擬南芥硫苷生物合成相關基因的組織和脅迫誘導表達譜的全基因組分析

杜 海，冉 鳳，劉 靜，文 婧，馬珊珊，柯蘊倬，孫麗萍，李加納

（西南大學農學與生物科技學院，重慶400715）

擬南芥硫苷生物合成相關基因的組織和脅迫誘導表達譜的全基因組分析

杜 海，冉 鳳，劉 靜，文 婧，馬珊珊，柯蘊倬，孫麗萍，李加納

（西南大學農學與生物科技學院，重慶400715）

【目的】分析擬南芥中硫代葡萄糖苷（Glucosinolatcs，簡稱硫苷）生物合成相關基因在不同組織器官、不同發育時期及不同生物和非生物脅迫處理條件下的表達譜，為篩選控制硫苷合成的關鍵基因、解析硫苷的生物合成規律及其在植物抗逆脅迫過程中的作用奠定基礎。【方法】利用AtGenExpress和PLEXdb中的10組表達譜芯片數據和2組轉錄組數據分析擬南芥中硫苷生物合成途徑82個結構基因和調控基因的時空表達特性及其受生物和非生物脅迫的表達模式；采用Real-time PCR技術對10個硫苷合成途徑的關鍵結構基因和調控基因的表達譜進行驗證；并利用STRING v10軟件分析硫苷生物合成途徑相關基因的表達模式的相關性。【結果】組織表達特性分析結果表明，擬南芥硫苷生物合成相關基因在營養器官和生殖器官中的表達模式差異較大，相關基因在營養器官中具有較高的表達量，在生殖器官中的表達量則較低，表明硫苷主要在營養組織中合成；其中脂肪族硫苷合成相關基因在莖、葉等地上營養組織中的表達量較高，而吲哚族硫苷合成相關基因則在根、莖、葉等地上和地下組織中均有較高的表達，且基因在同一組織的不同發育時期的表達量通常具有差異，表明基因的表達還具有時空特異性；熒光定量PCR分析結果證明10個硫苷合成途徑代表基因的表達譜與芯片數據的結果保持一致；脅迫表達分析結果表明，脂肪族和吲哚族硫苷合成相關基因的表達均受到部分生物和非生物脅迫因子的誘導表達，其中吲哚族硫苷合成相關基因更易受到丁香假單胞桿菌（Pseudomonas syringae）、甘藍鏈格孢菌（Alternaria brassicicola）、桃蚜（Myzus persicae）等生物和低溫（4℃）、高鹽、高溫（38℃）等非生物脅迫因子的誘導表達；共表達分析結果表明，脂肪族和吲哚族硫苷合成分支途徑內相關調控基因與結構基因的表達模式的相關性較高。【結論】擬南芥硫苷生物合成相關基因主要在營養組織中高表達，在種子中低表達；植物中存在一個硫苷轉運系統，負責將營養組織中合成的硫苷轉運到種子中貯藏；硫苷合成相關基因的表達受到病原菌、蟲害、高溫等逆境因子的影響，其中吲哚族硫苷合成相關基因更易受到生物和非生物脅迫因子的誘導表達，說明吲哚族硫苷可能對植物抗性更為重要。

擬南芥；硫苷；表達模式；發育時期；生物脅迫；非生物脅迫；實時熒光定量PCR

0 引言

【研究意義】硫代葡萄糖苷（glucosinolatcs，簡稱硫苷）是一類含氮、含硫的植物次生代謝產物［1］，廣泛存在于食用油料作物、蔬菜和擬南芥等十字花科植物中，是該科植物產生的一類重要次生代謝產物［2-3］，其降解產物具有多種生物學功能［4-5］。例如，硫苷降解產物異硫氰酸酯類（isothiocyanates，ITCs）、硫氰酸酯類（thiocyanates，TCs）、腈類（nitrilcs）、惡唑烷酮類（oxazolidinones，ODs）等具有較強的防腐和抗菌作用，可作為殺蟲劑、殺菌劑、抗微生物制劑和天然的生物熏蒸消毒劑［6-7］；硫苷具有芳香或刺激性氣味，既可作為十字花科專食性昆蟲（crucifer specialists）的引誘劑，刺激或抑制某些昆蟲產卵與攝食［8］，又可作為雜食性昆蟲（generalist herbivores）的驅散劑［9］；同時硫苷還賦予食物特殊的風味，如蘿卜、甘藍等的辛辣味［10］；蘿卜硫素則被證明是迄今發現的抗癌活性最強的植物活性物質，可預防前列腺癌、肺癌、食道癌等［10-11］。可見，硫苷及其降解產物對植物抗性和人類健康具有重要作用。擬南芥是重要的十字花科模式植物，相對于其他植物，具有較為完整的基因組信息和豐富的表達譜芯片數據資源。因此，在擬南芥中對硫苷的動態合成規律展開系統研究，不僅具有重要的理論研究意義，還可以為進一步在油菜、白菜等作物中開展相關研究提供重要的參考。【前人研究進展】硫苷類化合物均由β-D-硫葡萄糖基、硫化肟基團以及來源于氨基酸的側鏈R基組成。通常根據側鏈R基的來源將硫苷分為脂肪族硫苷、吲哚族硫苷和芳香族硫苷三大類［12］。目前硫苷生物合成途徑較清楚，主要酶基因均已被證實［13］。硫苷的生物合成途徑大致可以分為前體氨基酸側鏈延長、核心結構合成和次級修飾3個主要階段［14］。其中，核心結構合成過程是所有硫苷合成的共同部分。核心結構形成后再經羧基化、甲基化、葡萄糖基化等次級修飾形成不同的硫苷類化合物。硫苷側鏈修飾具有重要的作用，硫苷及其降解產物的理化性質很大程度上取決于硫苷的側鏈結構［15］。近年來，硫苷調控機理方面的研究也取得了一定的進展，bHLH、Dof和MYB類轉錄因子均被證實參與調控硫苷的生物合成［15-19］。其中，MYB類轉錄因子對硫苷的生物合成尤為重要［15-16，20-22］。【本研究切入點】雖然硫苷的生物合成和調控途徑研究較清楚，但是對其合成規律、生物學功能仍缺乏系統的研究。鑒于硫苷的含量在不同材料和組織、不同發育時期和環境下均不同［3，23］，因此，研究硫苷合成相關基因的表達模式的動態變化規律，將有助于揭示硫苷的生物合成和代謝規律、篩選控制硫苷合成或調控的關鍵基因。【擬解決的關鍵問題】本研究基于AtGenExpress［24-25］和 PLEXdb［26］中的表達譜數據，結合Real-time PCR技術，在全基因組水平對擬南芥硫苷生物合成途徑主要酶基因和調控基因的時空表達特性和脅迫誘導表達譜進行了系統的研究，以解析不同硫苷組分的生物合成規律和脅迫誘導表達模式。

1 材料與方法

1.1硫苷生物合成相關基因的組織表達特性分析

本研究分析的硫苷生物合成相關基因如表 1所示。擬南芥組織表達譜芯片數據來源于AtGenExpress （http：//www.weigelworld.org/resources/microarray/ AtGenExpress），共包含不同發育時期的79個組織或器官［24］。均一化的芯片數據利用Cluster v3.0軟件［27］采用層級聚類法分析基因的表達譜，并用 Java TreeView軟件［27］圖形化基因表達譜熱力圖（heatmaps）。擬南芥哥倫比亞野生型（Arabidopsis thaliana ecotype Columbia-0）種子購自于 ARBC（擬南芥種質資源中心），由重慶市油菜工程研究中心實驗室保存。2016 年1月進行組培室種植，培養條件為16 h光照/8 h黑暗，晝夜溫度 22℃/18℃，相對濕度 70%。分別于苗期和花期取植株的根、莖、葉、花和種子等組織，液氮中速凍，-80℃保存備用。

1.2硫苷生物合成相關基因的脅迫誘導表達譜分析

擬南芥生物（病原菌和蟲害）和非生物（激素和環境因子）脅迫誘導的基因芯片數據來自于AtGenExpress［25］和植物表達譜數據庫（plant expression database， PLEXdb）［26］。所采用的9組芯片數據的編號分別為GSE5525（AT49）、GSE5640（AT50）、GSE5684 （AT51）、AT59、GSE6516（AT63）、GSE17193 （AT84）、GSE18960（AT90）、GSE20188（AT110）和GSE24552（AT112）。病原菌和蟲害芯片數據的試驗處理詳見PLEXdb數據庫中相關芯片數據的試驗設計（http：//www.plexdb.org/plex.php？database= Arabidopsis）［26，28-30］；激素和環境因子脅迫誘導芯片數據的實驗處理詳見AtGenExpress［24-25］。所有芯片數據均為已進行標準化處理的數據。

表1　擬南芥硫苷生物合成相關基因Table 1 Glucosinolate biosynthetic genes in Arabidopsis

續表1 Continued table 1

續表1 Continued table 1

根據擬南芥芯片信息，共找到78個探針，分別對應78個基因。由于高度同源，有4個探針對應2個基因（IPMDH1和IPMDH3，CYP79F1和CYP79F2），有2個基因（TSB1和NIT1）沒有找到對應的探針。芯片數據用 Cluster v3.0軟件進行層級聚類法分析相關基因的表達譜［27］，并利用Java TreeView軟件可視化相應的表達譜熱力圖（heatmaps）［31］。利用STRING v10 （http：//string-db.org/newstring_cgi/show_input_page.pl？UserId=JnIkwsVs3Jb_&sessionId=U_KvLy4CMUs4）［32］軟件分析硫苷生物合成相關基因的共表達和互作調控網絡圖。

1.3試劑、藥品和儀器

植物RNApure超純總RNA快速提取試劑盒購自于北京博邁德基因技術有限公司；RQ1 RNase-Free DNase購于美國 Promega公司；反轉錄試劑盒（PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit）購于TaKaRa公司；實時熒光定量PCR試劑盒（SsoAdvanced Universal超混合液）、耗材和儀器（CFX96 Touch）均購于BIO-RAD公司。

1.4實時熒光定量PCR分析

按照RNApure超純總RNA快速提取試劑盒的操作說明分別提取野生型擬南芥根、莖、葉、花、角果和成熟種子的總RNA；經DNaseⅠ（RQ1）處理去除總RNA中殘留的痕量基因組DNA；根據TaKaRa公司的反轉錄試劑盒說明書進行第一鏈cDNA的合成。使用SsoAdvanced Universal Mix（SYBR Green）試劑盒和BIO-RAD公司的CFX96 Touch熒光定量PCR儀進行Real-time PCR（qPCR）擴增。以反轉錄獲得的cDNA為模板，以擬南芥Actin 7（AT5G09810.1）為內標基因，分別用10個硫苷合成相關基因的特異引物（表2）進行qPCR擴增。采用2步法反應程序，95℃5 min；95℃ 15 s，58℃ 20 s，40個循環；繪制熔解曲線。設3次重復，取平均值，采用2-ΔΔCt法計算基因在不同樣品中的相對表達量。

表2　擬南芥硫苷生物合成途徑10個代表基因的qPCR引物Table 2 Primers of 10 representive genes involved in glucosinalate biosynthesis pathway in Arabidopsis

2 結果

2.1硫苷生物合成相關基因的組織表達特性

對硫苷生物合成和分解途徑的70個酶基因和12個調控基因（表1）在擬南芥不同發育時期79個組織或器官中的組織表達特性分析結果表明（圖 1），大部分基因在不同組織和器官中的表達模式不同，且硫苷合成相關基因在根、莖、葉等營養組織中的表達量較高，在花和種子中的表達量普遍較低，說明硫苷可能主要在營養器官中合成。其中，脂肪族硫苷合成相關基因在莖、葉等地上營養器官中的表達量明顯高于根中的表達量；吲哚族硫苷合成相關基因則在根、莖和葉中有較高的表達量，推測脂肪族硫苷主要在地上營養組織中合成，而吲哚族硫苷在地下和地上營養組織中均有合成。另外，同一基因在相同組織和器官不同發育時期的表達量通常有一定的差異，說明相關基因的表達可能具有時期特異性。

圖1　擬南芥硫苷代謝途徑相關基因表達譜Fig. 1Ex pression analysis of glucosinolate biosy nthetic genes in Arabidopsis

脂肪族硫苷氨基酸側鏈延伸基因MAM1在地上營養組織中的表達量較高，MAM3在根中的表達量較高；次級結構修飾基因FMOGSL-OX1、FMOGSL-OX3和FMOGSL-OX5在地上組織中的表達量較高，FMOGSLOX2在花中的表達量較高，FMOGSL-OX4則在根中的表達量較高。而吲哚族硫苷側鏈修飾相關基因（CYP81F2、CYP81F3、CYP81F4、IGMT1和IGMT2）在根中的表達量較高。說明脂肪族硫苷的結構修飾可能在植物發育不同時期和組織中均有發生，而吲哚族硫苷的結構修飾可能主要發生在根中。

此外，脂肪族硫苷合成的調控基因 MYB28和MYB29的表達量較高，且與脂肪族硫苷合成途徑酶基因的表達模式相似，而MYB76的表達量較低，說明該基因的功能可能相對較弱。同理，吲哚族硫苷合成的調控基因 MYB34和 MYB51的表達量相對較高，而MYB122的表達量則較低。其中MYB34在根和地上組織中均表達，而MYB51主要在地上組織中表達，表明MYB34調控地上和地下組織中硫苷的合成，而MYB51主要調控地上組織中硫苷的合成。在硫苷降解途徑中，黑芥子酶基因TGG4在根中的表達量較高，PEN2和PEN3在大部分營養組織中的表達量較高，NSP2則在種子中的表達量較高（圖 1），說明不同硫苷降解酶基因在植物防御系統中可能負責相應組織中硫苷的水解過程。

為驗證芯片數據的分析結果，選擇10個分別參與脂肪族和吲哚族硫苷合成（包括前體氨基酸側鏈延長、核心結構合成和次級修飾3個階段）（表1和表2）及調控的關鍵基因，采用qPCR法分析它們在擬南芥中的表達模式。結果表明，10個硫苷合成相關基因在營養組織中的表達量較高，在種子組織中的表達量則較低。其中，脂肪族硫苷合成相關基因MAM1、AOP2、CYP79F1、CYP83A1和MYB28主要在莖、葉或角果中優勢表達，在根、花和種子中的表達量相對較低；吲哚族硫苷合成相關基因IGMT1、ASA1、CYP83B1、CYP79B2和MYB34在根、莖或葉中的表達量較高，在角果、花和種子中的表達量則相對較低（圖 2）。qPCR法分析的結果與芯片數據分析的結果一致性較好，均證明脂肪族硫苷合成相關基因主要在地上營養組織中表達，而吲哚族硫苷合成相關基因在地上和地下營養組織中均有較高的表達水平。僅AOP2、ASA1 和MYB34的表達量略有差異，但是兩組數據的總體表達模式仍一致。例如，AOP2在芯片數據的葉、莖和花器官中均有較高的表達量，在qPCR數據的葉和莖中也具有較高的表達量，但是在花中的表達量則相對較低（圖1和圖2）。這是因為兩組數據的取樣時期和組織不同所致，該基因在芯片數據的花中的表達量通常也較低，僅在特定時期的花器官中具有相對較高的表達量（圖1）。

2.2硫苷生物合成相關基因受生物脅迫的表達譜

對硫苷生物合成相關基因在9組生物脅迫芯片數據（AT49、AT50、AT51、AT59、AT63、AT84、AT90、AT110和AT112）中的表達譜分析結果表明，硫苷生物合成途徑部分酶基因的表達明顯受到病原細菌、真菌和蟲害的脅迫誘導（圖3）。在4組病原菌脅迫數據中，硫苷合成和降解相關基因明顯受到細菌性病原菌的抑制表達。其中，假單胞桿菌Pseudomonas G62 （AT112）浸染植株后，多數硫苷合成相關基因的表達受到抑制，僅有部分下游基因的表達未受影響（如MVP1、NSP2、NSP5、PEN3、BZO1、CHY1、TGG2 和GSH1）。在丁香假單胞桿菌（Pseudomonas syringae）的脅迫下，除了部分次級修飾基因（FMOGS-OX2、FMOGS-OX4、FMOGS-OX5和GS-OH），脂肪族硫苷合成相關基因的表達量較低，而吲哚族硫苷合成和降解相關基因的表達量增加（圖 3）。說明脂肪族硫苷合成相關基因的表達受到該病原菌的抑制，吲哚族硫苷合成相關基因的表達受到誘導。

在真菌脅迫數據中，僅木霉菌（Trichoderma spp，AT50）能夠同時誘導脂肪族和吲哚族硫苷合成相關基因上調表達，其他真菌脅迫下脂肪族和吲哚族硫苷合成相關基因的表達模式通常相反（圖 3）。例如，當植株受到灰霉病菌（Botrytis cinerea）、甘藍鏈格孢菌（Alternaria brassicicola）和白粉菌（Erysiphe orontii）（AT51）侵染后，多數脂肪族硫苷合成相關基因的表達受到抑制，而吲哚族硫苷合成和降解相關基因的表達受到誘導。相似地，疫霉菌（Phytophthora）侵染擬南芥葉片后，吲哚族硫苷合成相關基因的表達量迅速增加，脂肪族硫苷合成相關基因的表達量則較低。但隨著浸染時間的增加，吲哚族硫苷合成相關基因的表達量隨之下降，而脂肪族硫苷合成相關基因的表達量則上升。此外，發現部分脂肪族和多數吲哚族硫苷合成相關基因的表達還受到殼聚糖的誘導（AT84）。以上結果表明，吲哚族硫苷合成相關基因的表達更容易受到病原菌的誘導。

通過對多組抗蟲芯片數據的分析發現，脂肪族硫苷合成和降解相關基因的表達受到菜青蟲的脅迫誘導，而吲哚族硫苷合成和降解相關基因的表達明顯受到西花薊馬、桃蚜（Myzus persicae，AT49）和粉虱（AT63）的脅迫誘導（圖3）。說明不同硫苷組分的抗蟲害作用可能不同，其中吲哚族硫苷可能對粉虱、西花薊馬和桃蚜有一定的防御作用。此外，本研究發現水楊酸（salicylic acid，SA）能夠誘導吲哚硫苷合成途徑大部分基因高表達（圖 3），說明吲哚族硫苷在植物防御系統中的作用依賴SA信號途徑。

圖2　硫苷合成相關基因在擬南芥中的表達模式Fig. 2 Expression patterns analyses of glucosinolate biosynthesis genes in Arabidopsis by qPCR

圖3　擬南芥硫苷生物合成基因受病、蟲害脅迫誘導的表達譜Fig. 3 The expression profiles of Arabidopsis glucosinolates biosynthesis genes induced by pathogen and insect stresses

2.3硫苷生物合成相關基因受非生物脅迫誘導的表達譜

如圖4所示，脂肪族硫苷合成相關基因主要在地上組織中表達，吲哚族硫苷合成相關基因主要在根中表達，僅有少數基因在懸浮細胞中表達，說明硫苷主要在地上和地下組織中合成。而且大部分上游基因（包括吲哚族和脂肪族）在地上組織和根中的表達受到多種非生物環境因子的脅迫誘導。例如，脂肪族硫苷合成上游基因BCAT4、LeuD1、LeuD2、BAT5、ST5b、GSTF11和IPMDH3在地上組織和根中的表達均受到低溫（4℃）、滲透脅迫、高鹽、UV-B和高溫（38℃）的抑制，但是受到干旱和傷害的誘導而上升，說明這些環境因子對脂肪族硫苷的合成有影響。同理，UGT74B1、GSTF9、CYP79B2、CYP79B3、CYP81B1等基因在地上組織中的表達量較低，但是在根中的表達量相對較高且明顯受到低溫、高鹽、滲透脅迫和高溫的抑制，證明吲哚族硫苷的合成受到這些非生物因子的脅迫誘導。

但是，次級修飾和降解相關基因沒有明顯受到上述非生物脅迫因子的誘導表達（圖 4）。其中，脂肪族硫苷次級修飾相關基因（FMOGS-OX1和FMOGS-OX1-3）在地上組織中有較高的表達水平，而吲哚族硫苷次級修飾相關基因（CYP81F1-4、IGMT1 和IGMT1）在根中有較高的表達水平。同理，硫苷降解酶基因（TGG2、TGG4、PEN2和MBP1）和調控基因（MYB29、MYB76、MYB51、MYB122和bHLH05）在地上組織和根中也具有相對較高的表達量（圖4）。以上結果進一步證明脂肪族和吲哚族硫苷可能分別在地上和地下組織中合成，并與相應的黑芥子酶基因組成一個緊密的防御體系，通過響應相關因子的脅迫信號來調控硫苷的合成以抵御植株受到的非生物逆境脅迫。

2.4硫苷生物合成相關基因受激素誘導的表達模式

如圖 5所示，經過吲哚乙酸（IAA）和脫落酸（ABA）處理3 h后硫苷合成相關基因的表達量明顯降低，說明它們對硫苷合成可能具有抑制作用。經過生長素極性運輸抑制劑（2，4，6T、PCIB、TIBA 和NPA）處理后，大部分硫苷合成相關基因的表達量無明顯變化，說明生長素在低水平時對硫苷合成沒有影響，但是積累到較高濃度時則會抑制硫苷的合成。經過油菜素內酯（brassinolide，BL）、乙烯合成酶 （1-aminocycropro-pane-1-carboxylic acid，ACC）、玉米素（zeatin）、GA和茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MJ）處理后，脂肪族硫苷合成相關基因的表達量沒有明顯的變化，少數吲哚族硫苷合成相關基因的表達量增加，表明這些激素對硫苷生物合成的影響相對較低。但是經過乙烯抑制因子AgNO3處理后，部分吲哚族硫苷合成相關基因（例如 ST5a、UGT74B1、ASA1、CYP81F2、MYB51和MYB122）的表達量明顯增加，表明內源性乙烯可能對吲哚族硫苷的合成具有調控作用。GA和BR抑制因子對硫苷合成相關基因的表達沒有明顯的影響，并且GA和BR信號通路關鍵突變體gal-3、gal-5和det2-1中硫苷合成相關基因的表達量也無明顯變化（圖 5），說明這兩種激素對硫苷的生物合成沒有影響。

此外，大多數脂肪族硫苷合成相關基因在植株缺硫24 h后表達量明顯降低，而吲哚族硫苷合成相關基因的表達量無明顯的變化，說明硫對脂肪族硫苷的生物合成具有重要的作用（圖 5）。還發現部分硫苷合成相關基因（例如CYP79B2、MYB51和TGG2）在22℃時的表達水平比 4℃時高，說明溫度對硫苷的生物合成也有影響（圖5）。

2.5硫苷生物合成途徑的互作調控網絡

脂肪族和吲哚族硫苷代謝支路內相關基因的表達模式相關性較高（圖6）。MYB28轉錄因子基因的表達模式與 CYP79F1、CYP79F2、FMOG-OX3和UGT74C1酶基因的表達模式相關性較高，說明它們可能是 MYB28調控的下游靶基因。同理，MYB29與FMOG-OX1和AOP2的表達模式也非常相似，說明它們可能為MYB29的共調控基因。以上結果進一步證明MYB轉錄因子對硫苷生物合成具有重要的調控作用，且存在共調控機制。

3 討論

圖4　硫苷生物合成相關基因受非生物脅迫誘導的表達情況Fig. 4 Expression patterns of Arabidopsis glucosinolate genes under abiotic stresses

圖5　硫苷生物合成相關基因受激素誘導的表達情況Fig. 5 Expression analysis of Arabidopsis glucosinolate biosynthetic genes under hormone inductions

硫苷廣泛分布于十字花科植物的不同組織中，同一植物不同組織、不同生育期硫苷的組分和含量差異很大，具有動態變化的特征。通常，種子中硫苷的含量明顯高于其他組織和器官。例如，甘藍型油菜種子中硫苷的含量高達180 μmol·g-1，而葉片中硫苷的含量一般只有10—20 μmol·g-1［33］。但是種子自身合成硫苷的量卻較少，說明植物體內存在一個將“源”組織和器官中合成的硫苷運輸到“庫”（種子）中的轉運系統。該轉運系統最近已經得到試驗證實［34-36］。本研究基于大量芯片數據，系統分析了硫苷合成、降解、調控等82個相關基因在擬南芥79個不同發育時期和組織中的時空表達特性（圖 1）。結果顯示硫苷合成相關基因在營養器官中高表達，在貯藏器官中低表達，證實了植物體內確實存在一個硫苷的轉運系統，負責將營養組織中合成的硫苷轉運到種子組織中積累。此外，硫苷代謝途徑中同源基因的表達模式相似，但有一定的差別，說明同源基因間存在部分功能冗余。

圖6　擬南芥硫苷生物合成途徑相關基因的共表達網絡Fig. 6 The connection network of Arabidopsis glucosinolate biosynthesis genes

前人研究證明，R2R3-MYB類轉錄因子對吲哚族和脂肪族硫苷的生物合成具有重要的調控作用［14-16］。在擬南芥中有6個2R-MYB基因參與調控硫苷的生物合成（MYB28、MYB29、MYB34、MYB51、MYB76和 MYB122）。其中，MYB28、MYB29和MYB67調控脂肪族硫苷的生物合成，MYB28為主效基因［37-38］；而MYB34、MYB51和MYB122調控吲哚族硫苷的生物合成，MYB34為主效基因［16，39］。本研究表達譜分析結果表明，脂肪族硫苷合成的MYB調控基因和酶基因主要在地上部分營養組織中表達，而吲哚族硫苷合成的MYB調控基因和酶基因在地下和地上部分營養組織中均有表達（圖1）。共表達分析結果表明，MYB調控基因與硫苷合成途徑酶基因的表達模式相關性較高（圖6）。例如，MYB28與CYP79F1、FMOG-OX3、UGT74C1和CYP79F1酶基因的表達模式相關性較高，說明它們可能是 MYB28調控的下游靶基因。其中，CYP79F1和CYP79F2已經被證明是MYB28的靶基因［15］，證明本研究結果的準確性。以上結果表明，調控基因和結構基因共同組成了一個復雜而精細的代謝調控網絡，實現對硫苷生物合成的精細調控。

硫苷作為十字花科植物特有的一類次生代謝產物，其降解產物具有多種生化活性，對植物的防御系統和動物的健康均非常重要［2-7］。在生產中，硫苷及其降解產物具有雙重作用。例如在油菜生產中，一方面硫苷的降解產物是菜籽餅粕中主要的抗營養因子，嚴重影響其作為動物飼料的食用安全性和適口性，限制了菜籽餅粕蛋白質資源的開發利用，同時也不利于油菜作為飼草或油-菜兼用的開發應用。另一方面，硫苷又對油菜的抗性和營養保健功能有重要作用，具有較強的防腐和抗菌作用，可作為殺蟲劑、殺菌劑、抗微生物制劑和天然的生物熏蒸消毒劑等［40-42］。在植物的防御體系中完整的硫苷并不具有生物學活性，介導植物與昆蟲互作的主要是經黑芥子酶水解的硫苷降解物，二者構成了熟知的“芥子油彈（mustard oil bomb）”，在植物防御系統中起重要作用［43］。本研究通過分析擬南芥中硫苷合成相關基因在不同組織和時期、不同生物和非生物脅迫下的表達特性，發現大多數情況下硫苷降解和合成相關基因的表達模式相似（圖1），它們共同組成了一個緊密的生物防御體系，以抵御植株可能受到的逆境脅迫。硫苷降解相關基因在不同組織和時期、不同生物和非生物脅迫下的表達譜存在明顯的差異，表明降解酶基因受不同脅迫因子的誘導，進而產生相應的硫苷降解產物以抵御各種逆境脅迫。其中，吲哚族硫苷合成相關基因更易受病、蟲害的脅迫誘導表達（圖 3），推測該類物質是擬南芥中主要的化學防御物質，對其防御系統有重要的作用。另外，本研究還發現，部分基因的表達受到生物和非生物脅迫因子的共同誘導，例如脂肪族硫苷合成相關基因BCAT4、LeuD1、BAT5和吲哚族硫苷合成相關基因UGT74B1、CYP79B2、CYP81B1等同時受到生物和非生物的脅迫誘導表達（圖3和圖4）。

基因的表達模式對推斷基因功能、基因間互作等具有重要的作用。雖然因為轉錄后修飾等機制，導致基因的轉錄水平與其蛋白水平可能不完全一致，但是表達譜是基因表達為相應蛋白、行使其生物學功能的重要前提，可以為揭示基因的時空表達規律和功能提供重要的線索。本研究結果為進一步在蛋白水平揭示硫苷的合成和積累規律，并在具有重要農藝性狀的十字花科作物中開展相關研究提供了重要的參考。

4 結論

對擬南芥硫苷生物合成途徑 82個結構基因和調控基因的組織和生物及非生物脅迫誘導的表達譜進行系統的分析表明，硫苷合成相關基因主要在營養組織中高表達、在生殖器官中低表達。吲哚族硫苷生物合成相關基因的表達容易受到病原菌、蟲害、高溫等逆境脅迫的影響，并且硫苷合成途徑相關基因的表達模式具有較高的相關性。

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2.1 身體動作的呈現形式豐富成套動作層次感 動作軌跡，即指在做動作時，身體或身體某部分所移動的路線。包括：軌跡形狀（直線、曲線、弧線等）、軌跡方向（前后、左右、上下等6個基本方向及各種旋轉與環繞等）和軌跡幅度（長度、角度）[2]。運動員的運動軌跡與方向的多變將直接在視覺上留給裁判和觀眾第一印象，其必須以變化多樣且完整的方式利用整個地面區域，并創造出不同的模式[3]。

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（責任編輯 李莉）

Genome-Wide Expression Analysis of Glucosinolate Biosynthetic Genes in Arabidopsis Across Diverse
Tissues and Stresses Induction

DU Hai， RAN Feng， LIU Jing， WEN Jing， MA Shan-shan， KE Yun-zhuo， SUN Li-ping， LI Jia-na
（College of Agronomy and Biotechnology， Southwest University， Chongqing 400715）

【Objective】The aim of this study is to analyze the expression profiles of Arabidopsis glucosinolate biosynthetic genes in different tissues at different developmental stages and under various stress treatments， so as to facilitate the identification ofthe key genes involved in controlling glucosinolate biosynthesis and provide valuable information for exploring the metabolic mechanism of glucosinolate biosynthesis as well as their functions in plant defenses. 【Method】 The dynamic expression profiles of 82 glucosinolate biosynthetic structural genes and regulating genes across a wide range of developmental stages and biotic and abiotic stresses were examined， based on ten expression microarray data and two RNA-Seq data in PLEXdb and AtGenExpress database. The expression patterns of ten key structural genes and regulating genes involved in glucosinolate biosynthesis pathway were further confirmed by Real-time PCR method. The correlation of the expression patterns of glucosinolate biosynthesis related genes was analyzed by STRING v10 software. 【Result】 The expressions of candidate genes between vegetative and reproductive organs were significantly different， with the majority of the candidate genes have higher expression levels in vegetative organs and lower expression levels in reproductive organs， indicating glucosinolates were mainly synthesized in vegetative tissues. The aliphatic glucosinolate biosynthesis genes were preferential expressed in shoot， such as stems and leaves， while indolic glucosinolate related genes were highly expressed in both of root and shoot， such as roots， stems and leaves. Moreover， the expressions of genes in a given tissue at different developmental stages were generally distinct， implying a temporal and spatial expression pattern. Real-time PCR analyses revealed that the expression profiles of the ten representive glucosinolate biosynthetic genes kept consistent with the results of microarray data assay. Furthermore， the expressions of aliphatic and indolic glucosinolate biosynthesis genes were tend to be induced by many bio- and abio-stresses， whereas indolic glucosinolate biosynthesis related genes were obviously induced by bio- and abio-stresses， such as Pseudomonas syringae， Alternaria brassicicola， Myzus persicae， low temperature （4℃）， salt and high temperature （38℃）. In addition， co-expression analysis revealed that the expressions of regulating genes were highly correlated to those of metabolic genes in aliphatic or indolic glucosinolate biosynthesis pathway. 【Conclusion】 The glucosinolates biosynthesis genes were preferentially expressed in vegetative tissues， as compared to seed tissues. There is a transport system that is responsible for transporting glucosinolates that were synthesized in vegetative tissues to seed tissues. The expressions of indolic glucosinolate biosynthesis genes tend to be induced by bio- and abio-stresses， indicating indolic glucosinolates are more important for Arabidopsis defense.

Arabidopsis thaliana； glucosinolates； expression patterns； development stage； biotic stresses； abiotic stresses； realtime PCR

2016-03-09；接受日期：2016-05-20

國家自然科學基金（31471528）、國家“973”項目（2015CB150201）、國家博士后基金面上項目（2014M552297）、中央高校基本科研業務費專項資金（SWU113104，XDJK2014B035和2362015xk05）、國家級大學生創新創業訓練計劃（201510635026，201610635019）

聯系方式：杜海，Tel：1822348008；E-mail：haidu81@aliyun.com。通信作者李加納，Tel：13509496702；E-mail：ljn1950@swu.edu.cn