紅花注射液生物活性測定方法的建立與質量評價

馮五文，李瑞煜，董芹，章從恩，李光全，史志龍，董小萍

·炮制制劑·

紅花注射液生物活性測定方法的建立與質量評價

馮五文，李瑞煜，董芹，章從恩，李光全，史志龍，董小萍

目的：建立基于生物活性測定的紅花注射液質量評價方法，探究紅花注射液不良反應的物質基礎。方法：建立挑絲法測定不同批次的紅花注射液對凝血酶的抑制作用；采用紫外分光光度法測定不同批次紅花注射液中總黃酮；采用相關分析考察抗凝血酶效價與總黃酮之間的相關性。結果：部分不良反應批次的紅花注射液抗凝血酶活性比正常批次強；抗凝血酶活性與總黃酮含量有顯著相關。結論：所建立的基于抗凝血酶活性的紅花注射液質量評價方法重復性好，靈敏簡便，可作為現行紅花注射液質量控制標準的補充方法；紅花注射液的不良反應與總黃酮含量有關，總黃酮含量過高為部分紅花注射液引起不良反應的原因。

紅花注射液；生物活性測定；凝血酶；不良反應；紫外分光光度法

紅花注射液是由菊科植物中藥紅花（Carthanus tinctorius L.）經現代制藥工藝制成的中藥注射劑，具有抗凝血、抑制血栓形成、降血壓等作用，臨床主要用于心腦血管性疾病，如冠心病、心絞痛、肺心病心力衰竭、腦梗死等。盡管在臨床中得到了廣泛的應用和藥理效應的肯定，然而臨床上關于紅花注射液不良反應的報道卻呈現出上升趨勢。2012年，國家食品藥品監督管理局發布的《藥品不良反應信息通報》（第52期）通報警惕紅花注射液的不良反應，紅花注射液引發不良反應的問題已經成為關乎人民群眾安全的亟需解決的問題。

中藥注射劑的質量與不良反應的發生有著密切的關系，如何有效控制紅花注射液的質量已經成為當前的一個重要的挑戰。紅花的藥材來源相對廣泛，制備工藝復雜，活性成分多，導致目前廣泛采用的監測少數常規化學成分的含量測定或指紋圖譜的方法不能很好的控制紅花注射液質量和臨床療效，因此，建立新方法以對紅花注射液的質量進行補充控制具有十分重要的意義。按照2010版《中國藥典》中的《中藥生物活性測定指導原則》，本文建立了基于抗凝血酶作用的紅花注射液質量評價方法，該方法靈敏簡便，可作為現行紅花注射液質量控制的補充控制方法。

1 材料

凝血酶（sigma：T4648，批號：20130805229），纖維蛋白原（sigma：F8630，批號：01401015266），生理鹽水（石家莊四藥有限公司，批號：1408023203），山奈酚（中國藥品生物制品檢定所，批號：110861-200405）；亞硝酸鈉、氫氧化鈉為分析純；紫外分光光度計（上海欣茂儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（北京市長風儀器儀表有限公司）；紅花注射液由四川雅安三九藥業有限公司等提供。

2 方法

2.1溶液的配制

取纖維蛋白原粉末適量，溶解于37℃保溫的生理鹽水中，制成最終濃度為0.5％（凝固物計）的纖維蛋白原溶液。取適量凝血酶標準品，以生理鹽水溶解并定量稀釋配制成5.0、6.4、8.0、10.0、12.0 U·mL-1的標準品溶液。取紅花注射液，用生理鹽水按一定體積比將紅花注射液稀釋成原溶液的1/2、1/3、1/4、1/5、1/8、1/10濃度。

2.2凝固時間檢測

取96孔板，固定于37℃恒溫水浴中，同時避免水浴鍋中水進入96孔板。用排搶每孔加入纖維蛋白原溶液100 μL，并每孔加入稀釋或未稀釋的紅花注射液50 μL，攪拌，孵育一定時間后，加入凝血酶溶液10 μL，攪拌混勻，用排槍槍頭反復接觸溶液液面，記錄每孔從攪拌混勻到能從溶液中拉出細絲的時間（成絲時間）。采用生理鹽水作空白對照，記錄空白對照的成絲時間。每次實驗重復8孔，求成絲時間平均值（最大值與最小值的差不得超過平均值的10％，如果超過則舍棄該值）。

2.3總黃酮含量測定

參照文獻［1］，采用紫外分光光度法測定不同批次紅花注射液中總黃酮Y的含量。吸光度X與總黃酮含量的標準曲線方程Y= 0. 0863 X + 0. 1072，r2=0.9942。

2.4紅花注射液抗凝血酶的效價計算

設凝血酶標準品的效價為U1，加入紅花注射液后實際測得的凝血酶效價為U2，則紅花注射液抗凝血酶的效價U計為U= U1- U2。

2.5相關性分析

采用SPSS 20.0 對紅花注射液中總黃酮和抗凝血酶效價進行Pearson相關分析。

3 結果

3.1凝血酶加入量考察

凝血酶的加入量對成絲時間的長短具有重要影響，為保證實驗操作的方便性與省時性，成絲時間不能過長或過短。分別考察了5、10、20、30 μL的凝血酶加入量，發現加入5.0-10.0 U·mL-1的凝血酶10 μL時，成絲時間在60 s至180 s之間，適合實驗有序操作，故選擇凝血酶的加入量為10 μL。

3.2紅花注射液稀釋度考察

取不同稀釋度的紅花注射液，按2.2項下凝固時間檢測法檢測，記錄加入不同稀釋度的紅花注射液后溶液的成絲時間。結果表明，當稀釋至原溶液的1/3濃度時，溶液成絲時間為100 s左右，適合實驗操作，故選擇1/3濃度為后續實驗濃度。

3.3孵育時間考察

考察了0、5、10、20、30 min作為纖維蛋白原溶液與紅花注射液的孵育時間，結果表明，孵育時間對成絲時間及成絲能力等無明顯影響，故選擇0 min為孵育時間。

3.4方法學考察

3.4.1線性關系考察 取5.0、6.4、8.0、10.0、12.0 U·mL-1的標準品溶液，按2.2項下凝固時間檢測法檢測，記錄溶液成絲時間。以標準品的效價的對數（X）為橫坐標，平均成絲時間的對數（Y）為縱坐標，進行直線回歸，得效價與平均成絲時間的對數的回歸方程為Y= -0.9205 X + 2.8942，r2=0.9932。

3.4.2精密度試驗 取10.0 U·mL-1的標準品溶液，按2.2項下方法連續6次測定溶液成絲時間，記錄每次測定的平均成絲時間，計算得平均成絲時間的RSD為4.7％。

3.4.3穩定性試驗 取10.0 U·mL-1的標準品溶液，在纖維蛋白原溶液配制完成的0、1、2、4、8 h時按2.2項下方法進行平均成絲時間的測定。同法考察凝血酶溶液在配制、紅花注射液在開封0、1、2、4、8、12 h時使用的平均成絲時間。結果表明，纖維蛋白原溶液在8 h內基本穩定，凝血酶和紅花注射液在開封12 h內基本穩定，因此，后續實驗均在纖維蛋白原溶液配制的8 h內進行。

3.4.4中間精密度試驗 按2.2項下方法，考察不同實驗人員對測定結果的影響，計算得不同人員測定的平均成絲時間的RSD為4.8％。說明不同實驗人員對方法的結果影響較小，方法的穩定性較好。

3.5不同批次紅花注射液抗凝血酶效價及總黃酮的測定

在確定方法學的可靠性后，測定不同廠家、不同批次的紅花注射液的抗凝血酶的效價以及其中的總黃酮含量，結果見表1。結果表明，不良反應批次間的紅花注射液抗凝血酶效價及總黃酮含量具有較大差異性，而正常批次的紅花注射液的抗凝血酶效價及總黃酮含量的差異較小。

3.6紅花注射液抗凝血酶活性與化學成分間的相關性

將所有批次的紅花注射液抗凝血酶效價與對應的總黃酮含量作圖，見圖1。并按2.5項下方法進行相關性分析，相關性系數0.898。結果表明，紅花注射液的抗凝血酶效價與總黃酮含量之間有顯著相關性。

圖1　紅花注射液總黃酮含量與抗凝血酶效價的相關性分析

4 討論

目前，生物評價為中藥質量控制的發展方向［2-3］，這以《中國藥典》2010版附錄《中藥生物活性測定指導原則》為明確的信號標志。因此，本文從生物評價角度研究紅花注射液的質量評價方法。目前，活血化瘀類中藥一般從以下方法進行生物活性測定研究［4］：①家兔/大鼠離體動脈環（條）收縮試驗；②血小板聚集試驗；③凝血時間的測定，如活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶時間（TT）等；④大鼠動脈血栓形成時間。鑒于上述方法均需要實驗動物與一般實驗室不能配備的實驗儀器，同時實驗過程操作復雜，實驗結果影響因素多，本文嘗試采用體外（非動物）實驗對紅花注射液進行質量評價。實驗采用的凝血酶是體內凝血、血栓形成過程的關鍵酶，在腦梗死等心血管疾病過程中發揮著關鍵作用。紅花注射液中的主要成分為黃酮類及黃酮類色素類成分［5］，文獻報道，黃酮類成分包括紅花注射液中的槲皮素具有抗凝血酶的作用［6-7］。因此，本文采用紅花注射液抗凝血酶活性評價紅花注射液質量。

關于凝血酶活性測試的方法有很多，比如發色底物法等，但這些方法所需材料昂貴。參考《中國藥典》2010版第二部凝血酶的質量控制方法，本文做了改進，使所需的實驗材料更少，實驗耗時更少，實驗準確度更高，所建立的方法穩定、重復性好、操作簡便，所采用的紫外分光光度儀也為實驗室配置的常規儀器，該方法用于紅花注射液的質量控制時具有很強的實用價值。同時，所建立的方法對改進《中國藥典》中一部水蛭和二部凝血酶的質量控制均具有參考借鑒意義。

為更好地與臨床結果相結合，比較了8批有不良反應的樣品與10批正常樣品。由實驗結果可知，10批正常樣品的總黃酮含量波動相對較小，而8批不良反應樣品的總黃酮含量相對波動較大。其中，有5批不良反應樣品的總黃酮含量遠遠高于正常樣品的總黃酮含量，與文獻［8］等報道紅花注射液中成分含量波動大相一致。據報道，紅花注射液的不良反應的表現之一為出血［9］，與西藥肝素、華華林等抗凝藥具有一致性，同時，肝素等凝血酶抑制劑的主要不良反應表現也為出血等癥狀，而且與用藥劑量有關［10～11］，提示紅花注射液的不良反應有部分是由于活性成分過多引起。5批不良反應樣品的總黃酮含量較高，提示這些批次的不良反應主要是由于其中有效成分含量過高、對凝血酶抑制作用過強，這種原因符合文獻［12］的推測原因及活血化瘀藥“中病即止”的原理。目前，紅花注射液的質量標準中規定了總黃酮的含量下限，但未規定含量上線，導致藥品生產廠家的產品有效成分過多，出現不良反應。因此，同有毒類中藥附子、馬錢子等一樣，我們建議《中國藥典》增加紅花注射液中的總黃酮含量上限。同時，本文結果對其它的活血化瘀類中藥注射劑如丹紅注射液等的質量標準制定也具有參考價值。

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（責任編輯：陳思敏）

Bioactivity detection method development and quality evaluation of safflower injection/

FENG Wu-wen， LI Rui-yu，DONG Qin， ZHANG Cong-en， LI Guang-quan， SHI Zhi-long， DONG Xiao-ping//（ Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， Sichuan）

Objective: To establish a bioassay method to evaluate the quality of safflower injection and to explore the constituents related to adverse reaction of safflower injection. Method: With fibrinogen as enzyme substrate， safflower injection as enzyme inhibitor， thrombin as work enzyme， the abilities of different batches of safflower injection in inhibiting the thrombin were determined. The total flavonoids were determined by ultraviolet spectrophotometry. The correlation between antithrombase potency and total flavonoids were analyzed.Result: There were significant difference in the inhibit ability of different batches of safflower injection. Some abnormal samples showed stronger inhibit ability than normal samples. Correlation analysis indicated that there were strong correlation between inhibit ability of safflower injection and total flavonoids. Conclusion: The method established possesses the characteristics of good reproducibility， high sensitivity， simplicity and convenience， and can serve as a supplementary method to control the quality of safflower injection. The adverse reaction of safflower injection is related to total flavonoids content. High content of total flavonoids is a part of the reasons for adverse reaction of safflower injection.

Safflower injection； bioassay； thrombin； adverse reaction； ultraviolet spectrophotometry

·藥理毒理·

R 283

A

1674-926X（2016）03-013-03

成都中醫藥大學，四川 成都 611137

馮五文，在讀碩士研究生，主要從事中藥有效成分及質量標準研究 Email：jiaoxiake-1@foxmail.com

董小萍，教授，主要從事中藥質量評價與成分分析研究 Email：dongxiaoping11@126.com

2015-08-02