樹鼩CD4蛋白多克隆抗體的制備及檢測

盧孔杰， 徐婧雯， 張雪梅， 吳忠香， 任芳芳，馬 娜， 鞏 蔚， 嚴麗蔚， 朱文兵， 董少忠（中國醫學科學院/北京協和醫學院醫學生物學研究所，云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室， 昆明 650118）

·論 著·

樹鼩CD4蛋白多克隆抗體的制備及檢測

盧孔杰， 徐婧雯， 張雪梅， 吳忠香， 任芳芳，馬 娜， 鞏 蔚， 嚴麗蔚， 朱文兵， 董少忠
（中國醫學科學院/北京協和醫學院醫學生物學研究所，云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室， 昆明 650118）

目的 原核表達、純化樹鼩CD4蛋白并制備多克隆抗體，檢測樹鼩體內的CD4蛋白。方法 克隆樹鼩CD4基因并連接到表達載體，構建重組質粒pET30a（+）-CD4和pGEX-5X-1-CD4，表達并純化重組蛋白His-CD4和GST-CD4，用不同佐劑［弗氏佐劑、MF59和Al（OH）3］制備多抗，用Western blot法檢測血清抗體特異性。 結果 蛋白表達產物His-CD4和GST-CD4的相對分子質量分別約為53.5×103和70.0×103， 純化后蛋白濃度分別為600 μg/mL和1 mg/mL； 三組佐劑均能誘導產生抗體，抗體幾何平均滴度（Geometric Mean Titer， GMT）的比較結果為： 弗氏佐劑組（GMT：97 420）＞Al（OH）3佐劑組（GMT： 67 202）＞MF59佐劑組（GMT： 55 128）； 其中弗氏佐劑組顯著高于原蛋白組（P＜0.001）； Al（OH）3組顯著高于原蛋白組（P＜0.01）； 而MF59組顯著高于原蛋白組（P＜0.05）。結論 制備了特異性良好的小鼠抗血清，能夠特異性地結合樹鼩的CD4蛋白。為下一步本實驗室制備CD4單克隆抗體、CD4蛋白分子的功能研究以及樹鼩的病毒感染模型等免疫相關實驗的進行提供了基礎。

樹鼩； CD4蛋白； 表達； 純化； 多克隆抗體

樹鼩（Tree shrew，Tupaia belangeri）是一種生活在東南亞各國，外形酷似松鼠的哺乳綱攀鼩目樹鼩科小型動物［1］。近幾年，樹鼩在肝炎病毒、腸道病毒71型、輪狀病毒以及流感病毒等疾病病毒感染的動物模型中正被逐漸地重視［2，3］。

在機體的整個免疫系統中，白細胞分化抗原4（cluster of differentiation 4， CD4）分子起著重要作用。CD4分子主要表達于輔助性T淋巴細胞（T helper cells， Th）的細胞膜上，其胞外區識別、結合主要組織相容性復合體II類分子（major histocompatibility complex class II，MHCII），增強T細胞抗原受體（T cell receptor，TCR）與MHCII類分子結合的穩定性；胞內區含有酪氨酸蛋白激酶，增強白細胞分化抗原3（cluster of differentiation 3，CD3）轉導的活化信號。同時C D 4分子是人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus， HIV）識別的靶點，HIV通過結合CD4分子侵入CD4+Th細胞，造成免疫系統功能損傷［4-6］。

關于人的CD4蛋白的基本分子特征已被詳盡了解，同時相應的CD4蛋白的多克隆抗體和單克隆抗體已商業化并得到廣泛應用。樹鼩作為眾多疾病的研究模型，關于樹鼩CD4分子的信息鮮有報道，故本文以該CD4分子為切入點，將數據庫中理論的CD4序列進行了克隆，同時表達和純化了樹鼩CD4蛋白， 驗證了數據庫中的序列。這對后續樹鼩CD4蛋白結構功能的研究， 以及驗證是否與人的CD4蛋白有一樣的功能提供了重要的基礎。同時。本實驗用不同佐劑跟CD4蛋白組合免疫BALB/c小鼠，制備多克隆抗體，并對各組血清抗體效價進行統計來比較不同佐劑對CD4蛋白誘導的抗原特異性體液免疫應答的增強效應。CD4蛋白多克隆抗體的制備為后續單克隆的制備，CD4+T淋巴細胞的分選以及CD4分子檢測提供了很大的幫助。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及質粒 大腸埃希菌BL21、BL21（DE3）、原核表達載體pGEX-5X-1和pET30a（+）由中國科學院醫學生物學研究所保存。

1.1.2 主要試劑 RNA逆轉錄試劑盒Prime Script 1st Strand cDNA Synthesis Kit、ExTaq DNA 聚合酶、限制性內切酶EcoRI-HF、XhoI、T4 DNA連接酶和DNA marker均購自寶生物工程（大連）有限公司； Fast Start High Fidelity PCR System，dNTPack 購自昆明滇工科技有限公司； 植物血球凝集素（phytohaemagglutinin， PHA）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和二硫蘇糖醇（DTT）均購自美國Sigma公司； Glutathione Sepharose 4 Fast Flow和His trap FF 購自美國GE公司； HRP標記的山羊抗小鼠二抗購自美國Pierce公司； 酵母粉、胰蛋白胨、NaCl等均為國產試劑。

1.1.3 實驗動物 清潔級BALB/c小鼠來源于中國醫學科學院醫學生物學研究所（花紅洞）［SYXK（滇）K2013-0008］；樹鼩來源于醫學生物學研究所樹鼩種質資源中心［SCXK（滇）K2013-0001］。其中BALB/c小鼠為6～8周齡雌性小鼠， 體質量18～20 g。并分成5組， 每組7只： 對照組、MF59佐劑組、Al（OH）3鋁佐劑組、原蛋白組（不加佐劑）、弗氏佐劑組。所有實驗動物按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2 方法

1.2.1 樹鼩CD4目的片段的獲取 根據NCBI中已有樹鼩 CD4 序列 （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/ nuccore/JN657224.1），利用Signal P 4.1 Server 進行CD4信號肽的預測，獲得不含有信號肽序列的CD4序列，并設計包含質粒［pGEX-5X-1和pET30a （+）］的EcoRI和XhoI酶切位點引物，序列如下：上游引物： 5'-CCGGAATTCAAGGAGGTCGTACTGAGCAGA-3'； 下游引物： 5'-CCGCTCGAGTCACATGAGACTACATGTCTTCTGAA-3'。采集樹鼩外周血1 mL， 分離外周血單核淋巴細胞，經PHA刺激24 h后，Trizol 法提取細胞總RNA，反轉錄合成cDNA，以其為模板進行PCR擴增。PCR產物經TA克隆插入 pMD-19T載體后，轉化大腸埃希菌DH5α感受態細胞，提取質粒進行雙酶切鑒定，并送公司進行雙向測序。

1.2.2 兩種重組表達質粒的構建 用EcoRI和XhoI分別雙酶切上述測序正確質粒、質粒pGEX-5X-1 和pET30a（+），回收目的基因片段和載體片段，分別以T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜。將連接產物分別轉化至大腸埃希菌DH5α感受態細胞，提取質粒進行雙酶切鑒定并測序。測序結果正確的質粒分別命名為pGEX-5X-1-CD4和pET30a-CD4。

1.2.3 目的基因的誘導表達 將測序正確的質粒pGEX-5X-1-CD4和pET30a（+）-CD4分別轉化至大腸埃希菌BL21和BL21（DE3）感受態中，分別在氨芐和卡那霉素培養平板上培養。隨機挑取單菌落，接種于3 mL LB培養基中，37 ℃振蕩培養過夜； 次日， 分別按1∶50和1∶100的比例接種于10 mL LB液體培養基中，培養至A600： 0.4～0.6，加入終濃度1.0 mmol/L IPTG， 20 ℃誘導3 h（pGEX-5X-1-CD4）和37 ℃誘導3 h（pET30a（+）-CD4），離心，收集菌體，超聲破碎，用質量分數12%的SDS-PAGE分析目的蛋白表達情況。

1.2.4 重組蛋白的純化

1.2.4.1 GST-CD4 重組蛋白的純化 20 ℃， 220 r/min，誘導3 h后，收集菌體，超聲破碎，離心取上清，0.45 μm過濾上清， 上柱（Glutathione Sepharose 4 Fast Flow）結合，再用谷胱甘肽洗脫液洗脫目的蛋白，收集洗脫液，用超濾管換液濃縮，測濃度并取樣進行SDS-PAGE分析。

1.2.4.2 His-CD4 重組蛋白的純化 37 ℃， 220 r/min，誘導3 h后，收集菌體，超聲破碎，離心取沉淀，2 mol/L尿素清洗包涵體，利用8 mol/L尿素變性，離心取上清， 0.45 μm過濾上清， 上柱His trap FF結合， 用咪唑梯度洗脫目的片段， 收集洗脫液， 用超濾管換液濃縮，測濃度并取樣進行SDS-PAGE分析。

1.2.5 小鼠抗CD4血清的制備

1.2.5.1 動物免疫 BALB/c小鼠隨機分成5組：對照組、MF59佐劑組、Al（OH）3鋁佐劑組、原蛋白組（不加佐劑）、弗氏佐劑組， 每組7只。以融合蛋白GST-CD4作為免疫原， 免疫劑量為20 μg/只，重組蛋白溶液與佐劑體積為1∶1。MF59佐劑組采用肌肉注射，其余組均采用背部皮下注射，分別于第0、2、4周免疫小鼠，每次免疫后2周，經尾部取血，分離血清，檢測血清效價。

1.2.5.2 血清抗體效價的檢測 采用間接ELISA法， 用融合蛋白His-CD4包被酶標板，每孔100 μL，每孔66 ng蛋白，4 ℃過夜；用BSA室溫封閉1 h；加入梯度稀釋的抗血清，室溫作用1 h； 加入HRP標記的山羊抗鼠IgG （1∶5 000稀釋）； 加顯色液、終止液，酶標儀檢測A450值。

1.2.5.3 血清抗體特異性的檢測 采用Western blot法： GST-CD4、His-CD4、GST標簽蛋白、樹鼩淋巴細胞樣品、獼猴淋巴細胞樣品、人淋巴細胞樣品、大鼠淋巴細胞樣品和小鼠淋巴細胞樣品分別經SDS-PAGE分離后， 電轉移至聚偏氟乙烯（Polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，以制備的抗血清為一抗（1∶2 000稀釋）， HRP標記的山羊抗鼠IgG （1∶5 000稀釋）為二抗進行檢測，并設定β-actin （一抗比例1∶1 000，二抗比例1∶5 000）為內參。

2 結果

2.1 目的片段的獲取及其兩種重組表達質粒的鑒定

如圖1A、B、C所示，目的片段的擴增（泳道1）、兩種重組表達質粒pGEX-5X-1-CD4雙酶切產物（泳道2）和pET30a（+）-CD4雙酶切產物（泳道3）經瓊脂糖凝膠電泳分析，均可見約1 290 bp的特異片段，大小均與預期相符。

2.2 表達產物的鑒定

SDS-PAGE分析顯示，如圖2-A所示，pGEX-5X-1-CD4/BL21誘導表達的重組蛋白GST-CD4可在上清中可溶性表達（3、5、7、9、11分別對應誘導后1 h、2 h、3 h、4 h、5 h菌體超聲上清；4、6、8、10、12分別對應誘導后1 h、2 h、3 h、4 h、5 h菌體超聲沉淀）， 并且GST-CD4蛋白的相對分子質量（Mr）約為70.0×103。如圖2-B所示，pET30a（+）-CD4/BL21 （DE3）誘導表達的重組蛋白His-CD4以包涵體形式存在（16、18、20、22分別對應誘導后2 h、3 h、4 h、6 h菌體超聲沉淀； 15、17、19、21分別對應誘導后2 h、3 h、4 h、6 h菌體超聲上清），并且His-CD4蛋白相對分子質量約為53.5×103，大小與預期相符。

2.3 純化產物的鑒定

如圖3所示，SDS-PAGE分析顯示，純化的重組蛋白His-CD4 （泳道1）和重組蛋白GST-CD4（泳道2）相對分子質量分別約為53.5×103和70.0×103，純化的His-CD4和GST-CD4重組蛋白大小與預期相符。

2.4 小鼠抗CD4血清的鑒定

圖1 CD4目的片段的PCR產物以及載體雙酶切 （EcoRI/XhoI） 鑒定Figure 1 The PCR products of CD4 and double enzyme digestion analysis of recombinant plasmid （EcoRI/XhoI）

2.4.1 血清抗體效價 每次免疫后2周，經尾部取血進行效價的檢測； 而在飼養過程中，原蛋白組（不加佐劑）有2只小鼠死亡，其余各組均為7只。間接ELISA法檢測結果顯示， 3次免疫后， 各組佐劑與CD4蛋白組合免疫小鼠所得到的抗CD4血清抗體效價達到了較高水平（圖4）。而在各組CD4抗血清效價的結果比較中， 弗氏佐劑組的抗血清效價極顯著高于原蛋白組的抗血清效價（P＜0.001）； Al（OH）3組的抗血清效價極顯著高于原蛋白組的抗血清效價（P＜0.01）；而MF59組的抗血清效價顯著高于原蛋白組（Protein）的抗血清效價（P＜0.05），見圖4。而三種佐劑的抗血清幾何平均滴度比較結果為： 弗氏佐劑組（GMT：97 420）＞Al（OH）3佐劑組（GMT： 67 202）＞MF59佐劑組（GMT： 55 128）。

圖2 誘導表達產物的SDS-PAGE分析Figure 2 SDS-PAGE profile of induced expression product

圖3 純化產物的SDS-PAGE分析Figure 3 SDS-PAGE profile of purified His-CD4 and GST-CD4

2.4.2 血清抗體的特異性 Western blot分析顯示（圖5-A），融合蛋白His-CD4 （泳道1）、GST-CD4（泳道2）、GST標簽蛋白（泳道3）均可與抗血清反應，且出現特異性條帶。同時，樹鼩的淋巴細胞樣品（泳道4）可以與抗血清反應，而人（泳道5）、猴（泳道6）、大鼠（泳道7）和小鼠（泳道8）的淋巴細胞樣品未與抗血清反應（圖5-B）。表明該血清抗體具有較好的特異性，且無物種交叉反應。

圖4 各組CD4抗血清效價的結果Figure 4 Titer of mouse antiserum against CD4 of each group

圖5 小鼠抗CD4血清體外體內Western blot鑒定Figure 5 Western blotting of mouse antisera against CD4 in vitro and in vivo

3 討論

T淋巴細胞能夠介導體內的細胞免疫應答， 其中含有CD4抗原的T細胞經刺激活化后能分化成CD4+Th細胞，接著能夠通過分泌大量的細胞因子參與細胞和體液免疫應答。因而檢測機體內的CD4+T淋巴細胞的數量并根據其他細胞因子的水平可以評價機體內的免疫應答狀態，為一些疾病免疫應答的機制以及一些抗干擾的機理提供了理論依據［6-9］。

CD4蛋白分子是免疫系統中比較重要的細胞表面分子，本實驗構建了兩種表達質粒pGEX-5X-1-CD4和pET30a（+）-CD4分別帶有GST和His標簽，這樣容易通過純化獲得。在大腸桿菌中，原核表達重組蛋白及純化整個過程相對于真核表達來說，經濟、方便、易于獲得，為后續CD4蛋白的相關研究提供了較為方便的基礎。在本實驗中，應用生物信息學軟件預測的GST-CD4融合蛋白理論相對分子質量約為74.6×103， 但SDS-PAGE分析本實驗獲得重組蛋白的相對分子質量約為70.0×103，同時作者對純化的融合蛋白樣品進行了質譜檢測，并經Western blot驗證該重組融合蛋白為GST-CD4融合蛋白。其原因可能是原核表達的蛋白沒有發生一些蛋白的修飾過程，所得蛋白跟真核生物中表達的蛋白構象以及大小存在一定的差異［10-12］。

本研究首次表達純化了樹鼩CD4蛋白，成功制備了樹鼩CD4多克隆抗體并能特異性地檢測到樹鼩體內的CD4蛋白，有利于檢測樹鼩機體內的CD4+T淋巴細胞的數量，對于揭示樹鼩各種疾病的免疫應答機制，樹鼩病毒感染模型的相關指標的檢測，樹鼩CD4+T淋巴細胞的流式分析等研究提供了重要基礎。同時本文為了比較三種不同佐劑對體液免疫抗血清效價的影響，設定了相同量的免疫原跟佐劑組合免疫小鼠，所得抗血清通過間接ELISA來測定效價。經計算，弗氏佐劑組的抗血清幾何平均滴度（GMT： 97 420）高于Al（OH）3佐劑組（GMT： 67 202）和MF59佐劑組（GMT： 55 128），具有良好的免疫原性。結果顯示，弗氏佐劑相對于其他兩種佐劑，能夠更加有效地提高抗原誘導的保護性體液免疫應答。且本文以弗氏佐劑組抗血清為一抗（稀釋度1∶2 000）與融合蛋白GST-CD4、His-CD4、GST標簽蛋白以及樹鼩和其他物種淋巴細胞樣品進行Western blot進行分析，結果顯示并無交叉反應，表明抗血清具有良好的特異性。

綜上所述，本實驗首次成功地表達并純化了樹鼩CD4融合蛋白，并制備了特異性良好的小鼠抗血清，為下一步本實驗室制備CD4單克隆抗體、CD4蛋白分子的功能研究、為建立一種檢測樹鼩外周血CD4+T淋巴細胞方法以及樹鼩的病毒感染模型等免疫相關實驗的進行提供了基礎。

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Preparation and Determination of CD4 Polyclonal Antibodies of Tree Shrew

LU Kong-jie， XU Jing-wen， ZHANG Xue-mei， WU Zhong-xiang， REN Fang-fang，MA Na， GONG Wei， YAN Li-wei， ZHU Wen-bing， DONG Shao-zhong
（Institute of Medical Biology， Chinese Academy of Medical Science and Peking Union Medical College， Yunnan
Key Laboratory of Vaccine Research & Development on Severe Infectious Disease， Kunming 650118， China）

Objective To express tree shrew （Tupaia belangeri） CD4 protein in prokaryotic cells，purify the expressed product and prepare its polyclonal antibodies，and determinate CD4 protein in vivo.Methods CD4 gene was cloned and inserted into express vectors.And then recombinant plasmids pET30a （+）-CD4 and pGEX-5X-1-CD4 were constructed.The expressed recombinant proteins His-CD4 and GST-CD4 were expressed and purified.The polyclonal antibodies of CD4 protein were prepared with three different adjuvants including Al （OH）3， MF59 and Freund’s.The serum antibody specificity was determined by Western blot.Results The expressed recombinant proteins His-CD4 and GST-CD4， with relative molecular masses of about 53.5×103and 70.0×103respectively.And the concentrations of proteins His-CD4 and GST-CD4 were 600 μg/ml and 1mg/ml respectively.Three groups of adjuvants all can induce antibodies.The comparison results of Geometric Mean Titer （GMT）is that the Freund’s adjuvant group （GMT： 97 420） showed the highest geometric mean of antiserum，followed by Al （OH）3adjuvant group （GMT： 67 202） and MF59 adjuvant group （GMT： 55128）.The Freund’s adjuvant group was significantly higher than the original protein group （P＜0.001）.The Al（OH）3adjuvant group was significantly higher than the original protein group （P＜0.01）.The MF59 adjuvant group was higher than the original protein group （P＜0.05）.Conclusions Mouse antiserum with high specificity was prepared，and it could bind to CD4 protein of tree shrew in vivo， which laid a foundation of further study on the preparation of monoclonal antibody against CD4 and the research of CD4 function and immune related experiments of tree shrews as viral infection models.

Tree shrew； CD4 Protein； Expression； Purification； Polyclonal antibody

Q95-33

A

1674-5817（2016）04-0243-07

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.04.001

2016-05-05

國家科技支撐計劃項目（2014BAI01B01）

盧孔杰（1990-）， 男， 碩士研究生， 專業： 生物化學與分子生物學。E-mail： lkjwyh@126.com

董少忠（1968-）， 男， 研究員， 研究方向： 免疫學。Email： dsz@imbcams.com.cn