陰溝腸桿菌耐藥表型與脈沖場凝膠電泳克隆分型相關性分析

縱帥　馬萍　牛國平　徐銀海　丁宸　徐萍萍

陰溝腸桿菌耐藥表型與脈沖場凝膠電泳克隆分型相關性分析

縱帥1馬萍1牛國平2徐銀海1丁宸2徐萍萍2

目的：研究ICU分離的7株陰溝腸桿菌菌株的耐藥表型與脈沖場凝膠電泳（PFGE）克隆分型之間的相關性，明確臨床感染和流行狀況并為合理選用抗生素提供參考依據。方法：采用K-B法進行臨床常用抗生素敏感性試驗（AST），采用PFGE對7株陰溝腸桿菌進行克隆分型。結果：菌株呈嚴重的多重耐藥特性；7株陰溝腸桿菌經PFGE后分為四種不同來源的克隆型；相同來源和不同來源的陰溝腸桿菌克隆株間的耐藥譜均不完全相同。結論：AST 和PFGE分別在明晰陰溝腸桿菌治療藥物敏感性，臨床感染和流行狀況方面提供直觀依據，但耐藥表型和PFGE克隆型之間未發現明顯的相關性；應根據藥敏結果合理選用抗生素以減少或延緩強耐藥菌株的播散。

陰溝腸桿菌耐藥性脈沖場凝膠電泳克隆分型

陰溝腸桿菌是一種常見的條件致病菌，隨著抗生素的大量和不規范使用，近年已發展成為重要的醫院感染菌，常引起呼吸道、泌尿生殖道、皮膚軟組織以及血流等各種感染，由于其日趨嚴重的多重耐藥特性，使臨床抗生素治療面臨嚴峻挑戰。本文擬對ICU分離的7株陰溝腸桿菌進行耐藥表型檢測和脈沖場凝膠電泳（PFGE）克隆分型，分析二者之間是否存在明顯的相關性，明確耐藥性特點、臨床感染和流行狀況，為陰溝腸桿菌的抗生素治療和流行病學研究提供參考，現報告如下：

1　資料與方法

1.1標本來源根據感染管理監控提示ICU存在陰溝腸桿菌感染，及時采集ICU 8位不同患者和不同部位（位置）的48份標本進行培養和分離，包括靜脈血、脂乳、導管尖端、床頭柜、呼吸機及周圍環境物品等。

1.2陰溝腸桿菌的培養、分離和鑒定按照《全國臨床檢驗操作規程》（第3版）嚴格進行操作。實驗所用M-H瓊脂為英國Oxoid公司產品，VITEK-2Compact全自動細菌鑒定儀為法國生物梅里埃公司產品。

1.3抗生素敏感性試驗（AST）藥敏試驗采用美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）推薦的紙片擴散法，按CLSI2014標準對分離純化后的菌株進行18種臨床常用抗生素的耐藥性檢測。本實驗采用的抗生素見表2，抗菌藥物紙片為英國Oxoid公司產品。

1.4脈沖場凝膠電泳（PFGE）制備OD值在0.55～0.7之間的陰溝腸桿菌菌懸液，經CSB裂解后制備膠塊，限制性內切酶Xba I 37℃水浴酶切18h，使用1.0%的Seakem Gold膠進行脈沖場凝膠電泳克隆分型，在2.2L中0.5x TBE緩沖液平衡15min后開始電泳。電泳時間：18h，脈沖切換時間：2.2s～54.2s，電壓：6V/cm，T=14℃。電泳完成后膠塊在0.5μg.ml-1的溴化乙錠（EB）染液中染色30min，凝膠成像儀成像。脈沖場凝膠電泳儀和凝膠成像儀均為美國Bio-RAD產品。

1.5數據分析采用WHONET 5.6軟件進行耐藥數據的處理和分析，Quantity One 4.6軟件進行遺傳關系樹形圖的輸出和分析。

2　結果

2.1陰溝腸桿菌的分離來源及耐藥性結果經培養和分離，從其中4位患者及周圍環境中鑒定出7株陰溝腸桿菌，其余4位患者未檢出陰溝腸桿菌，分離情況見表1。7株陰溝腸桿菌對抗菌藥物的耐藥性結果見表2。

表1　7株陰溝腸桿菌的分離來源

表2　7株陰溝腸桿菌對抗菌藥物的耐藥性

2.2PFGE克隆分型結果7株陰溝腸桿菌脈沖場凝膠電泳圖見圖1，其遺傳關系樹形圖見圖2。

圖1

圖2

3　討論

陰溝腸桿菌是能夠引起嚴重醫院感染的重要革蘭陰性致病菌，呈多重耐藥特性。美國疾病控制與預防中心（CDC）在2010年首次確認了本土含有I型新德里金屬β-內酰胺酶（NDM-1）的陰溝腸桿菌［1］，由于含有NDM-1的細菌產生能一種特殊的β-內酰胺酶，后者水解包括碳青霉烯類在內的幾乎所有的β-內酰胺類抗生素，被稱為“超級細菌”，因此，陰溝腸桿菌院內感染的監控和研究越來越受到重視。

3.1臨床感染和耐藥性分析本實驗采集了ICU八位患者不同部位的48份標本，每位患者均采集靜脈血、脂乳、導管尖端、床頭柜、被褥和床單等六個位置進行培養，共培養出7株陰溝腸桿菌，患者甲、乙、丙和丁四人分離出病原菌，其余四位患者檢出其它病原菌或未檢出病原菌。其中患者丙的靜脈血、脂乳和導管尖端分別分離出三株陰溝腸桿菌，說明該ICU病區患者感染情況嚴重（見表1）。AST結果顯示7株陰溝腸桿菌對常用抗生素存在不同程度的多重耐藥，與國內相關報道相似［2］。其中，對頭孢唑啉、頭孢西丁和頭孢替坦全部耐藥，對厄他培南、亞胺培南和替加環素全部敏感。結合菌株分離情況和PFGE分型結果，患者丙不僅感染交叉現象，也存在嚴重耐藥情況，應根據藥敏結果進行積極的抗生素感染治療。

3.2PFGE克隆分型結果解讀分子分型有多種方法，PFGE仍是目前較為公認的分子分型的“金標準”，是分子流行病學中溯源研究的重要手段［3］。為明確患者的感染狀況及與耐藥性之間的關系，對分離的7株陰溝腸桿菌行PFGE分子分型。為方便觀察，我們根據初次PFGE結果進行了二次實驗（圖1），并利用QuantityOne軟件輸出了7株菌株之間的遺傳關系樹形圖（圖2）。參照Tenover FC等［4］提出的PFGE條帶解釋標準和目前研究成果，通常將相似度80%以上的菌株認為是來源于同一克隆株，而相似度低于50%的菌株則被認為克隆來源不同，其流行病學不相關；或者根據有1～3條條帶不同可認為是同一克隆，4～6條不同為可能相關，7條及以上不同為不相關的分型標準。實驗根據上述兩條標準分型結果相同，顯示7株陰溝腸桿菌被分為四種不同來源的克隆型，其中1、2、3和4號菌株被認為來源于同一克隆，5、6和7號菌株克隆來源各不相同，表明該ICU陰溝腸桿菌已爆發流行，且存在嚴重的感染交叉情況，應采取相應措施控制菌株的播散。

3.3PFGE克隆分型與耐藥表型相關性分析根據PFGE分型結果對比各克隆型菌株間的耐藥譜，結果顯示相同克隆來源株中1號和4號菌株耐藥譜完全相同，2號、3號與前兩株的耐藥譜不完全相同；不同克隆來源株中5、6、7號菌株的耐藥譜不同；2號和7號兩個不同克隆來源菌株間的耐藥譜則完全相同，提示菌株的克隆來源和耐藥性之間未發現明顯的相關性，PFGE分型結果不能用于菌株耐藥表型的預測，耐藥表型也不能用于克隆株的流行病學預測。其它菌株的研究也得出了相似結論［5～6］。其產生機制目前國內相關研究較少，作者推測可能與克隆株在增殖播散的過程中耐藥基因的獲取、丟失或水平傳播等基因突變有關，也與PFGE分型主要針對細菌或質粒的整個基因組，并不能完全反映耐藥株的耐藥基因和其它基因特征有關［6］。我們將依據此次結果，進一步擴大菌株數量，利用PCR檢測相同克隆株和不同克隆株的耐藥基因并分析它們之間的差異，以探明本文所述現象的產生機制。

1Centers for Disease Control and Prevention（CDC）. DetectionofEnterobacteriaceaeisolatescarrying metallo-beta-lactamase-UnitedStates，2010［J］. MMWR.Morb.Mortal.Wkly.Rep，2010，59（24）：750.

2陳峰，李維春，張克昌.新生兒重癥監護病房血培養122株病原菌分布及耐藥性分析［J］.安徽衛生職業技術學院學報，2012，11（2）：72～73.

3Zheng J，Keys CE，Zhao S，et al.Simultaneous analysis of multiple enzymes increases accuracy of pulsed-field gel electrophoresis in assigning genetic relationships among homogeneous Salmonella strains ［J］.Journal of clinical microbiology，2011，49（1）：85～94.

4Tenover FC，Arbeit RD，Goering RV，et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis：criteria for bacterial strain typing［J］.Journal of clinical microbiology，1995，33（9）：2233～2239.

5王迪，張曉嬡，陳倩，等.北京市食源性金黃色葡萄球菌耐藥及分子分型研究［J］.中國食品衛生雜志，2014，26（5）：428～434.

6金輝，徐小敏，糜祖煌，等.鮑曼不動桿菌的耐藥基因分型與脈沖場凝膠電泳分型的比較［J］.環境與職業醫學，2010，27（4）：219～221.

/（編審：徐元宏）

Analysis of the correlation between antibiotic resistance and pulsed-field gel electrophoresis clonal typing of Enterobacter cloacae

1.Affiliated Hospital，Xuzhou Medical University，Xuzhou 221003，Jiangsu
2.Xuzhou Central Hospital，Xuzhou，221003，Jiangsu
ZONG Shuai1，MA Ping1，NIU Guo-ping2，et al

Objective:OBJECTIVE To student on the relationship between antibiotic resistance and pulsed-field gel electrophoresis（PFGE）clonal typing of seven strains of Enterobacter cloacae isolated from ICU，make clear the clinical infection and prevalence status，and provide a scientific reference for selection of antibiotics.Methods:The antibiotics susceptibility tests（AST）were performed by the disk diffusion test，and the molecular typing of seven strains was tested by PFGE.Results:AST showed character of multiple antibiotic resistance，seven strains of Enterobacter cloacae were classified into four kinds of different clones，and the drug resistant spectrum was not identical between same clonal isolates and different clonal isolates.Conclusion:AST and PFGE clonal typing could provide evidence directly in drug resistant spectrum and nosocomial infection and prevalence status，but there was no obvious correlation between drug resistant and clonotypes.Antibiotics should be selected reasonably based on AST so as to reduce or delay strong resistant strains to spread out.

Enterobacter cloacae；Drug resistance；PFGE；Clonal typing

R331【文獻標識碼】A

1671－8054（2016）01-0099-03

1.徐州市徐州醫學院附屬醫院檢驗科江蘇221002 2.徐州市中心醫院檢驗科江蘇221002

徐萍萍，女，檢驗師

2015-12-05收稿，2016-01-19修回