雙水相提取黃芪莖總黃酮及其抗氧化活性研究

鐘方麗，王文姣，2，王曉林*，姚麗麗

（1.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林 132022；2.吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院，吉林長春130012）

雙水相提取黃芪莖總黃酮及其抗氧化活性研究

鐘方麗1，王文姣1，2，王曉林1*，姚麗麗1

（1.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林 132022；2.吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院，吉林長春130012）

試驗(yàn)探索了微波協(xié)同雙水相法提取黃芪莖總黃酮的工藝條件并對其體外抗氧化活性進(jìn)行研究。采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對黃芪莖中總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化；通過對超氧陰離子自由基的清除率和還原力對其抗氧化活性進(jìn)行評價。結(jié)果表明，微波協(xié)同雙水相提取黃芪莖總黃酮的最佳工藝條件為料液比1∶27，微波功率400 W，醇水比0.67，提取時間7 min，硫酸銨質(zhì)量濃度0.27 g/mL；黃芪莖總黃酮提取液的抗氧化活性隨提取液用量的增加而逐漸增強(qiáng)，其對超氧陰離子自由基的清除率可以達(dá)到82%，而且具有較強(qiáng)的還原力。

黃芪莖；總黃酮；雙水相；抗氧化

［Abstract］The test was conducted to study the extraction technology of total flavonoids in astragalus stems with aqueous two-phase assisted with microwave method and its antioxidant ability.The single factor and orthogonal tests were applied to optimize the extraction technology of total flavonoids in astragalus stems.The antioxidant ability of the extracts was evaluated according to the clearance ratio and reducing power to superoxide anion free radical.The optimum extraction technology of total flavonoids in astragalus stems with aqueous two-phase assisted with microwave method was obtained. The ratio between material and solvent，the microwave power，the ratio between ethanol and water，extraction time，mass concentration of ammonium sulfate were 1∶27，400 W，0.67，7 min，0.27 g/mL，respectively.The clearance ratio of the total flavonoids extraction solution of astragalus stems to superoxide anion free radical could reach 82%，antioxidant activity of which gradually enhanced with the increase of the amount of the extraction solution.

［Key words］astragalus stems；total flavonoids；aqueous two-phase；antioxidant activity

黃芪是我國傳統(tǒng)的中草藥材。研究表明，黃酮是黃芪中一類重要的活性成分，具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗突變、清除自由基等多種活性作用（陳建真等，2009）。黃芪的傳統(tǒng)應(yīng)用部位是根部，但黃芪莖的產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于黃芪根（楊春樹，1997）。目前，我國大部分黃芪莖被廢棄，未被有效利用，資源浪費(fèi)嚴(yán)重（畢志明等，2007）。研究表明，飼料中添加黃芪莖粉后，對雞、兔具有明顯的促生長和增強(qiáng)免疫能力作用，能夠提高畜禽的生產(chǎn)性能（王鳳霞等，2009）。雙水相體系是一種新型的分離技術(shù)，具有工藝條件溫和、生物親和性好等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物中活性物質(zhì)的分離 （歐陽玉祝等，2011）。本試驗(yàn)將微波輔助提取法與雙水相體系結(jié)合提取黃芪莖總黃酮，并考察了黃芪莖總黃酮提取液的抗氧化活性。

1　材料與方法

1.1材料與儀器試驗(yàn)材料：黃芪莖，購于吉林省均林中草藥種植有限公司；蘆丁對照品（成都曼思特生物科技有限公司）；三羥甲基氨基甲烷（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；水為重蒸餾水；石油醚、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁、硫酸銨、鐵氰化鉀、無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純試劑。

試驗(yàn)儀器：TU-1810型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；MAS-Ⅱ型常壓微波輻射萃取儀 （上海新儀微波化學(xué)科技有限公司）；FA2004N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；KQ118型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DHG-9076A型電熱鼓風(fēng)干燥器（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1線性關(guān)系考察及樣品中總黃酮含量的測定參照江蔚新等（2004）和李春紅等（2011）的黃芪總黃酮含量測定方法，精密稱取120℃干燥至恒重的蘆丁對照品10.0 mg，置于50 mL容量瓶中，加入60%乙醇溶液溶解并定容，搖勻，配制成每毫升含0.20 mg對照品的溶液。精密吸取上述對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加入5%NaNO2溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加入10%Al（NO3）3溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加入4%NaOH溶液4.0 mL，用60%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)的試劑為空白對照，按照分光光度法，在510 nm波長處測定其吸光度。

1.2.2單因素提取試驗(yàn)

1.2.2.1醇水比對提取效果的影響設(shè)定雙水相總體積為50 mL，加入硫酸銨13.5 g，分別設(shè)定醇水比為0.47、0.57、0.67、0.77、0.87，形成穩(wěn)定的雙水相體系，加入脫脂的黃芪莖粉2 g，于微波功率500 W提取5 min，過濾，濾液于分液漏斗中靜置分層，上層乙醇相以相應(yīng)濃度的乙醇溶液定容，吸取乙醇適量，按1.2.1的方法測定總黃酮含量，計算總黃酮提取率。

總黃酮提取率/%=提取液中總黃酮質(zhì)量/黃芪莖粉質(zhì)量×100。

1.2.2.2硫酸銨質(zhì)量濃度對提取效果的影響設(shè)定雙水相總體積為50 mL，選擇醇水比為0.67，加入無水乙醇20 mL、蒸餾水30 mL，分別加入硫酸銨7.5、10.5、13.5、16.5、19.5 g，硫酸銨質(zhì)量濃度分別為0.15、0.21、0.27、0.33、0.39 g/mL，形成穩(wěn)定的雙水相體系，在上述條件下試驗(yàn)并測定提取液總黃酮含量，計算總黃酮提取率。

1.2.2.3微波提取時間對提取效果的影響設(shè)定雙水相總體積為50 mL，選擇醇水比為0.67，加入硫酸銨13.5 g，形成穩(wěn)定的雙水相體系，微波功率為500 W，微波輔助提取時間分別為1、3、5、7、10、15 min，在上述條件下試驗(yàn)并測定提取液總黃酮含量，計算總黃酮提取率。

1.2.2.4料液比對提取效果的影響固定醇水比為0.67，料液比分別設(shè)定為1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40，硫酸銨質(zhì)量濃度為0.27 g/mL，微波功率為500 W，微波輔助提取7 min，在上述條件下試驗(yàn)并測定提取液總黃酮含量，計算總黃酮提取率。

1.2.2.5微波功率對提取效果的影響固定醇水比為0.67，料液比為1∶25，加入硫酸銨13.5 g，形成穩(wěn)定的雙水相體系，設(shè)定微波功率分別為300、400、500、600、700、800 W，微波輔助提取7 min，在上述條件下試驗(yàn)并測定提取液總黃酮含量，計算總黃酮提取率。

1.2.3正交試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，醇水比為0.47～0.87對提取率影響最小，所以選取提取時間、料液比、硫酸銨質(zhì)量濃度、微波功率4個因素，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)對黃芪莖總黃酮提取條件進(jìn)行優(yōu)化。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1　正交試驗(yàn)因素與水平

1.2.4驗(yàn)證性試驗(yàn)為了考察上述優(yōu)選的雙水相提取工藝的穩(wěn)定性，按優(yōu)化的提取工藝條件，即醇水比為0.67、微波提取時間7 min、料液比1∶25，硫酸銨質(zhì)量濃度0.30 g/mL、微波功率400 W，重復(fù)提取3次，計算總黃酮提取率。同時吸取固定體積的上層乙醇相制成干浸膏，計算干浸膏中總黃酮的含量。

1.2.5對比試驗(yàn)稱取脫脂處理后的黃芪莖粉2 g，加入40%乙醇水溶液50 mL，設(shè)定微波功率為400 W，微波輔助提取7 min，過濾，測定提取液總黃酮含量，計算總黃酮提取率。同時吸取固定體積的提取液制成干浸膏，計算干浸膏中總黃酮的含量。

1.2.6體外抗氧化性試驗(yàn)

1.2.6.1清除超氧陰離子自由基試驗(yàn)參照羅秋水等（2015）的試驗(yàn)方法，分別吸取5.6 mL Tris-HCl緩沖液（50 mmoL/L，pH 8.2）置于10 mL具塞試管中，分別加入總黃酮濃度為0.0386 mg/mL的黃芪莖提取液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，并以同質(zhì)量濃度、同體積的維生素C溶液作對照，置于25℃水浴中保溫20 min后急速冷卻，然后加入25℃預(yù)熱過的3 mmoL/L鄰苯三酚溶液0.4 mL，混勻，反應(yīng)4 min后加入8 mmoL/L HCL溶液1.0 mL終止反應(yīng)，加蒸餾水至刻度，在320 nm波長處測其吸光度A0；空白試驗(yàn)以同體積蒸餾水代替樣品溶液，以5.6 mL Tris-HCl緩沖液、8 mmoL/L HCL溶液1.0 mL及不同體積樣品溶液為空白，在320 nm波長處測定其吸光度Ax。

O2-·清除率/%=（A0-AX）/A0×100。

1.2.6.2還原力試驗(yàn)參照呂喜茹等（2010）的試驗(yàn)方法，分別吸取上述黃芪莖提取液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，加入磷酸鹽緩沖溶液（0.2 moL/L，pH=6.6）2.5 mL和1%鐵氰化鉀溶液 ［K3Fe（CN）6］2.5 mL，混合均勻后將該體系置于50℃恒溫水浴中恒溫20 min，迅速冷卻，加入10%的三氯乙酸溶液1.0 mL，5000 r/min離心10 min，移取2.5 mL上清液于另一試管中，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻，靜置10 min，以80%的乙醇溶液為空白對照，在700 nm波長處測定吸光度A。其他條件不變，用蒸餾水替代供試品溶液，在700 nm波長處測定吸光度A0，A與A0的差值越大表示供試品溶液的還原能力越強(qiáng)。

相對還原力=A－A0；

式中：A為加入黃芪莖提取液的吸光值，A0為不加黃芪莖提取液的對照值。

2　結(jié)果與分析

2.1線性關(guān)系考察以蘆丁對照品溶液的吸光度值為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：A=11.815C-0.0355，r=0.9996。結(jié)果表明，蘆丁濃度為0.02～0.10 mg/mL呈良好線性關(guān)系。

2.2單因素提取試驗(yàn)

2.2.1醇水比對提取效果的影響由圖1可知，當(dāng)醇水比為0.47～0.87時，總黃酮提取率先隨著醇水比的增大而提高，當(dāng)醇水比為0.67時提取率達(dá)到最高值0.558%，繼續(xù)增加醇水比，提取率開始下降，但整體而言在0.47～0.87時醇水比對總黃酮提取率的影響不是很顯著。

圖1　醇水比對提取結(jié)果的影響

2.2.2硫酸銨質(zhì)量濃度對提取效果的影響由圖2可知，硫酸銨質(zhì)量濃度為0.15～0.39 g/mL時，總黃酮提取率先逐漸增大后開始降低，當(dāng)硫酸銨質(zhì)量濃度達(dá)到0.27 g/mL時，總黃酮提取率達(dá)到最高值，當(dāng)硫酸銨質(zhì)量濃度超過0.27 g/mL后，水相產(chǎn)生了鹽析效應(yīng)而使提取率開始下降。

圖2　硫酸銨質(zhì)量濃度對提取效果的影響

2.2.3微波提取時間對提取效果的影響由圖3可知，隨提取時間的增加，總黃酮的提取率先逐漸增大后降低，7 min時達(dá)到最高值0.634%。可能是因?yàn)槟承S酮類化合物受熱時間過長，結(jié)構(gòu)被破壞所致。

圖3　提取時間對提取結(jié)果的影響

2.2.4料液比對提取效果的影響料液比太小，提取不完全；料液比太大，溶劑用量多，會造成分相鹽硫酸銨用量增大，影響雙水相的穩(wěn)定性，導(dǎo)致總黃酮提取率降低。由圖4可知，當(dāng)料液比為1∶20時，總黃酮提取率達(dá)到最高值0.634%。

圖4　料液比對提取效果的影響

2.2.5微波功率對提取效果的影響由圖5可見，總黃酮提取率在微波功率由300 W增加到400 W時，達(dá)到最高值0.660%，而后隨著微波功率的增高而逐漸下降，可能是因?yàn)槲⒉üβ食^一定值以后，短時間內(nèi)會引起部分黃酮結(jié)構(gòu)被破壞所造成的。

圖5　微波功率對提取效果的影響

2.3正交試驗(yàn)通過正交試驗(yàn)結(jié)果可知，4種因素對黃芪莖總黃酮提取率的影響大小順序?yàn)锽＞D＞A＞C，即料液比＞微波功率＞提取時間＞硫酸銨質(zhì)量濃度。黃芪莖總黃酮的最佳提取工藝條件是A2B2C3D2，即醇水比0.67、微波提取時間7 min、料液比1∶25、硫酸銨質(zhì)量濃度0.30 g/mL，微波功率為400 W（表2）。

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4驗(yàn)證性試驗(yàn)3次重復(fù)性工藝驗(yàn)證試驗(yàn)得出的黃芪莖總黃酮提取率分別為 0.7654%、0.7834%、0.8063%，平均為0.7850%，RSD為2.60%；干浸膏中總黃酮的含量分別為12.10%、11.79%、12.14%，平均為12.01%，試驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)過單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)選的提取工藝條件穩(wěn)定，適合規(guī)模化生產(chǎn)。

2.5對比試驗(yàn)在不加入分相鹽硫酸銨的條件下，按照最優(yōu)提取工藝提取3次，結(jié)果黃芪莖總黃酮提取率分別為0.8094%、0.7878%、0.7988%，平均為0.7987%；干浸膏中的總黃酮的含量分別為7.97%、8.02%、8.52%，平均為8.17%。通過試驗(yàn)結(jié)果可知，由于分相鹽硫酸銨的加入，可使干浸膏中的總黃酮的含量明顯提高，對黃芪莖中的黃酮類成分起到了一定的富集作用。

2.6體外抗氧化性試驗(yàn)

2.6.1清除超氧陰離子自由基試驗(yàn)由圖6可知，試驗(yàn)結(jié)果表明：在所選樣品液用量范圍之內(nèi)，黃芪莖總黃酮提取液和維生素C溶液清除超氧陰離子自由基的能力隨著用量的增大，其清除能力也越來越強(qiáng)，在用量低于3 mL時黃芪莖總黃酮提取液的清除率明顯高于維生素C溶液，但當(dāng)用量高于3 mL時，隨著樣品液用量的增加維生素C溶液的清除率增加趨勢顯著，而黃芪莖總黃酮提取液的清除率提高趨勢平緩，原因可能是黃芪莖提取液的總黃酮含量較低所造成的。黃芪莖總黃酮提取液清除超氧陰離子自由基活性研究結(jié)果表明，黃芪莖總黃酮提取液具有一定的抗氧化活性作用，如果對其采取純化手段，使其總黃酮含量提高，則其抗氧化活性會明顯提高。

圖6　清除超氧陰離子自由基的能力

2.6.2還原力試驗(yàn)由圖7可知，黃芪莖總黃酮提取液和維生素C溶液的還原力隨著用量的增加而越來越強(qiáng)。在用量小于3 mL時黃芪莖總黃酮提取液的還原力高于維生素C溶液，但隨著樣品液用量的增加，維生素C溶液還原力的增加幅度明顯高于黃芪莖總黃酮提取液，當(dāng)樣品液用量增加到5 mL時，維生素C溶液還原力開始高于黃芪莖總黃酮提取液。研究表明，黃芪莖總黃酮提取液具有明顯的還原作用。

圖7　還原力試驗(yàn)結(jié)果

3　結(jié)論

3.1通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對黃芪莖總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出黃芪莖總黃酮的最佳提取工藝條件為醇水比0.67，料液比1∶25（g/mL），微波提取時間7 min，硫酸銨質(zhì)量濃度0.30 g/mL，微波功率400 W。將微波協(xié)同雙水相最佳提取工藝下得到的黃芪莖提取溶液制成干浸膏，總黃酮含量為12.01%，而將不加入分相鹽硫酸銨的微波提取條件下得到的黃芪莖提取溶液制成干浸膏，總黃酮含量為8.17%，由于分相鹽的加入，干浸膏的總黃酮含量提高了47%。

3.2當(dāng)總黃酮質(zhì)量濃度為0.0386 mg/mL時，黃芪莖總黃酮提取液的還原力和對超氧陰離子自由基的清除率隨著用量的增加而提高，而且在用量低于3 mL時黃芪莖總黃酮提取液的還原力和對超氧陰離子自由基的清除率明顯高于維生素C溶液。試驗(yàn)結(jié)果說明黃芪莖總黃酮提取液具有一定的抗氧化能力。

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S816.7

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1004-3314（2016）11-0010-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161103