遠(yuǎn)紅外Hg2+熒光探針的研制及其在生物成像中的應(yīng)用

吳向陽，朱伯淞，韓志湘，王春柳，梁世偉，陳文卉，崔蘊(yùn)晗

（江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇　鎮(zhèn)江　212013）

遠(yuǎn)紅外Hg2+熒光探針的研制及其在生物成像中的應(yīng)用

吳向陽，朱伯淞，韓志湘，王春柳，梁世偉，陳文卉，崔蘊(yùn)晗

（江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013）

基于Hg2+誘導(dǎo)羅丹明內(nèi)硫酯“關(guān)-開”環(huán)原理，設(shè)計合成了一種簡便的羅丹明101內(nèi)硫酯（1）熒光探針分子并用于環(huán)境水樣中汞離子的定量檢測及活細(xì)胞內(nèi)汞離子熒光成像檢測.結(jié)果表明：在測試體系中加入汞離子，探針分子1（10 μmol/L）溶液熒光顯著增強(qiáng)，當(dāng)加入等當(dāng)量的汞離子時，溶液的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了68倍，溶液的顏色也從無色變?yōu)榱朔奂t色；探針分子1（10 μmol/L）對0.1～10 μmol/L濃度范圍內(nèi)的汞離子響應(yīng)呈線性關(guān)系，R2=0.994 9，檢出限為0.04 μmol/L.選擇性和競爭性實(shí)驗結(jié)果表明：探針分子1對汞離子有較高的選擇性和較高的靈敏度；探針分子1可成功用于細(xì)胞內(nèi)汞離子的熒光成像可視化檢測.

遠(yuǎn)紅外；熒光探針；羅丹明101內(nèi)硫酯；Hg2+；熒光成像；生物成像

汞離子是一類痕量存在即可對人畜造成嚴(yán)重危害的高毒元素，可以造成大腦、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)甚至是腎臟的損傷［1-2］.因此，開發(fā)一種經(jīng)濟(jì)、快速、簡便的Hg2+檢測方法并應(yīng)用于環(huán)境和生物樣品中Hg2+的檢測具有重要的意義.與傳統(tǒng)技術(shù)相比，熒光探針技術(shù)具有高靈敏性、高選擇性和快速分析的特點(diǎn)，尤其是其可利用熒光成像技術(shù)實(shí)現(xiàn)生物體內(nèi)分析物的可視化檢測［3-5］.

羅丹明類染料因其杰出的光譜性質(zhì)，如大的摩爾消光系數(shù)、高的熒光量子產(chǎn)率、良好的光學(xué)穩(wěn)定性和長波長處的激發(fā)和發(fā)射，而被廣泛應(yīng)用在激光染料、熒光標(biāo)記等生物研究中［6-7］.更重要的是，具有螺環(huán)結(jié)構(gòu)的羅丹明衍生物因在可見光區(qū)無激發(fā)和發(fā)射而具有在生物應(yīng)用中提供零熒光背景的可能；而其開環(huán)結(jié)構(gòu)在大于500 nm處具有很強(qiáng)的吸收和熒光發(fā)射［8］.自從1997年Czarnik率先利用羅丹明的這種“關(guān)-開”環(huán)前后光學(xué)性質(zhì)發(fā)生顯著差異的性質(zhì)設(shè)計出檢測Cu2+的熒光探針以來，基于該機(jī)理而發(fā)展出來的熒光探針方興未艾［9-12］.

利用Hg2+的親硫性和硫原子的親核性，羅丹明B內(nèi)硫酯和羅丹明6G內(nèi)硫酯及其衍生物被用來檢測Hg2+，并表現(xiàn)出很好的選擇性和靈敏度［13-15］.與羅丹明B和羅丹明6G相比，羅丹明101的最大發(fā)射波長達(dá)到了遠(yuǎn)紅外區(qū)（＞600 nm），在此區(qū)域可有效避免生物分子體內(nèi)自身的背景熒光干擾，更適合于生物樣品中Hg2+熒光成像檢測.目前，僅有幾個羅丹明101的Cu2+、Zn2+和HOCl熒光探針報道［16-19］，而識別Hg2+的羅丹明101熒光探針未見報道.鑒于此，本文設(shè)計、合成了羅丹明101內(nèi)硫酯（化合物1）并成功用于活細(xì)胞內(nèi)Hg2+熒光成像可視化檢測.

1　實(shí)驗部分

1.1實(shí)驗試劑與儀器

所用試劑包括：1，2-二氯乙烷、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、乙酸乙酯、二氯甲烷、硫化鈉、無水硫酸鎂，均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；100-200目柱層析硅膠，青島海洋化工有限公司產(chǎn)品；無水1，2-二氯乙烷，加入氫化鈣回流后蒸餾得到；其它溶劑不經(jīng)純化直接使用；實(shí)驗過程用水均為二次蒸餾水.

所用儀器包括：Lumina型熒光分光光度計，美國Thermo fisher scientific公司產(chǎn)品；UV-2400型紫外-可見分光光度計，日本島津公司產(chǎn)品；INOVA-400型核磁共振儀，美國Varian公司產(chǎn)品；PB-10型精密pH計，德國Sartorius公司產(chǎn)品；AxioObserverA1型倒置熒光顯微鏡，德國CarlZeiss公司產(chǎn)品.

1.2羅丹明101內(nèi)硫酯（化合物1）的合成

化合物1的合成路線如圖1所示.在25 mL圓底燒瓶中，將122 mg（0.25 mmol）羅丹明101溶解于5 mL 1，2-二氯乙烷中，逐滴加入0.5 mL三氯氧磷（不少于5min）.回流反應(yīng)4h后，冷卻至室溫.旋除溶劑，加入3 mL飽和Na2S溶液，室溫下攪拌過夜.反應(yīng)后溶液用乙酸乙酯多次萃取，無水硫酸鎂干燥，過濾.旋除溶劑得到的粗產(chǎn)物以硅膠柱柱層析（二氯甲烷為淋洗劑）分離，得到淡黃色固體53 mg，產(chǎn)率為41.9%.

圖1　化合物1的合成路線Fig.1　Synthesis routine of compound 1

1.3性能測試與表征

（1）熒光光譜測量：汞離子標(biāo)準(zhǔn)溶液由pH=7.40 Tris-HCl緩沖溶液逐級稀釋10 mmol/L HgCl2儲備液得到.將1.0 mL 20 μmol/L的探針分子1溶液分別和1.0 mL 0.2～40 μmol/L的汞離子標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，此時測試體系中探針分子1的濃度為10 μmol/L，汞離子濃度為0.1～20 μmol/L.使用熒光分光光度計在激發(fā)波長為550 nm、激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為5 nm的條件下記錄565～750 nm范圍內(nèi)上述溶液的熒光發(fā)射光譜強(qiáng)度變化.

（2）紫外光譜測量：使用紫外可見分光光度計對（1）中混合溶液在300～660 nm范圍內(nèi)進(jìn)行波長掃描，得到紫外吸收曲線.

（3）酸堿耐受性實(shí)驗：分別用pH 3～9的緩沖溶液稀釋汞離子儲備液至20 μmol/L.將1.0 mL 20 μmol/ L的探針分子1溶液和1.0 mL上述用不同pH值緩沖溶液稀釋的汞離子標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，測定溶液的熒光強(qiáng)度，得出pH對探針響應(yīng)的影響曲線.探針分子1自身酸堿耐受性實(shí)驗中只加入不同pH值的緩沖溶液，不加入汞離子進(jìn)行測量.

（4）響應(yīng)時間實(shí)驗：使用熒光分光光度計，TimeS-can模式下設(shè)置激發(fā)波長為550 nm，掃描時間間隔為30 s，測定1.0 mL 20 μmol/L探針分子1溶液中加入1.0 mL 20 μmol/L汞離子標(biāo)準(zhǔn)溶液后在發(fā)射波長620 nm處熒光強(qiáng)度隨時間變化的曲線.

（5）選擇性實(shí)驗：在1.0 mL 20 μmol/L探針分子1溶液中分別加入1.0 mL 20 μmol/L的不同金屬離子溶液，測定發(fā)射波長為620 nm處的熒光強(qiáng)度.

（6）競爭性實(shí)驗：在1.0 mL 20 μmol/L探針分子1溶液中加入0.5 mL 40 μmol/L的除汞離子外的金屬離子溶液，然后再加入0.5 mL 40 μmol/L的汞離子，測定發(fā)射波長為620 nm處的熒光強(qiáng)度.

（7）細(xì)胞成像試驗：肝癌細(xì)胞（Humanhepatoma G2，HepG2）培養(yǎng)借鑒于美國標(biāo)準(zhǔn)菌庫ATCCHB-8065，通過含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清（FBS）的完全培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng).使用倒置熒光顯微鏡拍攝加入汞離子前后的細(xì)胞熒光成像.

2 　結(jié)果與討論

2.1化合物1的合成與表征

化合物1由羅丹明101首先在POCl3作用下生成羅丹明101酰氯；然后不經(jīng)任何處理，直接與硫化鈉飽和溶液發(fā)生關(guān)環(huán)反應(yīng)即可得到.該方法合成步驟簡單、目標(biāo)化合物產(chǎn)率高.其1HNMR、13CNMR及MS表征如下：

2.2光譜性質(zhì)

圖2所示為探針分子1（10 μmol/L）在測試體系中對0，0.1，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20 μmol/L Hg2+響應(yīng)的熒光光譜圖.

圖2　探針分子1對Hg2+響應(yīng)的熒光光譜Fig.2　Fluorescence spectra of probe 1 response to Hg2+

由圖2可知，加入Hg2+之前，測試體系中探針分子1自身熒光強(qiáng)度較弱；加入Hg2+之后，體系隨著Hg2+濃度的增加，其熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng).這表明Hg2+的加入誘導(dǎo)了探針分子1發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，從而增大了體系的共軛，使得體系熒光明顯增強(qiáng).當(dāng)加入等當(dāng)量的汞離子（10 μmol/L）時，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)的倍數(shù)達(dá)68倍；但繼續(xù)增加汞離子濃度，熒光增強(qiáng)的數(shù)值F/F0上升不明顯.探針分子1（10 μmol/L）對0.1～10 μmol/L濃度范圍內(nèi)的汞離子響應(yīng)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系（R2=0.994 9），檢出限為0.04 μmol/L.同時還可觀察到溶液熒光發(fā)生明顯改變，由無熒光變?yōu)殚冱S色強(qiáng)熒光.

圖3所示為探針分子1（10 μmol/L）與0，0.1，0.5，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20 μmol/L汞離子反應(yīng)后的紫外-可見吸收光譜圖.

圖3　探針分子對汞離子響應(yīng)的紫外光譜Fig.3　UV spectra of probe 1 response to Hg2+

由圖3可以看出，探針分子1本身在大于500 nm處幾乎無吸收；隨著汞離子加入，吸收光譜發(fā)生顯著的改變，在584 nm處出現(xiàn)一個新的吸收峰且隨著汞離子濃度上升逐漸增強(qiáng)，說明探針分子1在Hg2+加入后誘導(dǎo)了羅丹明101內(nèi)硫酯的開環(huán).同時溶液的顏色由無色變?yōu)樽霞t色.

在測試體系中固定探針分子1和Hg2+的總濃度為20 μmol/L，通過連續(xù)改變二者之間的摩爾比，繪出Job’s plot曲線，如圖4（a）所示.可以看出，二者之間的摩爾比為0.5時，吸收強(qiáng)度最大，表明汞離子與探針分子1之間的絡(luò)合比為1∶1.同時，探針分子1與汞離子結(jié)合后的產(chǎn)物通過ESI質(zhì)譜分析得到了一個743.32的質(zhì)荷比信號，對應(yīng)于［1+HgCl］+的質(zhì)荷比.基于以上實(shí)驗結(jié)果，本文提出了探針分子1與汞離子的可能結(jié)合模式如圖4（b）所示.

圖4　探針分子1和Hg2+的Job′s plot曲線及其可能結(jié)合方式Fig.4　Job′s plot curve and proposed binding model of probe 1 with Hg2+

2.3pH影響

探針分子的酸堿耐受性是熒光探針性能的一個重要指標(biāo).在測試體系中，考察了探針分子1（10 μmol/ L）加汞前后在pH=3~9范圍內(nèi)的熒光性能，結(jié)果如圖5所示.

圖5　　pH對探針響應(yīng)Hg2+的影響Fig.5　Effect of pH on response to Hg2+of probe 1

由圖5可以看出，在620 nm處，探針分子1本身在pH=4~8范圍內(nèi)不受pH影響，而加入10 μmol/L Hg2+后，其在pH=5~8范圍內(nèi)不受pH變化的影響，表明該探針工作pH范圍較寬且可以在生理pH范圍內(nèi)檢測Hg2+，具有應(yīng)用在生物系統(tǒng)內(nèi)的潛力.

2.4響應(yīng)時間

圖6所示為探針分子1對Hg2+的時間響應(yīng)曲線.

圖6　探針分子與Hg2+響應(yīng)的時間曲線Fig.6　Time dependent fluorescence intensity changes of probe 1 in prescence of Hg2+

由圖6可以看出，探針分子1對Hg2+表現(xiàn)出了快速響應(yīng)的能力（小于30 s），說明探針分子1對汞離子具有極高的靈敏度.

2.5選擇性

選擇性優(yōu)劣也是熒光探針很重要的一個指標(biāo).固定汞離子和其他金屬離子的濃度均為10 μmol/L，分別考察了探針分子1對Hg2+和其他金屬離子的響應(yīng)識別效果，如圖7所示.由圖7可見，只有加入Hg2+時，探針分子1的熒光強(qiáng)度有顯著增強(qiáng)（68倍）.Ag+的加入只能引起溶液熒光強(qiáng)度的微弱增強(qiáng)（小于3倍）.這表明探針分子1對汞離子具有很好的選擇性.

競爭性實(shí)驗被用于研究探針分子1對汞離子響應(yīng)的實(shí)際應(yīng)用可能性，結(jié)果如圖8所示.

圖7　探針分子1對不同金屬離子的選擇性Fig.7　Fluorescence responses of probe 1 to selected metal ions

圖8　探針分子1在不同金屬離子存在下對汞離子的響應(yīng)（競爭性實(shí)驗）Fig.8　Fluorescence response of probe 1 to Hg2+in prescence of other metal ions（competitive experiments）

由圖8可以看出，在10 μmol/L其他金屬離子存在的探針分子1（10 μmol/L）溶液中分別加入10 μmol/L Hg2+，均不影響汞離子的檢測.以上結(jié)果均表明，本文設(shè)計的探針分子1對Hg2+具有非常顯著的選擇性，符合環(huán)境和生物中應(yīng)用的要求.

2.6汞離子的細(xì)胞內(nèi)熒光成像

為進(jìn)一步研究探針1在生物成像中的應(yīng)用，對細(xì)胞內(nèi)Hg2+的熒光成像使用倒置顯微鏡拍照，如圖9所示.

圖9　HepG2細(xì)胞中，探針分子1與汞離子結(jié)合前后的成像圖Fig.9　Images of Hg2+in HepG2 cells with probe 1

圖9（a）為明場觀察到的HepG2細(xì)胞形態(tài)，首先用10 μmol/L探針分子1在37℃孵育30 min，熒光倒置成像顯微鏡幾乎觀察不到任何熒光，如圖9（b）所示；但當(dāng)其再與10 μmol/L HgCl2在PBS中孵育30 min后，可以觀察到非常強(qiáng)的熒光，如圖9（c）所示.從圖中可以看出細(xì)胞形態(tài)完好，表明探針毒性小，對細(xì)胞無損傷.這表明熒光探針分子1可以用于活細(xì)胞內(nèi)Hg2+的可視化檢測.

3 結(jié)論

通過“一鍋煮”方法簡便合成了羅丹明101內(nèi)硫酯（探針分子1），并利用核磁共振氫譜（1H NMR）、核磁共振碳譜（13C NMR）和電噴霧離子源質(zhì)譜（ESI-MS）對其進(jìn)行了表征，考察了該化合物對汞離子識別的熒光、紫外性質(zhì)、pH影響、選擇性、靈敏度及活細(xì)胞內(nèi)熒光成像，研究表明：

（1）探針分子1對Hg2+響應(yīng)識別的線性濃度范圍寬（0.1～10 μmol/L），檢出限低（0.04 μmol/L）.

（2）加入Hg2+前后探針分子1溶液顏色變化明顯（無色到紫紅色），可以實(shí)現(xiàn)“裸眼”檢測.

（3）探針分子1對Hg2+選擇性好、熒光增強(qiáng)倍數(shù)大（68倍），響應(yīng)速度快（小于30 s）.

（4）探針分子1與Hg2+結(jié)合的化學(xué)計量比為1∶1，二者反應(yīng)后形成了1-HgCl絡(luò)合物，質(zhì)譜驗證了該結(jié)合模式.

（5）探針分子1對Hg2+識別酸堿耐受性強(qiáng)（pH為5～8），應(yīng)用前景好.

（6）結(jié)合熒光成像技術(shù)，探針分子1可用于肝癌細(xì)胞中Hg2+可視化檢測.

［1］CLARKSON T W，MAGOS L，MYERS G J.The toxicology of mercury-current exposures and clinical manifestations［J］.New Engl Med，2003，349：1731-1737.

［2］EMSLEY J.In Nature′s Building Blocks：An A-Z Guide to The Elements［M］.Oxford：Oxford University Press，2001.

［3］NOLAN E M，LIPPARD S J.Tools and tactics for the optical detection of mercuric ion［J］.Chem Rev，2008，108：3443-3480.

［4］MAHATO P，SAHA S，DAS P，et al.An overview of the recent developments on Hg2+recognition［J］.RSC Adv，2014，4 （68）：36140-36174.

［5］SRIVASTAVA P，RAZI S S，ALI R，et al.Selective nakedeye detection of Hg2+through an efficient turn-on photo induced electron transfer fluorescent probe and its real applications［J］.Anal Chem，2014，86：8693-8699.

［6］ZOLLINGER H.Color Chemistry：Syntheses，Properties，and Applications of Organic Dyes and Pigments［M］.2nded.VCH：Wein-heim，1991.

［7］ HAUGLAND R P.Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals［M］.9th ed.Eugene：Molecular Probes，2002.

［8］DUJOLS V，F(xiàn)ORD F，CZARNIK A W.Long-wavelength fluorescent chemodosimeter selective for Cu（II）ion inwater［J］.Am Chem Soc，1997，119：7386-7387.

［9］ CHEN X Q，PRADHAN T，WANG F，et al.Fluorescent chemosensors based on spiroring-opening of xanthenes and relatedderivatives［J］.Chem Rev，2012，112：1910-1956.

［10］HAN Z X，ZHU B S，WU T L，et al.A fluorescent probe for Hg2+sensing in solutions and living cells with a wide working pH range［J］.Chin Chem，Lett，2014，25：73-76.

［11］YANG X H，LI S，TANG Z S，et al.A simple，water-soluble，F(xiàn)e3+-selective fluorescent probe and its application in bioimaging［J］.Chin Chem，Lett，2015，26：129-132.

［12］ZHOU L Y，WANG Q Q，ZHANG X B，et al.Through-bond energy transfer-based ratiometric two-photon probe for fluorescent imaging of Pd2+ions in living cells and tissues［J］.Anal Chem，2015，87：4503-4507.

［13］SHI W，MA H M.Rhodamine B thiolactone：A simple chemosensor for Hg2+in aqueous media［J］.Chem Commun，2008，16：1856-1858.

［14］ZHAN X Q，QIAN Z H，ZHENG H，et al.Rhodamine thiospirolactone：Highly selective and sensitive reversible sensing of Hg（II）［J］.Chem Commun，2008，16：1859-1861.

［15］CHEN X Q，NAM S W，JOU M J，et al.Hg2+selective fluorescent and colorimetric sensor：Its crystal structure and application to bioimaging［J］.Org Lett，2008，10：5235-5238.

［16］SASAKI H，HANAOKA K，URANO Y，et al.Design and synthesis of anovel fluorescence probe for Zn2+based on the spirolactam ring-opening process of rhodamine derivatives［J］. Bioorg Med Chem，2011，19：1072-1078.

［17］XIE P H，GUO F Q，LI D，et al.A Cu2+chemodosimeter based on amplified fluorescence in the red region［J］.Lumin，2011，131：104-108.

［18］SREENATH K，CLARK R J，ZHU L.Tricolor emission of a fluorescent heteroditopic ligand over a concentration gradient of zinc（ii）ions［J］.Org Chem，2012，77：8268-8279.

［19］CHEN X Q，LEE K A，HA E M，et al.A specific and sensitive method for detection of hypochlorous acid for the imaging ofmicrobe-inducedHOClproduction［J］.Chem Commun，2011，15：4373-4375.

Preparation of far-red fluorescence probe for Hg2+and its application to bioimaging

WU Xiang-yang，ZHU Bo-song，HAN Zhi-xiang，WANG Chun-liu，LIANG Shi-wei，CHEN Wen-hui，CUI Yun-han
（School of Environment and Safety Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，Jiangsu Province，China）

A facile probe 1（rhodamine 101 thiolactone）was synthesized，and applied to quantitatively detect the level of Hg2+in aqueous media and visualize its distribution in living cells via Hg2+-induced thiospirolactone ring-opening mechanism.The results show that probe 1 shows significant fluorescence enhancement，and reaches almost 68-fold when 1.0 equiv Hg2+was added to the test solution.In the meanwhile，the color of the test solution changes from colorless to pink.The proposed probe can be applied to monitor the level of Hg2+with a linear range covering from 0.1 to 10 μmol/L（R2=0.994 9）and the detection limit is 0.04 μmol/L.Selective and competitive experiments both suggested that probe 1 can detect Hg2+with high selectivity and sensitivity in comparison with other cations.Finally，the probe was successfully employed to visually detect Hg2+in living cells with the aids of fluorescent imaging technique.

far-red；fluorescent probe；rhodamine 101 thiolactone；Hg2+；fluorescent imaging；bioimaging

X820

A

1671-024（2016）04-0034-05

10.3969/j.issn.1671-024x.2016.04.005