reads只有一條的序列）這部分序列去除，不進行后期OTU（Operational Taxonomic Units）聚類。利用usearch在0.97相似度下進行聚類，對聚類后的序列進行嵌合體過濾后，得到用于物種分類的OTU，最后將所有HQ reads比對到OTU序列上，將能比對上OTU的reads提取出來，得到最終的Clean reads。統計樣品每個OTU中的豐度信息，OTU的豐度初步說明了樣品的物種豐富程度。樣品OTU統計結果見表4。

表4　樣品OTU統計

2.2.3OTU 抽平處理 由于不同樣本對應的reads數量差距較大，為了保證后期分析結果合理，對每個樣本的數據進行隨機抽平處理，每個樣品隨機抽取71 545條reads。抽平后的樣品統計表明OTU數量為215個。

2.2.4物種歸類分析 從各個OTU中挑選出豐度最高的一條序列，作為該OTU的代表序列。使用RDP方法，將該代表序列與已知物種的16S數據庫進行比對，從而對每個OTU進行物種歸類，結果表明共歸屬51個科，141個屬。

2.2.5樣品復雜度分析 Alpha多樣性反映的是單個樣品內部的物種多樣性，包括observed species指數、chao指數、shannon指數、simpson指數以及PD_ whole_tree指數等。反映樣品中群落的豐富度（species richness）的observed species指數和chao指數對應的稀釋曲線（圖2）表明，曲線趨于平緩，可以認為測序深度已經基本覆蓋到樣品中所有的物種。

圖2　Alpha多樣性指數稀釋曲線圖

高通量Illumina Miseq測序技術分析結果（圖3）表明，富集體系FIM-201301中優勢種群主要有嗜酸氧化亞鐵硫桿菌（A. ferrooxidans）（豐度占比85.02％），銅綠色假單胞菌（Pseudomonas sp.）（豐度占比10.07％），嗜酸異養菌（A. acidophilum）（豐度占比1.30％）和鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas sp.）（豐度占比1.21％）。菌株D-1與A. ferrooxidans sp. KCT17，A. ferrooxidans sp. ST2和A. ferrooxidans sp. PS107 的16S rRNA基因序列的相似性均為100％，因而確定D1屬于氧化亞鐵硫桿菌。

圖3　富集體系FIM-201301種群結構豐度占比圖

2.2.6礦石浸出效果 混合菌FIM-201301和單菌D1對低品位硫化銅礦和低品位硫化鎳礦的搖瓶浸出實驗表明，浸出反應20 d后，接種混合菌的浸出體系中銅、鎳浸出率分別為65％和56％，在相同條件下，接種單菌的浸出體系中銅、鎳的浸出率分別為41％和36％。接種混合菌的浸出體系比接種單菌的浸出體系中銅、鎳浸出率分別提高了24％和20％。混合菌對礦石的浸出效果顯著優于單菌，表明異養菌促進了自養菌對礦石中金屬元素的浸出。自養菌和異養菌組成的混合菌通過協同作用，能更好地完成物質轉化，提高各自的生長代謝活動，從而提高金屬浸出率。

3　討論

與傳統微生物多樣性分析手段相比，高通量測序技術具有通量高、讀長長且準確率高等特點，能在測定浸礦微生物群落結構多樣性上檢測到豐度較低的微生物［15］，因而本實驗采用高通量Illumina Miseq測序技術對篩選獲得的混合菌種FIM-201304的群落結構進行分析。后續我們將探討浸礦過程中細菌的群落結構動態變化，為改善生物浸礦工藝提供一定理論依據。

浸礦微生物種類繁多，按不同營養類型可劃分為自養菌和異養菌。目前，在微生物浸礦中研究比較多，在生產中得到應用的主要是氧化亞鐵硫桿菌、氧化硫硫桿菌和氧化亞鐵鉤端螺旋菌等化能自養微生物［16-20］。該類微生物在生長繁殖過程中不需要任何有機營養，完全靠各種礦物鹽生存。但該類微生物生長較為緩慢。浸礦體系中有機物的存在會一定程度上抑制自養菌的生長，尤其是生物浸出后期，微生物代謝產物積累和自身衰亡都會產生較多的有機物，從而抑制自養菌的氧化活性，最終降低金屬浸出效率。研究表明自然環境浸礦體系中自養菌和異養菌往往共同存在［21-23］。異養菌，如A. acidophilum，不僅能夠利用自養菌代謝產生的有機物作為能源，一定程度上消除有機物對自養菌的抑制作用，而且在生長過程中會產生有機酸等代謝物，此類產物的生成對礦石的溶解有重要的作用。自養菌和異養菌的混合菌對有價金屬的浸出率往往高于自養菌單一菌種。Liu等［12］研究了異養菌A. acidophilum 在轉錄水平上對A. ferrooxidans 生長代謝的影響。結果顯示，混合培養時A. ferrooxidans 的指數期延長2 d，細胞數量是純培養的5倍多，培養液中亞鐵離子的濃度增大，與鐵離子氧化有關的基因表達量上調。混合培養時，A. acidophilum激活了A. ferrooxidans 中的鐵離子氧化相關基因及固定CO2的相關基因，對A. ferrooxidans的生長代謝起到了極大的促進作用。Yang等［24］考察了A. ferrooxidans單菌和A. ferrooxidans 與A. acidophilum 的混合菌對低品位銅礦礦石的柱浸效果，結果表明，A. ferrooxidans單菌浸礦體系中銅的浸出率為14.8％，而混合菌浸礦體系中銅的浸出率為20.11％。A. acidophilum 的加入促進了A. ferrooxidans對銅的浸出率。王秀美［25］進行了A. ferrooxidans單獨菌和A. ferrooxidans與A. acidophilum的混合菌對鐵閃鋅礦的浸出行為研究，結果發現混合菌的浸出效果要好于單獨菌，異養菌的加入提高了自養菌的浸礦效率。

目前還未見采用A. ferrooxidans、Pseudomonas sp.、A. acidophilum和 Sphingomonas sp.的混合菌種浸礦的研究報道。該混合菌種是從自然環境中篩選而來，各菌種之間是一個相對穩定和相容的整體，它們通過協同效應在浸礦中發揮作用。下一步我們將對其進行馴化以及浸礦工藝優化的研究，以期更好地提高金屬元素的浸出速率和浸出率。

本實驗為開發利用以氧化亞鐵硫桿菌為主的浸礦混合菌種的應用打下了基礎，同時豐富了浸礦微生物協同作用理論。

4　結論

本實驗從福建某低品位硫化銅礦酸性礦坑水中分離獲得一種浸礦菌群FIM-201304和一株嗜酸氧化亞鐵硫桿菌D-1。菌群FIM-201304的優勢菌是自養型嗜酸氧化亞鐵硫菌和異養型銅綠色假單胞菌、嗜酸異養菌及鞘氨醇單胞菌。采用搖瓶方法對比研究混合菌和嗜酸氧化亞鐵硫桿菌單菌對低品位硫化銅礦和低品位硫化鎳礦的浸出效果。結果表明，接種混合菌的浸出體系比接種單菌的浸出體系中銅、鎳浸出率分別提高了24％和20％。異養菌促進了自養菌對礦石中金屬元素的浸出。

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（責任編輯 馬鑫）

Screening and Identification of Mixed Culture，and Its Bioleaching Capacity

NIE Yi-lei CHEN Hong LUO Li-jin JIA Wei CHEN Xing-wei
（Fujian Institute of Microbiology，Fujian Provincial Key Laboratory of Screening for Novel Microbial Products，Fuzhou 350007）

It is aimed to screen the highly efficient leaching bacteria from acid mining water of low-grade copper sulfide mine，and also preliminarily investigate the bioleaching capacities of the bacteria. Firstly，a mixed culture FIM-201304 was obtained by 9K enrichment from acid mining water of a low-grade copper sulfide mine in Fujian province. Then，one dominated bacterium D-1 was isolated from the FIM-201304 using 9K solid culture medium. Sequencing technology by high-throughput Illumina Miseq was used to analyze the community structure of FIM-201304. D-1 was identified by phenotypic characteristics and 16S rRNA gene sequencing analysis. Flask experiment was utilized to compare the effects of leaching low-grade copper- and nickel-sulfide between the mixed culture FIM-201304 and a single bacterium D-1. Results from high-throughput sequencing analysis showed that the mixed culture FIM-201304 contained the dominated bacteria of Acidithiobacillus ferrooxidans（Abundance accounted for 85.02％），Pseudomonas sp.（Abundance accounted for 10.07％），Acidiphilium acidophilum（Abundance accounted for 1.30％）and Sphingomonas sp.（Abundance accounted for 1.21％）. According to phenotypic characteristics and 16S rRNA gene sequence analysis，strain D-1 was identified as Acidithiobacillus ferrooxidans.The results after 20 days of bioleaching with flasks showed that leaching ratio of copper and nickel by FIM-201304 was 65％ and 56％ respectively，while the leaching ratio by D-1 was 41％ and 36％ under the same conditions，i.e.，the bioleaching ratio of copper and nickel by mixed culture increased 24％ and 20％ compared to that by single bacterium，respectively. Conclusively，the mixed culture resulted in the better leaching effect as heterotrophic bacteria promoted the metalleaching capacity of autotrophic bacteria from the ore.

Acidithiobacillus ferrooxidans；bioleaching；mixed culture；high-throughput sequencing；16S rRNA gene

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.08.026

2015-11-17

福建省科技計劃重點項目（2013Y0017）

聶毅磊，男，碩士，副研究員，研究方向：生物工程；E-mail：nie2050@sina.com

陳宏，碩士，高級工程師，研究方向：環境微生物；E-mail：peaceful88@163.com