小鼠慢性應激性抑郁癥易感品系篩選及其機制初步研究

徐龍進， 王可洲（.山東省疾病預防控制中心， 濟南 5004； .山東省實驗動物中心， 濟南 500）

小鼠慢性應激性抑郁癥易感品系篩選及其機制初步研究

徐龍進1， 王可洲2
（1.山東省疾病預防控制中心， 濟南 250014； 2.山東省實驗動物中心， 濟南 250011）

目的 篩選對慢性、輕度不可預見性應激（CUMS）敏感的小鼠品系，并初步研究其敏感機制。方法 選用KM、ICR、BABL/c、C57BL/6小鼠建立CUMS抑郁模型，通過體質量、糖水偏好、曠場實驗得分考察不同品系小鼠對CUMS的敏感性。通過對小鼠海馬組織糖皮質激素受體（GR）、5-羥色胺（5-HT）、犬尿氨酸（KYN）含量的測定， 對其易感機制進行初步研究。結果 造模后C57BL/6小鼠體質量、糖水偏好、曠場實驗水平運動和垂直運動得分等指標均對CUMS表現出顯著敏感性，BABL/c小鼠對糖水偏好、曠場實驗水平運動和垂直運動得分較為敏感。對照組C57BL/6小鼠海馬組織GR、KYN含量與其他三種小鼠存在顯著差異。結論 在篩選的4個品系小鼠中，C57BL/6 小鼠對CUMS最為敏感，適于建立CUMS抑郁癥動物模型，其敏感機制可能與海馬組織GR、KYN含量有關。

小鼠； 慢性應激； 易感品系； 機制

抑郁癥是一種以持久性情緒低落、言語減少為主要臨床表現的精神疾病，近年來發病率呈升高趨勢［1， 2］， 但發病機制尚未闡明。已建立的抑郁癥模型包括孤養、應激、神經生化改變、轉基因等［3］。每種模型造模的切入點不同，適用范圍均有局限性，應激模型的造模機理及模型表現與人類抑郁癥病因及臨床癥狀相似。其中慢性輕度不可預見性應激（Chronic unpredicted mild stress， CUMS）模型被認為優于急性應激模型。然而，迄今為止國內外仍缺乏關于CUMS抑郁模型敏感動物品系選擇及敏感機制的系統研究。

本研究選用4種實驗常用的小鼠品系建立CUMS抑郁模型， 比較其對CUMS的敏感性， 并初步研究了其敏感機制，為模型動物的培育和改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級4周齡KM、ICR、BABL/c、C57BL/6小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司［SCXK（京）2012-0001］， 體質量22±4 g， 雌雄各半，分籠飼養，環境溫度20～22℃，相對濕度45%～60%， 12 h/12 h明暗循環［SYXK（魯）2013-0008］，自由攝食攝水，檢疫7 d后使用。連續3 d采用強迫游泳對小鼠的自發活動進行測定，將過于興奮和過于安靜的小鼠篩除。本實驗方案經山東省疾病預防控制中心實驗動物倫理委員會審核批準，實驗動物飼養、實驗操作均符合實驗動物倫理要求。

1.2 儀器和試劑

JY10001型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）； DK-420S恒溫水浴箱（上海雙旭電子有限公司）；FYL-YS-150L醫用4 ℃保冷柜（北京福意電器有限公司）； 自制曠場實驗箱（81 cm×81 cm×50 cm， 頂部兩組照明， 光照強度120 Lux， 內置攝像頭， 監測動物的活動狀態， 底部等分為16個等邊方格）； 羊抗小鼠糖皮質激素受體（GR）抗體（美國Santa Cruz 公司， 批號I1306）； 小鼠5-羥色胺（5-HT） ELISA試劑盒（南京森貝伽生物科技有限公司）； 小鼠犬尿氨酸（KYN）ELISA試劑盒（北京綠源大德生物科技有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 CUMS抑郁模型的建立 按照許晶等［4］方法稍作改進，將每種品系小鼠24只（雌雄各半）按照性別隨機分為雄性對照組、雄性模型組、雌性對照組、雌性模型組， 每組6只。造模時間為3周，3周內隨機安排9種刺激， 每日1種， 每種刺激使用3次， 9種刺激包括： 4 ℃冰水游泳5 min、明暗顛倒24 h、45 ℃熱水游泳5 min、停食48 h、夾尾1 min、濕墊料24 h、束縛2 h、水平搖晃10 min、傾斜鼠籠24 h。

1.3.2 小鼠CUMS抑郁易感品系的篩選 通過體質量、糖水偏好實驗、曠場實驗考察小鼠對CUMS抑郁的敏感性。

1.3.2.1 體質量測量 造模后7 d、14 d、21 d、28 d上午9∶00～10∶00測量小鼠體質量。

1.3.2.2 糖水偏好實驗 測量小鼠體質量后進行糖水偏好實驗，持續時間為8 h，實驗用液體每瓶200 mL。實驗前3 d給予2瓶質量分數1%蔗糖水； 前2 d，給予1瓶1%蔗糖水和1瓶純凈水，每隔3 h調換水瓶位置； 前1 d，禁食禁水24 h。糖水偏好實驗時給予每籠小鼠1瓶1%蔗糖水和1瓶純凈水。8 h后稱重剩余量， 計算動物的總液體消耗、糖水消耗、純水消耗， 計算糖水偏好指數。糖水偏好指數=糖水消耗量/（糖水消耗量+純水消耗量）。

1.3.2.3 曠場實驗 造模后10 d、20 d分別進行2次曠場實驗，每日9∶00～12∶00將小鼠置于底部中央方格，觀察記錄小鼠穿越格數（四肢踏入的方格方可計數，作為水平運動得分）和后肢直立次數（兩前爪騰空或攀附墻壁，作為垂直運動得分）。清潔曠場實驗箱后再進行下一只小鼠的觀察。通過水平運動得分（horizontal movement score）和垂直運動得分（vertical movement score）考察小鼠的自發性探索運動狀態。

1.4 易感機制研究

分離小鼠海馬組織， 測定生物標志物含量， 初步研究小鼠對CUMS抑郁的易感機制： 造模后28 d各組小鼠體質量、糖水偏好實驗結束后，用質量分數20%烏拉坦麻醉小鼠，打開胸腔，生理鹽水心臟灌流后斷頭處死小鼠、冰浴取全腦，分離海馬組織，左右側海馬分別稱重，-70 ℃保存備用。左側海馬用于GR蛋白表達測定，右側海馬用于5-HT、KYN的含量測定，以減少實驗動物用量。

按照Lewis等［5］方法提取小鼠海馬組織蛋白后，采用蛋白印跡法（Western blot） 測定小鼠海馬內GR蛋白表達。

取小鼠海馬組織按按質量體積比1∶9加入生理鹽水，制成勻漿，7 000 r/min 離心取上清液，采用小鼠5- HT ELISA試劑盒和小鼠KYN ELISA試劑盒測定海馬組織中5-HT、KYN的含量。

1.5 統計方法

采用SPSS12.0軟件進行統計分析，數據以x-± s表示，組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠CUMS抑郁易感品系的篩選

2.1.1 小鼠體質量變化 CUMS抑郁模型建立后7 d、14 d、21 d、28 d測定小鼠體質量，詳見表1。

2.1.2 糖水偏好實驗 CUMS抑郁模型建立后7 d、14 d、21 d、28 d測定小鼠糖水偏好指數（表2），造模后14 d、21 d、28 d ICR小鼠、C57BL/6小鼠糖水偏好指數均極顯著低于對照組（P＜0.01）。KM小鼠及雄性BABL/c小鼠在14 d糖水偏好指數顯著低于對照組（P＜0.05），21 d、28 d極顯著低于對照組（P＜0.01）。

2.1.3 曠場實驗 CUMS抑郁模型造模后10 d、20 d分別進行2次曠場實驗，測定小鼠水平運動和垂直運動得分（表3）。四種小鼠模型組20 d水平運動得分均顯著低于對照組。C57BL/6小鼠雄性模型組水平運動得分極顯著低于KM、ICR、BABL/c小鼠（P＜0.01）。四種小鼠20 d垂直運動得分均顯著低于對照組。除雄性ICR小鼠外，各組小鼠造模后20 d垂直運動得分均顯著或極顯著低于10 d。模型組雌性C57BL/6小鼠垂直運動得分極顯著低于KM、ICR、BABL/c模型小鼠（P＜0.01）； 模型組雄性C57BL/6小鼠垂直運動得分極顯著低于KM、ICR、模型小鼠（P＜0.01）。

表1 不同品系小鼠CUMS后體質量變化 g

表2 不同品系小鼠CUMS后糖水偏好指數變化

2.2 易感機制研究

2.2.1 小鼠海馬組織中GR蛋白表達測定結果 四種小鼠模型組海馬組織中GR蛋白含量均顯著或極顯著高于對照組（表4）。其中， 雌性BABL/c小鼠顯著高于C57BL/6小鼠（P＜0.05），其他小鼠均極顯著高于C57BL/6小鼠（P＜0.01）。此外， C57BL/6小鼠對照組海馬組織中GR蛋白含量顯著或極顯著低于其他三種小鼠。

2.2.2 小鼠海馬組織中5- HT含量測定結果 除雄性KM小鼠外，其他小鼠模型組海馬組織中5-HT含量均顯著或極顯著高于對照組（表5）。BABL/c小鼠模型組海馬組織中5- HT含量顯著高于C57BL/6小鼠，KM小鼠和ICR小鼠模型組海馬組織中5-HT含量極顯著高于C57BL/6小鼠。

2.2.3 小鼠海馬組織中KYN含量測定結果 造模后28 d處死小鼠， 采用ELISA試劑盒測定小鼠海馬組織中KYN含量， 結果見表6。四種小鼠模型組海馬組織中KYN含量均顯著或極顯著高于對照組，其中雌性模型組小鼠海馬組織中KYN含量極顯著高于對照組（P＜0.01）。BABL/c、C57BL/6小鼠雌性和雄性模型組小鼠海馬組織中KYN含量均極顯著高于對照組（P＜0.01）。對照組C57BL/6小鼠海馬組織中KYN含量顯著或極顯著高于其他三種小鼠模型組。

表3 不同品系小鼠CUMS后曠場實驗得分

表4 小鼠海馬組織中GR蛋白水平 ng/g

表5 小鼠海馬組織中5- HT含量 ng/mL

表6 小鼠海馬組織中KYN含量 ng/mL

3 討論

CUMS是構建慢性抑郁癥動物模型的方法之一。目前常用的模型動物為大鼠［6，7］，關于小鼠CUMS抑郁癥模型的報道尚少，而有關小鼠CUMS抑郁癥模型敏感品系及敏感機制的研究尚未見報道。目前普遍認為，CUMS抑郁癥模型能夠人類抑郁癥的主要臨床癥狀，如食欲減退、快感缺乏、活動興趣降低等［8］。攝食量、體質量、糖水偏好及行為學表現（懸尾實驗、迷宮實驗、強迫游泳、曠場實驗）等是常用的抑郁癥動物模型評價指標和方法。因此，本研究通過CUMS建立小鼠慢性抑郁癥模型，通過體質量、糖水偏好、曠場實驗對模型小鼠的敏感性進行了考察。

CUMS小鼠抑郁癥模型建立后雌性KM小鼠及雄性BABL/c小鼠體質量未見顯著降低或出現顯著升高（表1）， 而ICR小鼠、C57BL/6小鼠體質量顯著降低， 說明體質量指標可能不適于作為小鼠抑郁癥模型的評價指標。而臨床抑郁癥患者體質量變化也存在表現不一的問題， 體質量降低或升高現象均存在。國外對CUMS模型體質量增加或減少也尚存爭議［9-11］。

糖水偏好實驗可用于評價模型動物的快感缺失狀態，是衡量快感缺乏的客觀指標。CUMS小鼠抑郁癥模型建立后四種小鼠糖水偏好均顯著降低， 表現出相同的趨勢，說明糖水偏好可作為小鼠抑郁癥模型的評價指標。其中BABL/c小鼠、C57BL/6小鼠SP降低尤為顯著， 提示BABL/c小鼠、C57BL/6小鼠對CUMS較為敏感。

水平運動用于反映動物的活動度（活動興趣），垂直運動用于評價動物對新鮮環境的好奇程度（探知興趣）， 兩項指標均為精神類疾病動物模型的常用指標。本實驗中造模10、20 d后四種小鼠水平運動及垂直運動得分均顯著降低， 說明二者均可作為小鼠抑郁癥模型的評價指標。但四種小鼠中僅BABL/c小鼠、C57BL/6小鼠的水平運動、垂直運動得分可從10 d持續維持降低趨勢， 直至造模后20 d， 其中C57BL/6小鼠得分降低尤為顯著， 說明C57BL/6小鼠對CUMS更為敏感， 且具有抑郁癥狀持續時間長的優點， 適于長期給藥的藥效學研究。糖水偏好實驗及曠場實驗中均表現出雌性動物較雄性動物更為敏感的特征， 這一結果與人類抑郁癥流行病學特征相符［1］。

下丘腦- 垂體-腎上腺軸（hypothalamic-pituitaryadrenal axis，HPA）功能亢進［12］是抑郁癥發病機制中被多數學者接受的學說之一。GR在海馬組織中表達水平相對較高，是海馬組織對HPA軸進行負反饋調節的主要機制。已有研究表明，抑郁癥患者及動物模型海馬組織均存在GR蛋白低表達和HPA軸亢進的現象［13-15］。近年來國內外學者已通過代謝組學、基因組學、蛋白組學等手段對抑郁癥的分子機制和遺傳機制進行了初步研究，并通過大規模臨床數據薈萃對抑郁癥的可能病因進行了探索。已篩選到的與抑郁癥相關的生物標志物以達數十種之多，其中氨基酸代謝途徑中的主要生物標志物為色氨酸、KYN、5-HT等； 能量代謝途徑中的主要生物標志物為葡萄糖、丙酮酸等； 酮體代謝途徑中的主要生物標志物為3-羥基丁酸等［16］。動物模型及臨床分析中均已發現抑郁癥模型或患者腦組織存在KYN升高和5-HT降低現象。因此，本研究對小鼠慢性抑郁癥模型的海馬組織GR蛋白表達水平及5-HT、KYN等標志物的含量變化進行了定量研究，以初步探索不同品系小鼠對CUMS的易感機制。

研究結果表明， C57BL/6小鼠對照組GR顯著低于其他三種小鼠、KYN顯著高于其他三種小鼠， 且造模后GR、KYN降低或升高更為顯著。而在上述行為學評價中， C57BL/6小鼠對CUMS更為敏感。因此， 推測小鼠海馬組織GR、KYN水平差異可能是導致C57BL/6小鼠對CUMS更為敏感的原因。其中GR受體低表達會導致HPA軸亢奮，因此C57BL/6小鼠對CUMS更為敏感可能與HPA軸相關標志物的表達水平有關［12］。國外研究報道，小鼠給予KYN后更易表現出抑郁行為特征［17］， 與本研究結果一致。KYN、5-HT均為腦內色氨酸代謝的重要通路，在本研究中，各對照組小鼠海馬組織內KYN含量存在顯著差異，而5-HT含量未見顯著差異，可能與5-HT在腦組織不同部位的分布差異差異有關［18］。

綜上所述，KM、ICR、BABL/c、C57BL/6四個品系小鼠中，C57BL/6小鼠對CUMS刺激更為敏感，適于構建CUMS抑郁模型。其敏感機制可能與海馬組織中GR、KYN含量有關。

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Screening of Mouse Strain Susceptive to Chronic Stress Depression and Preliminary Research on Its Mechanism

XU Long-jin， WANG Kou-zhou
（1.Shandong Center for Disease Control and Prevention， Ji’nan， 250014， China；2.Laboratory Animal Center of Shandong Province， Ji’nan， 250011， China）

Objective To screen mouse strain that susceptive to chronic unpredicted mild stress （CUMS） and preliminarily research its susceptive mechanism.Methods KM， ICR， BABL/c and C57BL/6 mice were used to establish CUMS depression model.Body weight， sucrose preference test（SPT）， open field test （OFT） were used to evaluate the sensitivity of mice to CUMS.Hippocampal levels of glucocorticoid reccptor （GR）， 5-hydroxytryptamine（5-HT）， kynurenine（KYN） were measured and used for susceptive mechanism research.Results Body weight， SPT， horizontal movement score and vertical movement score of C57BL/6 mice were found to susceptive to CUMS.SPT， horizontal movement score and vertical movement score of BABL/c showed similar tendency.Hippocampal levels of GR and KYN of normal C57BL/6 mice were significantly lower or higher than that of normal KM， ICR and BABL/c mice.Conclusions The C57BL/6 mouse is most susceptive to CUMS among 4 strains tested， and hippocampal levels of GR and KYN may be the main mechanism responsible for its susceptibility.

Mouse； Chronic stress； Susceptive strain； Mechanism

R749.4 Q95-33

A

1674-5817（2016）04-0257-06

10.3969/j.issn.1674-5817.2016.04.003

2016-05-30

國家自然科學基金（31171219）

徐龍進（1973-）， 男， 博士， 副主任技師， 主要研究方向： 實驗動物管理。E-mail： sdxulongjin@163.com

王可洲（1974-）， 男， 基礎獸醫學博士。E-mail：wangkezhou_cn@163.com