陰溝腸桿菌耐藥表型與脈沖場(chǎng)凝膠電泳克隆分型相關(guān)性分析

縱帥　馬萍　牛國(guó)平　徐銀海　丁宸　徐萍萍

陰溝腸桿菌耐藥表型與脈沖場(chǎng)凝膠電泳克隆分型相關(guān)性分析

縱帥1馬萍1牛國(guó)平2徐銀海1丁宸2徐萍萍2

目的：研究ICU分離的7株陰溝腸桿菌菌株的耐藥表型與脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）克隆分型之間的相關(guān)性，明確臨床感染和流行狀況并為合理選用抗生素提供參考依據(jù)。方法：采用K-B法進(jìn)行臨床常用抗生素敏感性試驗(yàn)（AST），采用PFGE對(duì)7株陰溝腸桿菌進(jìn)行克隆分型。結(jié)果：菌株呈嚴(yán)重的多重耐藥特性；7株陰溝腸桿菌經(jīng)PFGE后分為四種不同來(lái)源的克隆型；相同來(lái)源和不同來(lái)源的陰溝腸桿菌克隆株間的耐藥譜均不完全相同。結(jié)論：AST 和PFGE分別在明晰陰溝腸桿菌治療藥物敏感性，臨床感染和流行狀況方面提供直觀依據(jù)，但耐藥表型和PFGE克隆型之間未發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性；應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果合理選用抗生素以減少或延緩強(qiáng)耐藥菌株的播散。

陰溝腸桿菌耐藥性脈沖場(chǎng)凝膠電泳克隆分型

陰溝腸桿菌是一種常見(jiàn)的條件致病菌，隨著抗生素的大量和不規(guī)范使用，近年已發(fā)展成為重要的醫(yī)院感染菌，常引起呼吸道、泌尿生殖道、皮膚軟組織以及血流等各種感染，由于其日趨嚴(yán)重的多重耐藥特性，使臨床抗生素治療面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。本文擬對(duì)ICU分離的7株陰溝腸桿菌進(jìn)行耐藥表型檢測(cè)和脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）克隆分型，分析二者之間是否存在明顯的相關(guān)性，明確耐藥性特點(diǎn)、臨床感染和流行狀況，為陰溝腸桿菌的抗生素治療和流行病學(xué)研究提供參考，現(xiàn)報(bào)告如下：

1　資料與方法

1.1標(biāo)本來(lái)源根據(jù)感染管理監(jiān)控提示ICU存在陰溝腸桿菌感染，及時(shí)采集ICU 8位不同患者和不同部位（位置）的48份標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)和分離，包括靜脈血、脂乳、導(dǎo)管尖端、床頭柜、呼吸機(jī)及周?chē)h(huán)境物品等。

1.2陰溝腸桿菌的培養(yǎng)、分離和鑒定按照《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第3版）嚴(yán)格進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)所用M-H瓊脂為英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品，VITEK-2Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀為法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品。

1.3抗生素敏感性試驗(yàn)（AST）藥敏試驗(yàn)采用美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）推薦的紙片擴(kuò)散法，按CLSI2014標(biāo)準(zhǔn)對(duì)分離純化后的菌株進(jìn)行18種臨床常用抗生素的耐藥性檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)采用的抗生素見(jiàn)表2，抗菌藥物紙片為英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品。

1.4脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）制備OD值在0.55～0.7之間的陰溝腸桿菌菌懸液，經(jīng)CSB裂解后制備膠塊，限制性?xún)?nèi)切酶Xba I 37℃水浴酶切18h，使用1.0%的Seakem Gold膠進(jìn)行脈沖場(chǎng)凝膠電泳克隆分型，在2.2L中0.5x TBE緩沖液平衡15min后開(kāi)始電泳。電泳時(shí)間：18h，脈沖切換時(shí)間：2.2s～54.2s，電壓：6V/cm，T=14℃。電泳完成后膠塊在0.5μg.ml-1的溴化乙錠（EB）染液中染色30min，凝膠成像儀成像。脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀和凝膠成像儀均為美國(guó)Bio-RAD產(chǎn)品。

1.5數(shù)據(jù)分析采用WHONET 5.6軟件進(jìn)行耐藥數(shù)據(jù)的處理和分析，Quantity One 4.6軟件進(jìn)行遺傳關(guān)系樹(shù)形圖的輸出和分析。

2　結(jié)果

2.1陰溝腸桿菌的分離來(lái)源及耐藥性結(jié)果經(jīng)培養(yǎng)和分離，從其中4位患者及周?chē)h(huán)境中鑒定出7株陰溝腸桿菌，其余4位患者未檢出陰溝腸桿菌，分離情況見(jiàn)表1。7株陰溝腸桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性結(jié)果見(jiàn)表2。

表1　7株陰溝腸桿菌的分離來(lái)源

表2　7株陰溝腸桿菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性

2.2PFGE克隆分型結(jié)果7株陰溝腸桿菌脈沖場(chǎng)凝膠電泳圖見(jiàn)圖1，其遺傳關(guān)系樹(shù)形圖見(jiàn)圖2。

圖1

圖2

3　討論

陰溝腸桿菌是能夠引起嚴(yán)重醫(yī)院感染的重要革蘭陰性致病菌，呈多重耐藥特性。美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心（CDC）在2010年首次確認(rèn)了本土含有I型新德里金屬β-內(nèi)酰胺酶（NDM-1）的陰溝腸桿菌［1］，由于含有NDM-1的細(xì)菌產(chǎn)生能一種特殊的β-內(nèi)酰胺酶，后者水解包括碳青霉烯類(lèi)在內(nèi)的幾乎所有的β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素，被稱(chēng)為“超級(jí)細(xì)菌”，因此，陰溝腸桿菌院內(nèi)感染的監(jiān)控和研究越來(lái)越受到重視。

3.1臨床感染和耐藥性分析本實(shí)驗(yàn)采集了ICU八位患者不同部位的48份標(biāo)本，每位患者均采集靜脈血、脂乳、導(dǎo)管尖端、床頭柜、被褥和床單等六個(gè)位置進(jìn)行培養(yǎng)，共培養(yǎng)出7株陰溝腸桿菌，患者甲、乙、丙和丁四人分離出病原菌，其余四位患者檢出其它病原菌或未檢出病原菌。其中患者丙的靜脈血、脂乳和導(dǎo)管尖端分別分離出三株陰溝腸桿菌，說(shuō)明該ICU病區(qū)患者感染情況嚴(yán)重（見(jiàn)表1）。AST結(jié)果顯示7株陰溝腸桿菌對(duì)常用抗生素存在不同程度的多重耐藥，與國(guó)內(nèi)相關(guān)報(bào)道相似［2］。其中，對(duì)頭孢唑啉、頭孢西丁和頭孢替坦全部耐藥，對(duì)厄他培南、亞胺培南和替加環(huán)素全部敏感。結(jié)合菌株分離情況和PFGE分型結(jié)果，患者丙不僅感染交叉現(xiàn)象，也存在嚴(yán)重耐藥情況，應(yīng)根據(jù)藥敏結(jié)果進(jìn)行積極的抗生素感染治療。

3.2PFGE克隆分型結(jié)果解讀分子分型有多種方法，PFGE仍是目前較為公認(rèn)的分子分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”，是分子流行病學(xué)中溯源研究的重要手段［3］。為明確患者的感染狀況及與耐藥性之間的關(guān)系，對(duì)分離的7株陰溝腸桿菌行PFGE分子分型。為方便觀察，我們根據(jù)初次PFGE結(jié)果進(jìn)行了二次實(shí)驗(yàn)（圖1），并利用QuantityOne軟件輸出了7株菌株之間的遺傳關(guān)系樹(shù)形圖（圖2）。參照Tenover FC等［4］提出的PFGE條帶解釋標(biāo)準(zhǔn)和目前研究成果，通常將相似度80%以上的菌株認(rèn)為是來(lái)源于同一克隆株，而相似度低于50%的菌株則被認(rèn)為克隆來(lái)源不同，其流行病學(xué)不相關(guān)；或者根據(jù)有1～3條條帶不同可認(rèn)為是同一克隆，4～6條不同為可能相關(guān)，7條及以上不同為不相關(guān)的分型標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)根據(jù)上述兩條標(biāo)準(zhǔn)分型結(jié)果相同，顯示7株陰溝腸桿菌被分為四種不同來(lái)源的克隆型，其中1、2、3和4號(hào)菌株被認(rèn)為來(lái)源于同一克隆，5、6和7號(hào)菌株克隆來(lái)源各不相同，表明該ICU陰溝腸桿菌已爆發(fā)流行，且存在嚴(yán)重的感染交叉情況，應(yīng)采取相應(yīng)措施控制菌株的播散。

3.3PFGE克隆分型與耐藥表型相關(guān)性分析根據(jù)PFGE分型結(jié)果對(duì)比各克隆型菌株間的耐藥譜，結(jié)果顯示相同克隆來(lái)源株中1號(hào)和4號(hào)菌株耐藥譜完全相同，2號(hào)、3號(hào)與前兩株的耐藥譜不完全相同；不同克隆來(lái)源株中5、6、7號(hào)菌株的耐藥譜不同；2號(hào)和7號(hào)兩個(gè)不同克隆來(lái)源菌株間的耐藥譜則完全相同，提示菌株的克隆來(lái)源和耐藥性之間未發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性，PFGE分型結(jié)果不能用于菌株耐藥表型的預(yù)測(cè)，耐藥表型也不能用于克隆株的流行病學(xué)預(yù)測(cè)。其它菌株的研究也得出了相似結(jié)論［5～6］。其產(chǎn)生機(jī)制目前國(guó)內(nèi)相關(guān)研究較少，作者推測(cè)可能與克隆株在增殖播散的過(guò)程中耐藥基因的獲取、丟失或水平傳播等基因突變有關(guān)，也與PFGE分型主要針對(duì)細(xì)菌或質(zhì)粒的整個(gè)基因組，并不能完全反映耐藥株的耐藥基因和其它基因特征有關(guān)［6］。我們將依據(jù)此次結(jié)果，進(jìn)一步擴(kuò)大菌株數(shù)量，利用PCR檢測(cè)相同克隆株和不同克隆株的耐藥基因并分析它們之間的差異，以探明本文所述現(xiàn)象的產(chǎn)生機(jī)制。

1Centers for Disease Control and Prevention（CDC）. DetectionofEnterobacteriaceaeisolatescarrying metallo-beta-lactamase-UnitedStates，2010［J］. MMWR.Morb.Mortal.Wkly.Rep，2010，59（24）：750.

2陳峰，李維春，張克昌.新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房血培養(yǎng)122株病原菌分布及耐藥性分析［J］.安徽衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，11（2）：72～73.

3Zheng J，Keys CE，Zhao S，et al.Simultaneous analysis of multiple enzymes increases accuracy of pulsed-field gel electrophoresis in assigning genetic relationships among homogeneous Salmonella strains ［J］.Journal of clinical microbiology，2011，49（1）：85～94.

4Tenover FC，Arbeit RD，Goering RV，et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis：criteria for bacterial strain typing［J］.Journal of clinical microbiology，1995，33（9）：2233～2239.

5王迪，張曉嬡，陳倩，等.北京市食源性金黃色葡萄球菌耐藥及分子分型研究［J］.中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2014，26（5）：428～434.

6金輝，徐小敏，糜祖煌，等.鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥基因分型與脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型的比較［J］.環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2010，27（4）：219～221.

/（編審：徐元宏）

Analysis of the correlation between antibiotic resistance and pulsed-field gel electrophoresis clonal typing of Enterobacter cloacae

1.Affiliated Hospital，Xuzhou Medical University，Xuzhou 221003，Jiangsu
2.Xuzhou Central Hospital，Xuzhou，221003，Jiangsu
ZONG Shuai1，MA Ping1，NIU Guo-ping2，et al

Objective:OBJECTIVE To student on the relationship between antibiotic resistance and pulsed-field gel electrophoresis（PFGE）clonal typing of seven strains of Enterobacter cloacae isolated from ICU，make clear the clinical infection and prevalence status，and provide a scientific reference for selection of antibiotics.Methods:The antibiotics susceptibility tests（AST）were performed by the disk diffusion test，and the molecular typing of seven strains was tested by PFGE.Results:AST showed character of multiple antibiotic resistance，seven strains of Enterobacter cloacae were classified into four kinds of different clones，and the drug resistant spectrum was not identical between same clonal isolates and different clonal isolates.Conclusion:AST and PFGE clonal typing could provide evidence directly in drug resistant spectrum and nosocomial infection and prevalence status，but there was no obvious correlation between drug resistant and clonotypes.Antibiotics should be selected reasonably based on AST so as to reduce or delay strong resistant strains to spread out.

Enterobacter cloacae；Drug resistance；PFGE；Clonal typing

R331【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

1671－8054（2016）01-0099-03

1.徐州市徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科江蘇221002 2.徐州市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科江蘇221002

徐萍萍，女，檢驗(yàn)師

2015-12-05收稿，2016-01-19修回